国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      一種高靈敏度的胱抑素c測(cè)定試劑盒的制作方法

      文檔序號(hào):6221443閱讀:350來(lái)源:國(guó)知局
      一種高靈敏度的胱抑素c測(cè)定試劑盒的制作方法
      【專利摘要】本發(fā)明提供一種納米膠乳微粒型的胱抑素C測(cè)定試劑盒,包括試劑R1和試劑R2。所述試劑R1為促進(jìn)抗體抗原特異性結(jié)合的反應(yīng)液;所述試劑R2為結(jié)合有抗人胱抑素C抗體的納米膠乳微粒的緩沖液。試劑R2的特征是通過(guò)將直徑為50~300nm的聚苯乙烯納米膠乳微粒與胱抑素C單克隆抗體或多克隆抗體偶聯(lián),得到不同粒徑和不同抗體的偶聯(lián)物。將不同粒徑和不同抗體的偶聯(lián)物按不同比例混合制成試劑R2,用于檢測(cè)人血清中的胱抑素C,可以提高本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)靈敏度和線性范圍。本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)靈敏度為0.01mg/L。
      【專利說(shuō)明】一種高靈敏度的胱抑素C測(cè)定試劑盒
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域,具體涉及一種納米膠乳微粒型的胱抑素C測(cè)定試劑盒。
      【背景技術(shù)】
      [0002]胱抑素C(Cystatin C)是一種低分子量、堿性非糖化蛋白質(zhì),分子量為13.3KD,由122個(gè)氨基酸殘基組成,可由機(jī)體所有有核細(xì)胞產(chǎn)生,產(chǎn)生率恒定。循環(huán)中的胱抑素C僅經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)而被清除,是一種反映腎小球?yàn)V過(guò)率變化的內(nèi)源性標(biāo)志物,并在近曲小管重吸收,但重吸收后被完全代謝分解,不返回血液。因此,血中濃度由腎小球?yàn)V過(guò)率決定,而不依賴任何外來(lái)因素,如性別、年齡、飲食的影響,是一種反映腎小球?yàn)V過(guò)率變化的理想同源性標(biāo)志物。傳統(tǒng)習(xí)慣中一般把尿素氮、肌酐作為常規(guī)腎功能的檢測(cè)項(xiàng)目,但因腎臟有強(qiáng)大的儲(chǔ)備能力和代償能力,在腎小球受損早期或輕度受損時(shí),血中尿素氮、肌酐仍可維持在正常水平,只有在嚴(yán)重腎小球損害,一般腎小球?yàn)V過(guò)率降低50 %以下時(shí),血清尿素氮、肌酐濃度才明顯升高。因此,胱抑素C是迄今為止能基本滿足腎小球?yàn)V過(guò)率的理想內(nèi)源性標(biāo)志物,是較血清尿素氮、肌酐具有更高敏感性和特異性的檢測(cè)指標(biāo),對(duì)于評(píng)價(jià)腎小球?yàn)V過(guò)率有非常重要的價(jià)值。
      [0003]檢測(cè)血清胱抑素C的方法主要采用免疫學(xué)方法,以酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、放身寸免疫測(cè)定法(radioimmunoassay,RIA)和顆粒增強(qiáng)透射免疫比池法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA)這幾種方法為主。ELISA方法雖然在臨床上使用了近二十年,但它依然存在一些致命缺點(diǎn),定量準(zhǔn)確性差、操作時(shí)間長(zhǎng)、自動(dòng)化程度低,一般只能用于定性檢測(cè)。RIA靈敏度高,但不穩(wěn)定,重復(fù)性比ELISA差,而且存在放射性污染的危險(xiǎn)。PETIA是近年來(lái)出現(xiàn)的一種較為穩(wěn)定、快速、準(zhǔn)確測(cè)定胱抑素C血清濃度的檢測(cè)方法。PETIA的基本原理是在高分子膠乳微粒的表面交聯(lián)單克隆抗體,當(dāng)交聯(lián)有抗體的微粒與抗原結(jié)合后,在短時(shí)間內(nèi)會(huì)迅速聚集在一起,改變了反應(yīng)液的透光性能。而且,反應(yīng)液透光性能(即吸光度)的改變與被測(cè)抗原的濃度有較強(qiáng)的相關(guān)性,即膠乳顆粒凝集越多,越會(huì)阻礙光線的透光性,反應(yīng)液的吸光度就越大,在一定范圍內(nèi)與被測(cè)抗原的濃度成正比。PETIA檢測(cè)方法反應(yīng)時(shí)間短,精密度好,檢測(cè)范圍寬,黃疸、溶血和脂血標(biāo)本均不受影響,易于自動(dòng)化,是目前使用非常廣泛的一種檢測(cè)方法,但該方法的檢測(cè)靈敏度還有待進(jìn)一步提聞。
