一種超高效合相色譜法測定食品中生物胺含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及食品中有害成分的檢測領(lǐng)域，特別涉及一種超高效合相色譜法測定食品中生物胺含量的方法：利用HClO4溶液對質(zhì)量為m的待測食品進(jìn)行生物胺的提取處理，得到體積為V的上清液；在上清液中加入等體積的正己烷溶液進(jìn)行萃取，重復(fù)1-2次，棄去上層有機(jī)相部分，得到凈化后的提取液；將凈化后的提取液進(jìn)行柱前衍生化，得到衍生化的提取液；采用超高效合相色譜儀檢測衍生化的提取液中生物胺的含量，得到提取液中所含生物胺的質(zhì)量濃度。本發(fā)明采用超高效合相色譜法測定食品中生物胺含量，并以超臨界二氧化碳與正己烷/異丙醇/氨水溶液的混合體系為流動相，其黏度低，傳質(zhì)性能好，所以分析時間快、溶劑載量少、環(huán)境污染小。
【專利說明】一種超高效合相色譜法測定食品中生物胺含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及食品中有害成分的檢測領(lǐng)域，具體而言，涉及一種超高效合相色譜法測定食品中生物胺含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生物胺是一類具有生物活性的含氮有機(jī)化合物的總稱，可以看作是氨分子中1-3個氫原子被烷基或芳基取代后形成的低分子量生物堿。根據(jù)結(jié)構(gòu)，可以將生物胺分成脂肪族(腐胺、尸胺、精胺、亞精胺等?、芳香族(酪胺、苯乙胺等)和雜環(huán)族(組胺、色胺等)三大類。生物胺參與機(jī)體正常代謝，是激素類、生物堿、核酸和蛋白質(zhì)合成的重要前體物質(zhì)，大多數(shù)具有強(qiáng)烈的生理活性，如促進(jìn)生長、增強(qiáng)代謝活力和調(diào)節(jié)血壓等。
[0003]生物胺主要由氨基酸脫羧作用形成，少部分通過醛或酮的胺化作用形成，各種動植物組織細(xì)胞中都含有少量的生物胺。作為食品新鮮度的重要指標(biāo)，生物胺主要由分泌氨基酸脫羧酶的微生物代謝形成，尤其是蛋白質(zhì)含量豐富的食品，如發(fā)酵香腸和魚肉制品、奶酪、發(fā)酵豆制品和飲料(啤酒，蘋果酒、葡萄酒等生物胺不僅是食物香氣的重要來源，也是化亞硝基化合物合成的前體。當(dāng)人體攝入過量生物胺時，極易引起神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)損傷。
[0004]目前，食品中生物胺的測定方法較多，在靈敏度、精密度、特異性、檢測成本和所耗時間等方面各有利弊。其中，毛細(xì)管電泳法(以幻具有無需衍生直接檢測的優(yōu)點(diǎn)，且具有較高的靈敏度，其分離速度快、儀器簡單，但樣品前處理有一定的局限，不能引入過多有機(jī)溶齊0，限制了液液萃取法的應(yīng)用；酶生物傳感器法，簡便快速、檢測限較低、特異性強(qiáng)，但目標(biāo)酶篩選困難且容易失活，導(dǎo)致成本較高、重現(xiàn)性差；薄層色譜法(110成本低、操作簡單、快速，但靈敏度稍低，只能用于生物胺定性與半定量測定；高效液相色譜(即仏)或氣相色譜法(60)準(zhǔn)確性好，分離度和靈敏度較高，但分析時間長、有機(jī)溶劑載量大，成本高。`
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種超高效合相色譜法測定食品中生物胺含量的方法，以解決上述的問題。
[0006]在本發(fā)明的實施例中提供了一種超高效合相色譜法測定食品中生物胺含量的方法，包括以下步驟:
[0007]利用此104溶液對質(zhì)量為III的待測食品進(jìn)行生物胺的提取處理，得到體積為V的上清液；在所述上清液中加入等體積的正己烷溶液進(jìn)行萃取，重復(fù)1-2次，棄去上層有機(jī)相部分，得到凈化后的提取液；
[0008]將所述凈化后的提取液進(jìn)行柱前衍生化，得到衍生化的提取液；
[0009]采用超高效合相色譜儀檢測所述衍生化的提取液中生物胺的含量，得到提取液中所含生物胺的質(zhì)量濃度；
[0010]所述超高效合相色譜儀的檢測條件為:[0011]色譜柱的直徑為3.0111111、柱長為100111111、填料粒徑為1.8 4 III，填料為高強(qiáng)度硅膠顆粒；流動相為超臨界二氧化碳與正己烷/異丙醇/氨水溶液的混合體系，正己烷:異丙醇:氨水的體積比為65-75:25-35:0.10-0.20 ；采用梯度洗脫，其中，超臨界二氧化碳在不同時間段的體積百分比為:0-0.2111111 為 96%-100%，0? 2-5.0-為 68%-72%，5.0-7.2-為96%-100% ；分析時間:6.5-8.5-；柱溫:40-6000 ；進(jìn)樣量:0.5-10 9 1 ；流速:1.5-2.5^1/111111 ；檢測波長為 25411111 ；
