心肌梗塞三聯(lián)快速檢測(cè)試劑盒及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種心肌梗塞三聯(lián)快速檢測(cè)試劑盒及其制備方法。該試劑盒是以新型心臟標(biāo)志物-人髓過(guò)氧化物酶(MPO)、心臟脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP3)為基礎(chǔ)，再配以心梗標(biāo)志物CRP、cTnI、Lp-PLA2中任意一種。其特征在于該試劑盒比現(xiàn)有金標(biāo)試劑盒具有更早預(yù)警心肌梗塞病癥，并且能預(yù)警心肌梗塞發(fā)生前后整個(gè)過(guò)程的風(fēng)險(xiǎn)。該試劑盒由試紙卡、比色卡或膠體金定量讀數(shù)儀組成。試紙卡上同時(shí)標(biāo)記有抗人髓過(guò)氧化物酶特異性抗體、抗人心臟脂肪酸結(jié)合蛋白特異性抗體及抗其他任意一種心梗標(biāo)志物抗體的膠體金墊。首次將心肌梗塞新型標(biāo)志物通過(guò)膠體金免疫層析技術(shù)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，具有早期預(yù)警、全程監(jiān)控、操作簡(jiǎn)便、快速、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等特點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】心肌梗塞三聯(lián)快速檢測(cè)試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明專(zhuān)利涉及生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種膠體金固相免疫層析法制備的以人髓過(guò)氧化物酶(MPO)及心臟脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP3)為基礎(chǔ)的三聯(lián)快速檢測(cè)試劑盒，用于心肌梗塞的早期預(yù)警及治療過(guò)程和愈后的監(jiān)控。
【背景技術(shù)】
[0002]急性心肌梗塞(AMI)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，而對(duì)于此類(lèi)疾病的盡早診斷和治療是降低病人死亡率的重要手段之一。特別是當(dāng)心電圖改變不明顯的心肌梗塞發(fā)作時(shí)，僅依靠心電圖、超聲心動(dòng)圖和心臟核磁共振，難以作出準(zhǔn)確診斷。
[0003]心臟標(biāo)志物是指在血液中可測(cè)定出的一系列生物化學(xué)物質(zhì)，它們能夠敏感、特異的反映心肌損傷(異常)及其嚴(yán)重程度，因而可用作心肌損傷的篩查、診斷、評(píng)定預(yù)后和治療效果的監(jiān)測(cè)標(biāo)志。心臟標(biāo)志物在人體正常情況下主要存在于心臟，發(fā)生異常時(shí)由心臟大量釋放，通過(guò)分子生物學(xué)和抗體技術(shù)可測(cè)定出血液中這些微量物質(zhì)的變化，從而為臨床提供高特異性的輔助診斷手段。
[0004]肌酸激酶同工酶、肌鈣蛋白為代表的心臟標(biāo)志物已廣泛用于急性冠脈綜合癥的診斷和預(yù)后判斷。但是，這些早期的心臟標(biāo)志物都不能反映早期心肌損傷，也缺乏組織的特異性，它們還不能作為可靠的早期預(yù)警診斷。
[0005]髓過(guò)氧化物酶(MPO)是一種主要存在于嗜中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞的嗜天青顆粒中的過(guò)氧化物酶，與冠狀動(dòng)脈炎癥密切相關(guān)，而冠狀動(dòng)脈炎癥又與心肌梗塞密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，MPO是一種新型的心肌梗塞早期預(yù)警標(biāo)志物，炎癥時(shí)激活的嗜中性粒細(xì)胞發(fā)生脫顆粒并釋放髓過(guò)氧化物酶，它導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病灶不穩(wěn)定甚至是破裂，使血管內(nèi)皮下膠原組織暴露，隨之發(fā)生血小板粘附聚集和血栓形成，造成冠狀動(dòng)脈阻塞，發(fā)生急性冠狀動(dòng)脈綜合癥，甚至是嚴(yán)重的心肌不可逆缺血損傷。