      [0004]目前,PETIA檢測(cè)試劑所采用的膠乳顆粒多為惰性微粒、羧基化微粒及氨基化微粒。表面修飾的膠乳粒子與抗體的結(jié)合是通過(guò)其表面的羧基或氨基與抗體的氨基端共價(jià)結(jié)合,在微粒與抗體之間有一個(gè)橋聯(lián)化學(xué)臂,降低了位阻效應(yīng),不僅提高了抗體的結(jié)合率,而且還為抗體提供合適的三維空間立體結(jié)構(gòu),有效地保護(hù)了抗體與抗原結(jié)合的活性區(qū)域。國(guó)內(nèi)外已有多家公司提供納米級(jí)表面修飾的微粒粒子原料,并廣泛應(yīng)用于PETIA。這些廠家提供的粒子直徑在20nm?4μ m,可以作為多克隆抗體和單克隆抗體的載體。納米級(jí)粒子的推出解決了對(duì)單克隆抗體結(jié)合的能力不強(qiáng),臨床檢測(cè)的線性范圍窄,靈敏度低,干擾因素多,實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性差等問(wèn)題,大大促進(jìn)了免疫比濁法在臨床上的廣泛應(yīng)用。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是進(jìn)一步提高檢測(cè)血清中胱抑素C含量的分析靈敏度;提供一種特異性好,靈敏度高,精密度好,準(zhǔn)確度高的納米膠乳微粒型胱抑素C測(cè)定試劑盒。
      [0006]本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是:一種納米膠乳微粒型胱抑素C測(cè)定試劑盒,包括試劑Rl和試劑R2,其中試劑Rl和試劑R2的體積比為4.5: I。所述試劑Rl為促進(jìn)抗體抗原特異性結(jié)合的反應(yīng)液,組分包括:10?30mmol/L的緩沖液、0.01%?4% (w/v)的增乳劑、0.5%?2% (w/v)的穩(wěn)定劑、0.1% (w/v)的防腐劑;所述試劑R2為結(jié)合有抗人胱抑素C抗體納米膠乳微粒的緩沖液,組分包括:0.1 %?0.5% (w/v)標(biāo)記有抗人胱抑素C抗體的納米膠乳微粒、0.2%?2% (w/v)的穩(wěn)定劑、10?30mmol/L的緩沖液、
      0.1% (w/v)的防腐劑。
      [0007]所述緩沖液為三羥甲基氨基甲烷緩沖液、2-嗎啉乙橫酸(NES)緩沖溶液、磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液、羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)緩沖液和三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液中的一種或多種;所述緩沖液pH值為6?9。所述緩沖液可以為其他具有相似特征的緩沖液。
      [0008]所述增乳劑為聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇辛基苯基醚或吐溫20。增乳劑主要作用是可以增加抗體抗原的反應(yīng)速率。本發(fā)明所述的增乳劑優(yōu)選品種為聚乙二醇6000。
      [0009]所述防腐劑為疊氮化鈉、硫柳汞、苯酚中的一種或多種。本發(fā)明優(yōu)選品種為疊氮化鈉。
      [0010]所述穩(wěn)定劑為牛血清白蛋白、聚乙二醇6000、乙二胺四乙酸鈉中的一種或多種。
      [0011]所述抗人胱抑素C抗體為鼠抗人胱抑素C單克隆抗體或兔抗人胱抑素C多克隆抗體。
      [0012]所述標(biāo)記有抗人胱抑素C抗體的納米膠乳微粒的制備方法為:選擇不同粒徑的羧基化聚苯乙烯納米膠乳微粒,通過(guò)活化劑1-乙基-3-(3- 二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDAC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)活化微粒表面的羧基,生成活性酯,再與胱抑素C單克隆抗體或多克隆抗體上的伯氨基反應(yīng),形成共價(jià)鍵,完成偶聯(lián),制成不同粒徑的胱抑素C單克隆抗體或多克隆抗體納米膠乳微粒偶聯(lián)物。所述不同粒徑的羧基化聚苯乙烯納米膠乳微粒的直徑在50?300nm(為市售產(chǎn)品)。其中,小粒徑納米膠乳粒偶聯(lián)單克隆抗體,可提高檢測(cè)的線性范圍;大粒徑納米膠乳微粒偶聯(lián)多克隆抗體,可提高檢測(cè)靈敏度。
      [0013]本發(fā)明的原理:本發(fā)明利用交聯(lián)了抗體的納米膠乳微粒偶聯(lián)物,與相應(yīng)標(biāo)本中的抗原發(fā)生免疫反應(yīng)后,形成聚集顆粒,在一定波長(zhǎng)下,通過(guò)測(cè)定聚集物形成時(shí)所產(chǎn)生的濁度,即可測(cè)出標(biāo)本中被檢物的含量。進(jìn)一步的,所述本發(fā)明中,血清中的胱抑素C與交聯(lián)在納米膠乳微粒上的抗人胱抑素C抗體結(jié)合,產(chǎn)生抗體抗原反應(yīng),使納米膠乳微粒形成聚集,在546nm和700nm波長(zhǎng)處測(cè)定反應(yīng)物吸光度,通過(guò)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算出標(biāo)本中胱抑素C的含量。