[0012]通過以下公式計算得到待測食品中生物胺的含量為:(質(zhì)量濃度轉(zhuǎn))加。
[0013]優(yōu)選地，所述生物胺包括精胺、亞精胺、腐胺、尸胺、色胺、苯乙胺、組胺和酪胺中的一種或多種。
[0014]優(yōu)選地，所述提取處理具體為:
[0015]取質(zhì)量III為3.0-6.08的待測樣品，加入1001的0.4^1/1的此104，旋渦振蕩5-10111111,離心，收集上清液。
[0016]優(yōu)選地，采用0.411101/1的此104提取待測食品中的生物胺兩次，收集上清液。
[0017]優(yōu)選地，將所述凈化后的提取液用0.411101/1的此104定容至2501。
[0018]優(yōu)選地，所述柱前衍生化處理方法具體為:
[0019]取所述凈化后的提取液1.01111^211101/1氫氧化鈉溶液200 9 1、飽和碳酸氫鈉溶液300 11 1和1008/1111丹磺酰氯的丙酮溶液101，振蕩混勻，于35-45避光反應(yīng)40-50111111，每隔8-10111111振蕩一次；
[0020]加入100^ 1的氨水終止反應(yīng)`，室溫下避光靜置20-40111111，取乙腈定容至5.01111，振蕩混勻，經(jīng)0.22 9 ?。?！濾膜過濾后供色譜分析。
[0021]優(yōu)選地，所述超高效合相色譜儀檢測時:所述進(jìn)樣量為5.04 1。
[0022]優(yōu)選地，所述超高效合相色譜儀檢測時:波長補(bǔ)償范圍為350-450111
[0023]優(yōu)選地，所述超高效合相色譜儀檢測時:備壓為1800-22001)81。
[0024]本發(fā)明實施例提供的一種超高效合相色譜法測定食品中生物胺含量的方法，采用超高效合相色譜法'腦1106⑶1^61^611(36。111~0胍1:081'叩117，)測定食品中生物胺含量，并以超臨界二氧化碳與正己烷/異丙醇/氨水溶液的混合體系為流動相，其黏度低，傳質(zhì)性能好，所以分析時間快、溶劑載量少、環(huán)境污染小。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1示出了本發(fā)明實施例4中生物胺混標(biāo)色譜圖；
[0026]圖2示出了本發(fā)明實施例4中魚露樣品中生物胺的色譜圖。
【具體實施方式】
[0027]下面通過具體的實施例子對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0028]本發(fā)明實施例中提供了一種超高效合相色譜法測定食品中生物胺含量的方法，包括以下步驟:
[0029]利用此104溶液對質(zhì)量為III的待測食品進(jìn)行生物胺的提取處理，得到體積為V的上清液；在所述上清液中加入等體積的正己烷溶液進(jìn)行萃取，重復(fù)1-2次，棄去上層有機(jī)相部分，得到凈化后的提取液；超臨界二氧化碳與正己烷/異丙醇/氨水子，所以分析時間快、溶劑載量少、環(huán)境污染
有生物胺種類均出峰，節(jié)約測定時間。設(shè)定忖目色譜儀檢測時，流速為1.5-2.51111/111111,
〔，其中優(yōu)選為25411111作為檢測波長。優(yōu)選01。對不同柱溫進(jìn)行考察，經(jīng)過多次試驗1分離效果最佳，靈敏度更高，優(yōu)選地，柱溫
腐胺、尸胺、色胺、苯乙胺、組胺和酪胺中的
口入101111的0.411101/1的此104，旋渦振蕩:提取的更徹底，優(yōu)選地，采用0.411101/1的述超高效合相色譜儀檢測時:進(jìn)樣體積為5.09 1，該進(jìn)樣體積可以保證峰面積在比較合理的范圍，避免超出儀器的檢測范圍內(nèi)。
[0046]不同的備壓進(jìn)樣，得到不同的色譜圖，超高效合相色譜儀檢測時，備壓為1800-22001381范圍得到的峰型分離度好。
[0047]波長的補(bǔ)償是為了去除基線噪音干擾，設(shè)定不同的波長補(bǔ)償范圍，根據(jù)不同波長補(bǔ)償范圍觀察得到的峰型，波長補(bǔ)償范圍為350-45011111時，得到的峰型對稱性好、選擇性強(qiáng)、干擾少。
[0048]實施例1
[0049](￡1)樣品預(yù)處理:準(zhǔn)確稱取3.08待測樣品，置于5001離心管中，加入1001此104溶液(0.411101/1),潤旋振蕩5111111，于4。0下3040X8離心10111111，濾紙過濾，收集上清液。沉淀物用(0.411101/1)溶液重復(fù)提取一次，合并上清液。