MPO通過(guò)產(chǎn)生自由基和多種反應(yīng)性物質(zhì)，促進(jìn)斑塊形成和不穩(wěn)定性增加，引起急性冠脈綜合癥。MPO是預(yù)測(cè)ACS患者發(fā)生不良心血管事件的一個(gè)新的預(yù)測(cè)因子，特別是在肌鈣蛋白T(cTnT)水平較低的患者，MPO能夠識(shí)別那些將來(lái)發(fā)生心血管事件危險(xiǎn)性較高的患者，并提前3小時(shí)發(fā)出預(yù)警。大量臨床研究資料表明，急性冠狀動(dòng)脈綜合癥的病人血清中MPO水平顯著地升高。
[0006]人心臟脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP3)是心臟中富含的一種新型小胞質(zhì)蛋白。主要在心臟組織中表達(dá)，它具有高度心臟特異性。心肌缺血性損傷出現(xiàn)后，F(xiàn)ABP3可以早在胸痛發(fā)作后1-3小時(shí)在血液中被發(fā)現(xiàn)，6-8小時(shí)達(dá)到峰值，在24-30小時(shí)內(nèi)恢復(fù)正常。FABP3是一種對(duì)心肌損傷的早期診斷有意義的生物標(biāo)志物，其特點(diǎn)有:(I)在心肌中高濃度；(2)在細(xì)胞質(zhì)中限制；(3)低分子量和面積小；(4)相對(duì)組織特異性；(5)與心臟以外組織中CK-MB的分布相似；(6)在心肌損傷后早釋進(jìn)入血漿和尿液。缺血損傷后快速出現(xiàn)FABP3表明它可能經(jīng)內(nèi)皮途徑到達(dá)循環(huán)。心臟中FABP3濃度比骨骼肌中高2-10倍(凈重0.5vs.0.05-0.2mg/g)。與此相反，心臟細(xì)胞中肌紅蛋白濃度比骨骼細(xì)胞中低2倍(2.5和4.0mg/g凈重)。肌紅蛋白的正常血漿濃度(20-80 μ g/Ι)比FABP3的(〈5 μ g/Ι)高10-15倍。雖然血漿肌紅蛋白水平升高是目前被廣泛接受的早期心肌損傷標(biāo)志，但FABP3更加具有心臟特異性。
[0007]目前國(guó)內(nèi)外已有單獨(dú)檢測(cè)MPO及FABP3的試劑盒，主要采用酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法、非均相免疫法和固相免疫方法等，少數(shù)公司的產(chǎn)品已經(jīng)獲得FDA注冊(cè)或CE認(rèn)證。
[0008]然而，現(xiàn)有的產(chǎn)品多是針對(duì)單一指標(biāo)進(jìn)行控制，只能檢測(cè)或預(yù)警心肌梗塞的某個(gè)階段，不能全面地、特異性地預(yù)警心肌梗塞的發(fā)生、發(fā)展全程。由于目前MPO、FABP3均以不同的產(chǎn)品形式在臨床上應(yīng)用，制作原理及操作程序不同，兼容性比較差，很難在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)、快速地檢測(cè)出兩者的結(jié)果，故極大的影響了對(duì)急性ACS患者進(jìn)行心梗風(fēng)險(xiǎn)的合理綜合判定。MPO可以預(yù)警心肌梗塞發(fā)生前3小時(shí)的風(fēng)險(xiǎn)，但其他炎癥下也存在指標(biāo)升高的情況。FABP3僅能表示發(fā)生心肌梗塞后I?3小時(shí)的情況，不能在心肌梗塞發(fā)生前預(yù)警。目前的金標(biāo)檢測(cè)試劑盒為檢測(cè)肌鈣蛋白、肌酸激酶MB同工酶為主，而這些陳舊的指標(biāo)出現(xiàn)在心肌梗塞發(fā)生后，只能顯示已發(fā)生心梗，不能達(dá)到預(yù)警的目的。心電圖雖然也可反映病人的病情，但在剛發(fā)生胸痛的病人中，雖然有已經(jīng)開(kāi)始了急性心梗的進(jìn)程，卻有半數(shù)以上的心電圖表現(xiàn)為正常，從而造成很多病人因延誤救治而死亡。
[0009]中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01210491594.1公開(kāi)了一種心肌梗塞預(yù)警膠體金試劑盒及其制備方法，該專(zhuān)利揭示了脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2膠體金試劑盒的方法。