      [0014]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,具有以下優(yōu)點(diǎn):[0015]1.本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到0.01mg/L,高于同類產(chǎn)品的分析靈敏度。是一種靈敏度高、特異性好、準(zhǔn)確性高、精密度好、穩(wěn)定性好的納米膠乳微粒型的胱抑素C測(cè)定試劑盒。
      [0016]2.本發(fā)明所涉及的納米膠乳微粒的粒徑在50?300nm ;將不同粒徑的微粒分別與胱抑素C單克隆抗體或胱抑素C多克隆抗體交聯(lián),可以形成多種粒徑的偶聯(lián)物;將不同粒徑、不同抗體的偶聯(lián)物按不同比例混合,可以拓寬胱抑素C測(cè)定試劑盒的線性范圍,提高檢測(cè)靈敏度。
      【專利附圖】

      【附圖說(shuō)明】
      [0017]圖1為本發(fā)明中6種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)血清樣本線性分析圖;
      [0018]圖2為本發(fā)明胱抑素C測(cè)定試劑盒的相關(guān)性分析圖。
      【具體實(shí)施方式】
      [0019]下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明,但本發(fā)明不僅僅局限于以下實(shí)施例。
      [0020]實(shí)施例1
      [0021]胱抑素C測(cè)定試劑盒的制備
      [0022]1.試劑Rl的制備
      [0023]在20mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中分別加入終濃度為2%聚乙二醇6000、
      0.1 %牛血清白蛋白、和0.1 %疊氮化鈉,充分混勻,用0.22 μ m濾膜過(guò)濾,制成試劑Rl。
      [0024]2.試劑R2的制備
      [0025]鼠抗人胱抑素C單克隆抗體和兔抗人胱抑素C多克隆抗體均委托專業(yè)公司按照常規(guī)方法制得,該抗體僅與人胱抑素C反應(yīng),與其他抗原無(wú)免疫交叉反應(yīng),效價(jià)能夠滿足本試
      驗(yàn)需要。
      [0026]在20mmol(pH6.1) NES緩沖溶液中加入EDAC =Sulfo-NHS:納米膠乳微粒(250nm或60nm),其質(zhì)量比為1: 0.6: 1,混勻后室溫旋轉(zhuǎn)搖床活化I小時(shí),17000rpm離心30min,用20mmol (pH6.1)的NES緩沖液洗滌3次,然后將微球懸于20mmol (pH6.1)的NES緩沖液中,制成微粒懸液。
      [0027]在250nm微粒懸液中加入質(zhì)量為納米膠乳微粒1/5重的胱抑素C多克隆抗體,在60nm微粒懸液中加入質(zhì)量為納米膠乳微粒1/5重的胱抑素C單克隆抗體,立即混勻,室溫旋轉(zhuǎn)搖床孵育2小時(shí)。然后分別加入lmol Tris-HCl緩沖液(pH9.0),使Tris-HCl緩沖液終濃度為0.lmol,室溫旋轉(zhuǎn)搖床孵育I小時(shí)。再分別加入終濃度為20mmol的Tris-HCl緩沖液(pH8.0),0.1 %牛血清白蛋白、0.1 %疊氮化鈉和0.03%聚乙二醇辛基苯基醚的封閉液,室溫旋轉(zhuǎn)搖床孵育20min。在2?1(TC條件下17000rpm離心30min,棄上清液,沉淀物分別用含終濃度為20mmol的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)、0.1%疊氮化鈉、0.03%聚乙二醇辛基苯基醚的洗滌液重懸,再離心,如此洗滌3次,制成250nm微粒交聯(lián)胱抑素C多克隆抗體偶聯(lián)物和60nm微粒交聯(lián)胱抑素C單克隆抗體偶聯(lián)物。用含0.1%牛血清白蛋白、0.1%疊氮化鈉和20mmol的Tris-HCl (pH8.0)緩沖液分別重懸偶聯(lián)物,使其終濃度為0.25% (W/V),再以I: 3體積比混合,制成試劑R2。
      [0028]實(shí)施例2[0029]胱抑素C測(cè)定試劑盒的性能試驗(yàn)
      [0030]試驗(yàn)分析方法:兩點(diǎn)終點(diǎn)法。取試劑R1180ul,加入樣本2ul,于37°C 5min后加入試劑R240ul,開(kāi)始讀點(diǎn),反應(yīng)5min,再次讀點(diǎn),得到吸光度差值(Λ A)。
      [0031]檢測(cè)儀器:日立7180型自動(dòng)分析儀。
      [0032]檢測(cè)波長(zhǎng):主波長(zhǎng)為546nm,副波長(zhǎng)為700nm。
      [0033]1.靈敏度試驗(yàn)