[0050](^)凈化處理:取上述樣品上清液，加入等體積正己烷溶液，渦旋振蕩5-11，棄去上層有機(jī)相，收集含此104部分，重復(fù)進(jìn)行兩次，轉(zhuǎn)移至251111棕色容量瓶，用0.411101/1的此104溶液定容到刻度。
[0051](0)柱前衍生化:取所述凈化提取液1.01111211101/1氫氧化鈉溶液200 9 1、飽和碳酸氫鈉溶液300 ^ 1和10^/1111丹磺酰氯的丙酮溶液振蕩混勻，于351避光反應(yīng)40111111，每隔10111111振蕩一次；加入100^1 1的氨水終止反應(yīng)，室溫下避光靜置20111111，取乙腈定容至5.0“，振蕩混勻，得到衍生化液；取適量衍生化液經(jīng)0.22 0 濾膜過濾以用于超高效合相色譜分析。
[0052]((1)超高效合相色譜法條件為:色譜柱:…卯III ^？02！188 01888色譜柱，
3.0父100111111，1.811111 ；流動相:超臨界二氧化碳與正己烷丨異丙醇丨氨水溶液的混合液，正己烷:異丙醇:氨水的體積比為65:25:0.1`0 ；采用梯度洗脫，其中，超臨界二氧化碳在不同時間段的體積百分比為:0-0.2111111為969(),0.2-5.0-為68%，5.0-7.2-為96% ；分析時間:8.5111111 ；檢測波長:25411111,波長補(bǔ)償范圍 350-45011111 ；備壓:2200^)81 ；流速:1.51111/111111,柱溫40。。，進(jìn)樣體積:10.0卩1。
[0053](6)將步驟((1)測定數(shù)值與生物胺標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程對比，得到食品樣品中不同生物胺種類的含量。
[0054]生物胺標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程:稱取精胺，亞精胺，腐胺，尸胺，色胺，苯乙胺，組胺和酪胺各1001118放于1001111棕色容量瓶中，用0.4^1/1的此104定容至刻度，即得濃度為1.01118/1111的生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的單標(biāo)儲備液；取單標(biāo)儲備液各10.01111于1001111棕色容量瓶中，0.4001/1的此104稀釋至刻度，即得生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的混標(biāo)儲備液。分別取混標(biāo)儲備液，用
0.411101/1的抝104稀釋為濃度為0.5,1.0,2.0,5.0,10.0,20.0^^/1111梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別按步驟化)進(jìn)行柱前衍生化，經(jīng)0.22 9 0濾膜過濾后，取適量采用超高效合相色譜儀進(jìn)行檢測，超高效合相色譜法條件同步驟((1)；以峰面積-濃度作為線性回歸，得到生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程。
[0055]實施例2
[0056](￡1)樣品預(yù)處理:準(zhǔn)確稱取4.58待測樣品，置于5001離心管中，加入2001此104溶液(0.411101/1),潤旋振蕩7111111，于4。0下3040X8離心10111111，濾紙過濾，收集上清液。
[0057](^)凈化處理:取上清液，加入等體積正己烷溶液，渦旋振蕩301??！，棄去上層有機(jī)品線性回歸方程對比，得到食品樣品中不同
安，亞精胺，腐胺，尸胺，色胺，苯乙胺，組胺.411101/1的此104定容至刻度，即得濃度為?儲備液各10.001于10001棕色容量瓶中，蘭品的混標(biāo)儲備液。分別取混標(biāo)儲備液，用5.0,10.0,20.011 梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分丈濾后，取適量采用超高效合相色譜儀進(jìn)行5積-濃度作為線性回歸，得到生物胺標(biāo)準(zhǔn)
蘆品，置于501111離心管中，加入101111 ??！0104丨離心10111111，濾紙過濾，收集上清液。沉
-次，合并上清液。
、等體積正己烷溶液，渦旋振蕩801！！，棄去,轉(zhuǎn)移至2501棕色容量瓶，用0.411101/1的溫601，進(jìn)樣體積:0.5 9 1。
[0067](6)將步驟((1)測定數(shù)值與生物胺標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程對比，得到食品樣品中不同生物胺種類的含量。
[0068]生物胺標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程:稱取精胺，亞精胺，腐胺，尸胺，色胺，苯乙胺，組胺和酪胺各1001118放于1001111棕色容量瓶中，用0.4^1/1的此104定容至刻度，即得濃度為