[0010]中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01110453809.6公開(kāi)了 一種定量檢測(cè)人心型脂肪酸結(jié)合蛋白的熒光免疫層析方法及其試劑盒，該方法僅用于檢測(cè)FABP3，而且采用熒光免疫，存在檢測(cè)儀器成本高，配套試劑有污染等缺陷。
[0011]中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01220465120.5公開(kāi)了一種髓過(guò)氧化物酶膠體金試劑盒，只用來(lái)檢測(cè)MPO含量，存在其他炎癥干擾的缺點(diǎn)。
[0012]因此，市場(chǎng)上急需一種針對(duì)心肌梗塞發(fā)生、發(fā)展的快速、簡(jiǎn)便、系統(tǒng)的診斷試劑，由本發(fā)明專(zhuān)利提供的試劑盒彌補(bǔ)了市場(chǎng)上現(xiàn)有試劑盒的缺陷，滿足了心肌梗塞病癥預(yù)警、診斷的需求，在胸痛發(fā)生時(shí)，病人及家屬可隨時(shí)使用本試劑來(lái)監(jiān)控發(fā)生心肌梗塞的風(fēng)險(xiǎn)，不受任何環(huán)境因素的影響，避免因病情的延誤而發(fā)生嚴(yán)重的后果。本發(fā)明提供了一種優(yōu)于現(xiàn)有診斷技術(shù)的、全面的、全新的檢測(cè)方法。只需一滴血樣，就可全面追蹤胸痛病人心肌梗塞早期及病癥期的病情進(jìn)展，并對(duì)其風(fēng)險(xiǎn)作出相應(yīng)的判斷。
[0013]本發(fā)明驚奇地發(fā)現(xiàn)，如果把MPO和FABP3抗體包被在同一個(gè)試劑盒內(nèi)對(duì)心血管病人血樣進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，可以快速、準(zhǔn)確預(yù)警早期心肌梗塞的風(fēng)險(xiǎn)，起到了意想不到的效果。以MPO、FABP3特異性抗體為基礎(chǔ)的三聯(lián)試劑盒可以預(yù)警心肌梗塞發(fā)生前后整個(gè)過(guò)程的風(fēng)險(xiǎn)，尤其對(duì)胸痛而心電圖卻表現(xiàn)正常的病人，使用MPO、FABP3為基礎(chǔ)的三聯(lián)試劑盒進(jìn)行快速檢測(cè)，可對(duì)心肌梗塞不同分期的診斷和風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估。如MP0-FABP3-cTnI三聯(lián)試劑盒，可預(yù)測(cè)病人從心梗發(fā)生前3小時(shí)至心梗發(fā)生后12小時(shí)的狀況；MP0-FABP3-CRP三聯(lián)試劑盒，可預(yù)測(cè)病人從心梗發(fā)生前3小時(shí)至心梗發(fā)生后24小時(shí)的狀況；而MP0-FABP3-Lp-PLA2三聯(lián)試劑盒，可預(yù)測(cè)病人從心梗發(fā)生前3小時(shí)至心梗發(fā)生后6小時(shí)的狀況，發(fā)出心梗早期預(yù)警。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明提供了一種以新型心臟標(biāo)志物人髓過(guò)氧化物酶(MPO)及心臟脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP3)抗體為基礎(chǔ)的三聯(lián)快速檢測(cè)試劑盒及其制備方法，用于心肌梗塞早期預(yù)警及病情風(fēng)險(xiǎn)判斷。[0015]本發(fā)明心肌梗塞三聯(lián)快速檢測(cè)試劑盒的目的在于，在心臟病人發(fā)生心梗的早期，即心電圖正常和肌鈣蛋白正常的情況下，預(yù)警心肌梗塞的風(fēng)險(xiǎn)，從而降低心梗病人的致殘率和死亡率,并監(jiān)測(cè)整個(gè)ACS過(guò)程的病情進(jìn)展。