      [0034]檢測(cè)20次水,記錄吸光度差值(Λ A水),計(jì)算平均值(X7Jc)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD水);檢測(cè)濃度為0.5mg/L的樣本20次,記錄吸光度差值(ΛΑ#),計(jì)算平均值(Χ#)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD#),試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。用如下公式計(jì)算靈敏度。
      [0035]靈敏度=0.5 X (X 水+3 X SD 水)/X 樣
      [0036]表1
      [0037]
      【權(quán)利要求】
      1.一種納米膠乳微粒型胱抑素C測(cè)定試劑盒,其特征在于:包括試劑Rl和試劑R2,所述試劑Rl為促進(jìn)抗體抗原特異性結(jié)合的反應(yīng)液,組分包括:10~30mmol/L的緩沖液、0.01%~4% (w/v)的增乳劑、0.5%~2% (w/v)的穩(wěn)定劑、0.1% (w/v)的防腐劑;所述試劑R2為結(jié)合有抗人胱抑素C抗體的納米膠乳微粒的緩沖液,組分包括:0.1 %~0.5% (w/v)標(biāo)記有抗人胱抑素C抗體的納米膠乳微粒、0.2%~2% (w/v)的穩(wěn)定劑、10~30mmol/L的緩沖液、0.1% (w/v)的防腐劑。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米膠乳微粒型胱抑素C測(cè)定試劑盒,其特征在于:所述緩沖液為三羥甲基氨基甲烷緩沖液、2-嗎啉乙橫酸緩沖溶液、磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液、羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液和三羥甲基氨基甲烷緩沖液中的一種或多種;所述緩沖液PH值為6~9。所述緩沖液可以為其他具有相似特征的緩沖液。
      3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米膠乳微粒型胱抑素C測(cè)定試劑盒,其特征在于:所述增乳劑為聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇辛基苯基醚或吐溫20。
      4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米膠乳微粒型胱抑素C測(cè)定試劑盒,其特征在于:所述防腐劑為置氣化納、硫柳萊、本酌 中的一種或多種。
      5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米膠乳微粒型胱抑素C測(cè)定試劑盒,其特征在于:所述穩(wěn)定劑為牛血清白蛋白、聚乙二醇6000、乙二胺四乙酸鈉中的一種或多種。
      6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米膠乳微粒型胱抑素C測(cè)定試劑盒,其特征在于:所述抗人胱抑素C抗體為單克隆抗體或多克隆抗體或單克隆抗體與多克隆抗體的混合物。
      7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米膠乳微粒型胱抑素C測(cè)定試劑盒,其特征在于:所述的納米膠乳微粒為被化學(xué)基團(tuán)修飾的聚苯乙烯膠乳微粒,所述的化學(xué)基團(tuán)優(yōu)選羧基。
      8.根據(jù)權(quán)利要求1或6~7所述的納米膠乳微粒型胱抑素C測(cè)定試劑盒,其特征在于:所述標(biāo)記有抗人胱抑素C抗體的納米膠乳微粒的制備方法為:選擇不同粒徑的聚苯乙烯納米膠乳微粒,在活化劑的作用下,聚苯乙烯微粒上的羧基與抗體上的氨基縮合形成偶聯(lián)物。所述不同粒徑的聚苯乙烯納米膠乳微粒的直徑在50~300nm。
      9.根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的納米膠乳微粒型胱抑素C測(cè)定試劑盒,其特征在于:所述試劑R2為0.1%~0.5% (w/v)多克隆抗體偶聯(lián)物和單克隆抗體偶聯(lián)物的混合緩沖液,所述多克隆抗體偶聯(lián)物和單克隆抗體偶聯(lián)物的質(zhì)量比是(I~2): (2~6)。
      10.根據(jù)權(quán)利要求1~9任一項(xiàng)所述的納米膠乳微粒型胱抑素C測(cè)定試劑盒,其特征在于:用于測(cè)定人血清中胱抑素C的含量。
      【文檔編號(hào)】G01N33/531GK103823070SQ201410105395
      【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年3月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月21日
      【發(fā)明者】董海江, 李玲, 董同義 申請(qǐng)人:北京強(qiáng)申醫(yī)學(xué)科技有限公司
      網(wǎng)友詢問(wèn)留言 已有0條留言
      • 還沒(méi)有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
      1