1.01118/1111的生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的單標(biāo)儲備液；取單標(biāo)儲備液各10.01111于1001111棕色容量瓶中，0.4001/1的此104稀釋至刻度，即得生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的混標(biāo)儲備液。分別取混標(biāo)儲備液，用0.4001/1的抝104稀釋為濃度為0.5,1.0,2.0,5.0,10.0,20.0^^/1111梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別按步驟化)進(jìn)行柱前衍生化，經(jīng)0.22 9 ?。?！濾膜過濾后，取適量采用超高效合相色譜儀進(jìn)行檢測，超高效合相色譜法條件同步驟((1)；以峰面積-濃度作為線性回歸，得到生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程。
[0069]實施例4
[0070](￡1)樣品預(yù)處理:準(zhǔn)確稱取6.08市售魚露樣品，置于5001離心管中，加入1001此104溶液(0.41X101/0，潤旋振蕩5111111，于41下3040X8離心10111111，濾紙過濾，收集上清液。沉淀物用(0.411101/1)溶液重復(fù)提取一次，合并上清液。
[0071](^)凈化處理:在上清液中加入等體積正己烷溶液，渦旋振蕩501??！，棄去上層有機(jī)相，收集含此104部分，重復(fù)進(jìn)行兩次，轉(zhuǎn)移至251111棕色容量瓶，用0.411101/1的此104溶液定容到刻度。
[0072](0)柱前衍生化:取所述凈化提取液1.01111211101/1氫氧化鈉溶液200 9 1、飽和碳酸氫鈉溶液300^ 1和川呢/“丹磺酰氯的丙酮溶液振蕩混勻，于401避光反應(yīng)45111111，每隔10111111振蕩一次；加`入100^1 1的氨水終止反應(yīng)，室溫下避光靜置30111111，取乙腈定容至5“，振蕩混勻，得到衍生化液；取適量衍生化液經(jīng)0.22 9 0濾膜過濾以用于超高效合相色譜分析。
[0073]((1)超高效合相色譜法條件為:色譜柱:…卯III ^？02！188 01888色譜柱，
3.0父100111111，1.811111 ；流動相:超臨界二氧化碳與正己烷丨異丙醇丨氨水溶液的混合液，正己烷:異丙醇:氨水的體積比為70:30:0.15 ；采用梯度洗脫，超臨界二氧化碳在不同時間段的體積百分比為:0-0.2111111為98%，0.2-5.0-為70%，5.0-7.2-為98% ；分析時間:
7.5111111,檢測波長:254咖，波長補(bǔ)償范圍 350-45011111 ；備壓:20001)81 ；流速:2.01111/111111,柱溫501，進(jìn)樣體積:10.0 9 1。
[0074](6)進(jìn)樣6次，將測定數(shù)值與生物胺標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程對比，得到食品樣品中不同生物胺種類的含量。
[0075]生物胺標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程:生物胺的不同種類-精胺、亞精胺、腐胺、尸胺、色胺、苯乙胺、組胺和酪胺均購于011611110818 (0110118,，稱取精胺，亞精胺，腐胺，尸胺，色胺，苯乙胺，組胺和酪胺各10008放于100“棕色容量瓶中，用0.4^1/1的此104定容至刻度，即得濃度為1.01118/1111的生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的單標(biāo)儲備液；取單標(biāo)儲備液各10.01111于1001111棕色容量瓶中，0.4^1/1的！^104稀釋至刻度，即得生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的混標(biāo)儲備液。分別取混標(biāo)儲備液，用0.4001/1的此104稀釋為濃度為0.5,1.0,2.0,5.0,10.0、20.0 ^邑/“梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別按步驟化)進(jìn)行柱前衍生化，經(jīng)0.22 ^ 0濾膜過濾后，取適量采用超高效合相色譜儀進(jìn)行檢測，超高效合相色譜法條件同步驟((1)；各濃度分別進(jìn)樣6次，以其中一次的進(jìn)樣為例，以時間為橫坐標(biāo)，峰高為縱坐標(biāo)，得到的色譜圖如圖1所示，其中，1~精胺，2-亞精胺，3-酪胺，4-色胺，5-腐胺，6-苯基乙胺,7-尸胺，8-組胺；記錄數(shù)據(jù)，以濃度(0為橫坐標(biāo)，平均峰面積(八)為縱坐標(biāo)得到線性回歸方程，如表1所示。