[0016]雖然現(xiàn)有技術(shù)中有關(guān)于心肌梗塞檢測(cè)試劑盒、MPO檢測(cè)試劑盒和FABP3檢測(cè)試劑盒的報(bào)道，但相應(yīng)地存在預(yù)警時(shí)間滯后、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、指標(biāo)不全面以及操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。本發(fā)明令人驚喜地發(fā)現(xiàn)，以MPO和FABP3抗體為基礎(chǔ)，搭配任意一項(xiàng)心臟標(biāo)志物抗體，可更加特異性的、靈敏的、全面的判斷心肌梗塞早期和整個(gè)發(fā)生過(guò)程的風(fēng)險(xiǎn)，起到了意想不到的臨床診斷效果，在心肌梗塞診斷領(lǐng)域具有極大的創(chuàng)造性和技術(shù)進(jìn)步。在現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)判定為陰性的胸痛病人中，檢測(cè)出了漏診病人，填補(bǔ)了現(xiàn)有臨床診斷的不足。本發(fā)明提供了一種優(yōu)于現(xiàn)有診斷產(chǎn)品的形式，本發(fā)明可對(duì)全程心梗進(jìn)行監(jiān)測(cè)，而試劑盒快速、簡(jiǎn)便、不需要儀器的特點(diǎn)使得多點(diǎn)監(jiān)測(cè)成為可能。本發(fā)明的應(yīng)用，將為心肌梗塞早期診斷和全程監(jiān)測(cè)帶來(lái)巨大的技術(shù)進(jìn)步。
[0017]本發(fā)明提供了一種包含人髓過(guò)氧化物酶(MPO)、心臟脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP3)和其他心臟生物標(biāo)志物抗體的固相免疫層析快速診斷試劑。心臟標(biāo)志物是指在血液中可測(cè)定出的一系列生物化學(xué)物質(zhì)，它們能夠敏感、特異的反映心肌損傷(異常)及其嚴(yán)重程度，因而可用作心肌損傷的篩查、診斷、評(píng)定預(yù)后和治療效果監(jiān)測(cè)的標(biāo)志。心臟標(biāo)志物在人體正常情況下主要存在于心臟，發(fā)生異常時(shí)由心臟大量釋放，通過(guò)分子生物學(xué)和抗體技術(shù)可測(cè)定出血液中這些微量物質(zhì)的變化，從而為臨床提供了高特異性輔助診斷手段。發(fā)明中所述其他心臟生物標(biāo)志物優(yōu)選地包括:C反應(yīng)蛋白(hsCRP)、脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2 (Lp-PLA2)和肌?丐蛋白(cTnl) ο [0018]C反應(yīng)蛋白可以反映發(fā)生AMI后期的嚴(yán)重情況，該三聯(lián)試劑盒可對(duì)AMI全程進(jìn)行監(jiān)測(cè)。C反應(yīng)蛋白是人體血漿中一種正常蛋白組分，含量甚微。當(dāng)組織損傷或炎癥發(fā)生時(shí)，CRP在肝臟的合成和分解率增加，血清中的CRP濃度含量顯著上升，是一種急性相的反應(yīng)物。CRP可作為心臟疾病的一個(gè)指示物，在心肌缺血早期可升高到正常的幾倍。CRP對(duì)心絞痛、急性冠脈綜合征和行經(jīng)皮血管成形術(shù)的患者，具有預(yù)測(cè)心肌缺血復(fù)發(fā)危險(xiǎn)和死亡危險(xiǎn)的作用。何奔等的研究中發(fā)現(xiàn)隨著血漿CRP水平的升高，ACS患者的的死亡事件及主要不良心臟事件發(fā)生率呈明顯上升趨勢(shì)，提示CRP升高的水平與ACS臨床事件的嚴(yán)重程度成相關(guān)性，說(shuō)明CRP在ACS患者的危險(xiǎn)分層和預(yù)后判斷中有重要價(jià)值，適合于中晚期預(yù)警信號(hào)。
[0019]肌鈣蛋白在AMI發(fā)生后3-6小時(shí)出現(xiàn)在血清中，AMI發(fā)生后4_9天仍處于高水平，是目前診斷心肌梗塞的金標(biāo)準(zhǔn)，本三聯(lián)試劑盒著重于AMI發(fā)生前3小時(shí)-發(fā)生后24小時(shí)的監(jiān)測(cè)。心肌肌鈣蛋白(cTn)是組成橫紋肌絲的結(jié)構(gòu)蛋白，具有調(diào)節(jié)肌細(xì)胞收縮功能，由三種不同基因的亞基組成:心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、心肌肌鈣蛋白I(cTnl)和肌鈣蛋白C(cTnC)，在控制心肌收縮中起重要作用。