一種改良的胱抑素c檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種定量檢測胱抑素C（胱抑素C）的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2，所述試劑R1主要由緩沖液1、穩(wěn)定劑1、防腐劑1、EDTA、增凝劑和保護(hù)劑1組成；所述試劑R2主要由交聯(lián)胱抑素C抗體的聚苯乙烯膠乳微球、緩沖液2、穩(wěn)定劑2、防腐劑2、保護(hù)劑2組成，其中聚苯乙烯膠乳微球與胱抑素C抗體之間以共價(jià)交聯(lián)方式連接。本發(fā)明檢測試劑盒制備成本低廉，穩(wěn)定性好，易于保存，數(shù)據(jù)重復(fù)性好，檢測靈敏度高，可廣泛應(yīng)用于臨床生化儀。
【專利說明】一種改良的胱抑素C檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種改良的胱抑素C檢測試劑盒及其制備 方法和用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 臨床評價(jià)腎臟疾病進(jìn)展和嚴(yán)重程度，一般以腎功能為參考，腎功能一般以腎小球 濾過率（GFR)反映。它是反映腎功能最重要的指標(biāo)。根據(jù)腎小球?yàn)V過率（GFR)標(biāo)志物來 源，分外源性和內(nèi)源性。外源性標(biāo)志物包括菊粉（inulin)、碘海醇（i〇heX〇l)、51Cr-EDTA、 99mTc-DTPA等。內(nèi)源性標(biāo)志物包括血清肌酐（Scr)、尿素（Urea)、P 2-微球蛋白（@ 2-M)、 ￠-痕跡蛋白（BTP)以及血清胱抑素C(Cystatin C，Cys C)。
[0003] 胱抑素C(Cystatin C，Cys C)，又名Y 2痕跡堿性蛋白或后Y球蛋白，是半胱氨 酸蛋白酶抑制劑蛋白質(zhì)中的一種。編碼Cys C的基因?qū)儆诠芗一?，能在所有的有核?xì)胞 內(nèi)以恒定速度持續(xù)轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，無組織特異性，故Cys C可在體內(nèi)以恒定速度產(chǎn)生，并存在 于各種體液之中，尤以腦脊液和精漿中含量為高，尿液中最低，不受年齡、性別、體重、炎癥 等因素影響。胱抑素C分子量?。?3KD)，生理?xiàng)l件下帶正電荷，能自由從腎小球?yàn)V過，完全 被腎小管上皮細(xì)胞重吸收并于細(xì)胞內(nèi)降解，不重新回到血液中，同時腎小管上皮細(xì)胞也不 分泌Cys C至管腔內(nèi)，因此，其血清濃度主要由GFR決定。近年來有許多試驗(yàn)證明胱抑素C 是迄今基本滿足理想內(nèi)源性GFR標(biāo)志物要求的內(nèi)源性物質(zhì)。是新近發(fā)展起來的評估腎功能 的一種敏感性好、特異性高的指標(biāo)。Cystatin C在一系列生理病理過程中也發(fā)揮著作用，有 重要的臨床意義。
[0004] 目前臨床對胱抑素C的檢測，主要通過免疫學(xué)的方法，借助抗原抗體特異性的結(jié) 合，以雙抗夾心的方式定量檢測血清中胱抑素C的含量。具體的檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸 附測定法、化學(xué)發(fā)光法和免疫比濁法。酶聯(lián)免疫吸附測定法和化學(xué)發(fā)光法由于操作繁瑣、耗 時長、費(fèi)用高等不足，限制了其廣泛應(yīng)用。而免疫比濁法隨著全自動生化儀的普及和多種快 速免疫比濁檢測技術(shù)的發(fā)展，擁有反應(yīng)時間短，精密度好，檢測范圍寬，黃疸、溶血和脂血標(biāo) 本影響小，易于自動化等優(yōu)點(diǎn)，已成為臨床胱抑素C的主流檢測方法。
[0005] 但是，由于免疫比濁法的檢測原理缺乏酶促放大反應(yīng)，導(dǎo)致現(xiàn)有的胱抑素 C免疫 比濁檢測試劑盒不給避免的出現(xiàn)靈敏度較低等不足。同時，在試劑盒制備過程中，為保證產(chǎn) 品達(dá)到所需靈敏度，較酶聯(lián)免疫吸附測定法和化學(xué)發(fā)光法，其對所用抗體的質(zhì)量要求更高， 包被量和抗體使用量更大，增加了試劑盒的成本。且目前廣泛使用的鼠單克隆抗體、兔多克 隆抗體或羊多克隆抗體由于自身屬性，在使用過程中都不可避免的會受到類風(fēng)濕因子和異 嗜性抗體等的干擾，影響最終的檢測結(jié)果。