[0076]表18種生物胺的線性回歸方程及相關(guān)參數(shù)
[0077]
【權(quán)利要求】
1.一種超高效合相色譜法測定食品中生物胺含量的方法，其特征在于，包括以下步驟: 利用此104溶液對質(zhì)量為III的待測食品進(jìn)行生物胺的提取處理，得到體積為V的上清液；在所述上清液中加入等體積的正己烷溶液進(jìn)行萃取，重復(fù)1-2次，棄去上層有機(jī)相部分，得到凈化后的提取液； 將所述凈化后的提取液進(jìn)行柱前衍生化，得到衍生化的提取液； 采用超高效合相色譜儀檢測所述衍生化的提取液中生物胺的含量，得到提取液中所含生物胺的質(zhì)量濃度； 所述超高效合相色譜儀的檢測條件為: 色譜柱的直徑為3.0皿、柱長為100皿、填料粒徑為1.8 ^ 111，填料為高強(qiáng)度硅膠顆粒；流動相為超臨界二氧化碳與正己烷/異丙醇/氨水溶液的混合體系，正己烷:異丙醇:氨水的體積比為65-75:25-35:0.10-0.20 ；采用梯度洗脫，其中，超臨界二氧化碳在不同時間段的體積百分比為:0-0.2111111 為 96%-100%，0.2-5.0111111 為 68%-72%，5.0-7.2111111 為 96%-100% ；分析時間:6.5-8.5111111 ；柱溫:40-60。。；進(jìn)樣量:0.5-10 11 1 ；流速:1.5-2.51111/111111 ；檢測波長為254鹽； 通過以下公式計算得到待測食品中生物胺的含量為:(質(zhì)量濃度轉(zhuǎn))加。
2.根據(jù)權(quán)利要 求1所述的超高效合相色譜法測定食品中生物胺含量的方法，其特征在于，所述生物胺包括精胺、亞精胺、腐胺、尸胺、色胺、苯乙胺、組胺和酪胺中的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超高效合相色譜法測定食品中生物胺含量的方法，其特征在于，所述提取處理具體為: 取質(zhì)量III為3.0-6.08的待測樣品，加入101111的0.4^1/1的!^104，旋渦振蕩5-10—，離心，收集上清液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的超高效合相色譜法測定食品中生物胺含量的方法，其特征在于，采用0.4001/1的此104提取待測食品中的生物胺兩次，收集上清液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的超高效合相色譜法測定食品中生物胺含量的方法，其特征在于，將所述凈化后的提取液用0.411101/1的此104定容至2501。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的超高效合相色譜法測定食品中生物胺含量的方法，其特征在于，所述柱前衍生化處理方法具體為: 取所述凈化后的提取液1.01111211101/1氫氧化鈉溶液2000 1、飽和碳酸氫鈉溶液300 11 1和1008/1111丹磺酰氯的丙酮溶液101，振蕩混勻，于35-451^避光反應(yīng)40-50111111，每隔8-10111111振蕩一次； 加入100^ 1的氨水終止反應(yīng)，室溫下避光靜置20-40-11,取乙腈定容至5.0“，振蕩混勻，經(jīng)0.22 9 ?。?！濾膜過濾后供色譜分析。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的超高效合相色譜法測定食品中生物胺含量的方法，其特征在于，所述超高效合相色譜儀檢測時:所述進(jìn)樣量為5.1。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超高效合相色譜法測定食品中生物胺含量的方法，其特征在于，所述超高效合相色譜儀檢測時:波長補(bǔ)償范圍為350-450！^。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超高效合相色譜法測定食品中生物胺含量的方法，其特征在于，所述超高效合相色譜儀檢測時:備壓為1800-22001)81。
【文檔編號】G01N30/88GK103837635SQ201410120955
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】龔霄, 齊寧利, 陳珂, 林麗靜, 李積華 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所