正常人血液中cTnl的含量一般低于0.3μ g/L，由于分子量不大，當(dāng)心肌嚴(yán)重缺血導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜的完整性被破壞時(shí)，cTn極易釋放入血，胸痛發(fā)作4~6h升高，增高可持續(xù)4~9d，由于心肌肌鈣蛋白僅存在于心肌收縮肌上，因此，它是評(píng)價(jià)心肌壞死的首選標(biāo)志物，是檢測(cè)心肌損傷的金標(biāo)準(zhǔn)。目前，心肌肌鈣蛋白主要用于心肌缺血損傷的臨床診斷、危險(xiǎn)性評(píng)估和預(yù)后判斷。
[0020]脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2主要發(fā)生在AMI早期，該三聯(lián)試劑盒側(cè)重于AMI的早期預(yù)警。脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2 (Lp-PLA2)是磷酸脂酶A2超家族中的非鈣離子依賴型磷酸脂酶，最初發(fā)現(xiàn)其可以降解血小板活化因子，曾被稱為血小板活化因子乙酰水解酶。Lp-PLA2經(jīng)成熟的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞合成和分泌，并受炎性介質(zhì)的調(diào)節(jié)，主要與低密度脂蛋白LDL結(jié)合，能水解血小板活化因子使之失去活性，又能水解低密度脂蛋白上的氧化卵磷脂，生成促炎物質(zhì)溶血卵磷脂和氧化游離脂肪酸，因此具有促炎癥和促動(dòng)脈粥樣硬化的作用。眾多研究顯示，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的炎癥發(fā)展到嚴(yán)重程度，并將要或者已經(jīng)出現(xiàn)血管內(nèi)腔破裂時(shí)，Lp-PLA2將會(huì)被大量釋放入使其血液內(nèi)的水平會(huì)大幅提高，因此Lp-PLA2的血液濃度與粥樣斑塊的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)性，而獨(dú)立于疾病相關(guān)的任何其他危險(xiǎn)因子，因而成為不可被取代的，直接監(jiān)測(cè)疾病的演變過(guò)程和危險(xiǎn)性的最佳的動(dòng)態(tài)檢測(cè)指標(biāo)，尤其對(duì)于心肌梗塞的發(fā)生，具有相當(dāng)關(guān)鍵意義的預(yù)警提示作用。
[0021]本發(fā)明所述試劑盒，其特征在于試劑盒可以同時(shí)檢測(cè)MP0、FABP3及CRP或cTnl或Lp-PLA2，針對(duì)心肌梗塞發(fā)生、發(fā)展全程進(jìn)行預(yù)警、診斷和監(jiān)控。
[0022]本發(fā)明所述試劑盒，其特征在于通過(guò)免疫方法將MPO抗體、FABP3抗體及CRP抗體或cTnl抗體或Lp-PLA2抗體同時(shí)包被于一條或三條試紙條上，同步進(jìn)行檢測(cè)，避免了時(shí)間和空間上的差異，使得檢測(cè)數(shù)據(jù)和臨床判斷更具科學(xué)性。
[0023]本發(fā)明所述試劑盒，其特征在于試劑盒由試紙卡、比色卡或膠體金定量讀數(shù)儀構(gòu)成。具有全程定量或半定量檢測(cè)能力、操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，在病人發(fā)生胸痛時(shí)可在15分鐘內(nèi)快速預(yù)測(cè)其心肌梗塞的風(fēng)險(xiǎn)，避免因誤診或是漏診引起急性心梗事件。
[0024]本發(fā)明所述試紙卡結(jié)構(gòu)為:在塑料底板(I) 一端粘貼上樣墊(2)，上樣墊的一端緊密壓接含有標(biāo)記抗人髓過(guò)氧化物酶特異性抗體、心臟脂肪酸結(jié)合蛋白特異性抗體及C反應(yīng)蛋白或肌鈣蛋白或脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠體金墊(3)，膠體金墊一端緊密壓接硝酸纖維素NC膜(4)，NC膜上包被有相互分離的檢測(cè)線T (5)、(6)、(7)和質(zhì)控線C (8)，檢測(cè)線分別為和標(biāo)記抗體配對(duì)的MPO抗體、FABP3抗體及CRP抗體或cTnl抗體或Lp-PLA2抗體，質(zhì)控線為抗鼠IgG抗體，硝酸纖維素膜的另一端連接吸樣墊(9)形成試紙，試紙裝入塑料卡內(nèi)形成試紙卡。