[0006] 卵黃抗體（Egg yolk antibodies, eyAb)，也稱卵黃免疫球蛋白（Egg yolk immunoglobulin, IgY)，是一種從免疫禽蛋中提取出的針對特定抗原的抗體，與傳統(tǒng)鼠單克 隆抗體、兔多克隆抗體或羊多克隆抗體相比，卵黃抗體具有以下優(yōu)點(diǎn)：⑴產(chǎn)量高，免疫時間 短，易于大量制備；⑵物理性質(zhì)穩(wěn)定性強(qiáng)；⑶與哺乳動物種系差別大，可識別更多表位；⑷ 特異性強(qiáng)，同一家族抗原無交叉反應(yīng)；(5)干擾小，不能識別哺乳動物體內(nèi)的補(bǔ)體和人Fe受 體，不會和類風(fēng)濕因子及HAM(人抗鼠抗體）反應(yīng)。由于其自身優(yōu)點(diǎn)突出，IgY抗體將來有 望越來越多的進(jìn)入診斷試劑的領(lǐng)域，在診斷試劑的開發(fā)中發(fā)揮更加重要的作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供提供一種改良的胱抑素 C 檢測試劑盒，該試劑盒與現(xiàn)有胱抑素C檢測試劑盒相比，能進(jìn)一步提高血清中胱抑素C的檢 測靈敏度，不受類風(fēng)濕因子和異嗜性抗體的干擾，具靈敏度高，特異性好、線性范圍寬和穩(wěn) 定性佳的特點(diǎn)，且成本更低，易于推廣使用。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供一種定量檢測胱抑素 C的膠乳增強(qiáng) 免疫比濁試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試劑Rl和試劑R2,所述試劑Rl主要由緩沖液1、穩(wěn)定劑 1、防腐劑1、EDTA、增凝劑和保護(hù)劑1組成；所述試劑R2主要由交聯(lián)胱抑素 C抗體的聚苯乙 烯膠乳微球、緩沖液2、穩(wěn)定劑2、防腐劑2、保護(hù)劑2組成，其中聚苯乙烯膠乳微球與胱抑素 C抗體之間以共價(jià)交聯(lián)方式連接。
[0009] 本發(fā)明中的防腐劑1和2是指可以抑制試劑中細(xì)菌和微生物污染的一類試劑，對 試劑具有防腐殺菌的作用。試劑R2中的保護(hù)劑2是一類能夠保護(hù)膠乳顆粒表面的抗體的 試劑。穩(wěn)定劑1和2可以保持試劑內(nèi)的電荷平衡。
[0010] 本技術(shù)方案中的胱抑素C膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒，將胱抑素C抗體交聯(lián)在聚苯 乙烯膠乳微球表面，當(dāng)血液中的胱抑素C與胱抑素C抗體反應(yīng)時，帶動聚苯乙烯膠乳微球聚 集產(chǎn)生一定濁度，而濁度與血液中的胱抑素C含量在一定范圍成正比，可以用全自動生化 儀在400-800nm波長下檢測血液中胱抑素C的含量。
[0011] 優(yōu)選地，所述試劑Rl中的緩沖液1選自Ifepes緩沖液、TriS-HCl緩沖液、MOPS緩 沖液、PBS緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼砂緩沖液中的任意一種或多種的組合，其pH為7. 0? 9. 0,濃度為25?500mmol/L ;所述試劑R2中的緩沖液2選自PBS緩沖液、硼砂緩沖液、甘 氨酸緩沖液、Hepes緩沖液、GOODS緩沖液、MOPS緩沖液中任意一種或多種的組合，其pH為 7. 0 ?9. 0,濃度為 25 ?500mmol/L。
[0012] 優(yōu)選地，為了使得試劑盒具有更佳的靈敏度和顯色效果，本發(fā)明對所述試劑Rl中 的緩沖液1進(jìn)行了改進(jìn)，所述試劑Rl中的緩沖液1包括下列組分：水蘇糖、明礬、果糖二磷 酸鈉、六偏磷酸鈉和甘氨酸，且水蘇糖、明礬、果糖二磷酸鈉、六偏磷酸鈉、甘氨酸的總濃度 為3. 5 - 7. 5g/L，生物緩沖液1的pH值為7. 2 - 7. 6。
[0013] 優(yōu)選地，各組分在緩沖液1中的濃度為：
[0014]

【權(quán)利要求】
1. 一種胱抑素C檢測試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2,所述試劑R1主要由 緩沖液1、穩(wěn)定劑1、防腐劑1、EDTA、增凝劑和保護(hù)劑1組成；所述試劑R2主要由交聯(lián)胱抑 素C抗體的聚苯乙烯膠乳微球、緩沖液2、穩(wěn)定劑2、防腐劑2、保護(hù)劑2組成，其中聚苯乙烯 膠乳微球與胱抑素C抗體之間以共價(jià)交聯(lián)方式連接。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑R1中的緩沖液1選自Hepes 緩沖液、Tris-HCl緩沖液、MOPS緩沖液、PBS緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼砂緩沖液中的任意一 種或多種的組合，其pH為7. 0?9. 0,濃度為25?500mmol/L ;所述試劑R2中的緩沖液2 選自PBS緩沖液、硼砂緩沖液、甘氨酸緩沖液、Hepes緩沖液、GOODS緩沖液、MOPS緩沖液中 任意一種或多種的組合，其pH為7. 0?9. 0,濃度為25?500mmol/L。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑R1中的緩沖液1包括下列組 分：水蘇糖、明礬、果糖二磷酸鈉、六偏磷酸鈉和甘氨酸，且水蘇糖、明礬、果糖二磷酸鈉、六 偏磷酸鈉、甘氨酸的總濃度為3. 5 - 7. 5g/L，生物緩沖液1的pH值為7. 2 - 7. 6。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑R1中的穩(wěn)定劑1選自KC1、 似(：1、0&(：12中的任意一種或多種的組合，其質(zhì)量濃度為0.5%?10% ;所述試劑1?2中的 穩(wěn)定劑2采用離子穩(wěn)定劑和懸浮穩(wěn)定劑配合使用；其中離子穩(wěn)定劑為NaCl、KC1、Na2C03、 Na2S04或者K2S04,懸浮穩(wěn)定劑為PEG8000、鹿糖、甘油或者葡萄糖。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑R1中的防腐劑1為疊氮鈉、硫 柳汞或者ProClin300 ;所述試劑R2中的防腐劑2為疊氮鈉、硫柳汞或ProClin300。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑R1中的增凝劑為PEG8000或 者葡聚糖。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑R2中的聚苯乙烯乳膠微球 的表面官能團(tuán)為氨基、羧基、酰肼、醛基或環(huán)氧基，聚苯乙烯乳膠微球的的粒徑在100? 600nm〇
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑R1中的保護(hù)劑1為牛血清白 蛋白；所述試劑R2中的保護(hù)劑2為牛血清白蛋白。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑R1中的EDTA的濃度為10? 100mmol/L〇
10. 根據(jù)權(quán)利要求1?9任一權(quán)利要求所述的試劑盒的制備方法和使用方法，其特征在 于，具體包括如下步驟： (1) 試劑R1的制備： 在緩沖液1中加入穩(wěn)定劑1、增凝劑、防腐劑1、保護(hù)劑1和EDTA，攪拌混合均勻，即得試 劑R1 ; (2) 試劑R2的制備： 步驟一：將胱抑素C抗體進(jìn)行4°C透析，再用緩沖液2將胱抑素C抗體稀釋至2mg/ml， 得到胱抑素C抗體稀釋液；將聚苯乙烯膠乳微球用蒸餾水離心、洗滌3次； 步驟二：用緩沖液2將經(jīng)過步驟一洗滌后的聚苯乙烯膠乳微球稀釋到質(zhì)量濃度為1%， 再加入質(zhì)量濃度為〇. 01 % _〇. 1 %的EDC，在室溫下攪拌反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后15000rpm 離心洗滌以除去未反應(yīng)的EDC，然后加入步驟一得到的胱抑素C抗體稀釋液，室溫下攪拌反 應(yīng)30min，再加入終止液終止反應(yīng)，將得到的反應(yīng)液15000rpm離心，用緩沖液2洗漆沉淀，重 復(fù)離心洗滌3次，最后加入緩沖液2、防腐劑2、穩(wěn)定劑2、保護(hù)劑2攪拌混合均勻即得試劑 R2。
【文檔編號】G01N33/531GK104360081SQ201410735830
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月5日
【發(fā)明者】李元麗 申請人:重慶中元生物技術(shù)有限公司