[0025]本發(fā)明試紙卡的抗體為高敏MP0、FABP3、CRP或cTnl或Lp-PLA2配對(duì)抗體，分別識(shí)別MPO、FABP3、CRP或cTnl或Lp-PLA2不同表位，抗體為純化的單克隆抗體或多克隆抗體。
[0026]本發(fā)明所述試紙卡的NC膜為孔徑5-12微米的多孔樣結(jié)構(gòu)膜，上樣墊為玻璃纖維膜或無(wú)紡布，吸樣墊由吸水濾紙構(gòu)成。
[0027]本發(fā)明比色卡是白色背景上印有三排系列不同深淺紅色線條的紙板，用于對(duì)檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比判定。MP0-FABP3-CRP試劑盒比色卡上每排不同深淺的紅色線條共7條，分別對(duì)應(yīng) 400、200、100、50、25、12.5,6.25ng/ml 的 MPO 濃度，200、100、50、25、12.5,6.25、
3.125ng/ml 的 FABP3 濃度，以及 16.0,8.0,4.0,2.0、1.0,0.50,0.25 μ g/mlCRP 濃度。MP0-FABP3-cTnI試劑盒比色卡上每排不同深淺的紅色線條共7條，分別對(duì)應(yīng)400、200、100、50,25,12.5,6.25ng/ml 的 MPO 濃度，200、100、50、25、12.5,6.25,3.125ng/ml 的 FABP3 濃度，以及 24.41、9.77、3.91、1.56、0.625、0.25、0.lng/ml 的 cTnl 濃度。MP0-FABP3_Lp-PLA2試劑盒比色卡上每排不同深淺的紅色線條共7條，分別對(duì)應(yīng)400、200、100、50、25、12.5、
6.25ng/ml 的 MPO 濃度，200、100、50、25、12.5、6.25、3.125ng/ml 的 FABP3 濃度，以及 300、275、250、225、200、175、150ng/ml 的 Lp-PLA2 濃度。[0028]所述膠體金定量讀數(shù)儀是一種光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，用于對(duì)檢測(cè)結(jié)果的定量判定，對(duì)MPO的檢測(cè)范圍為6.25?400ng/ml，對(duì)FABP3的檢測(cè)范圍是3.125?200ng/ml，對(duì)CRP的檢測(cè)范圍是0.25?16 μ g/ml,對(duì)cTnl的檢測(cè)范圍是0.1?24.41ng/ml,對(duì)Lp-PLA2的檢測(cè)范圍 150 ?300ng/ml。
[0029]所述試紙卡，NC膜抗體的包被過(guò)程為:以0.01MpH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)將MPO抗體、FABP3抗體及CRP抗體或cTnl抗體或Lp-PLA2抗體分別配制成0.5?2mg/ml的溶液，將抗鼠IgG配制0.5?3mg/ml的溶液，用噴膜儀在NC膜上部、中部和下部以1_1.5 μ 1/cm的參數(shù)進(jìn)行分別劃線，包被C、T線，劃線后將NC膜放置在溫度20?25°C，濕度小于30%的干燥間干燥2?5小時(shí)。
[0030]所述試紙卡，膠體金墊制備過(guò)程為:以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑為15?50nm的膠體金溶液，制備完成后取IOOml膠體金液放在燒杯內(nèi)，用0.2MK2C03調(diào)至PH8.0左右，分別加入三種0.5?3mg配對(duì)抗體至IOOml膠體金溶液中，室溫?cái)嚢?小時(shí)，加入終濃度為I %牛血清白蛋白，I %聚乙二醇20000封閉20min，12000r/m離心30分鐘，棄上清，用膠體金工作液復(fù)溶至50ml，按Iml溶液鋪20cm2的比例均勻地鋪在玻璃纖維膜或無(wú)紡布上，再置干燥間(溫度20?25°C，濕度小于30% )干燥2?5小時(shí)，制成膠體金墊。
[0031]所述試紙卡的裝配過(guò)程為:在溫度20?25°C，濕度小于40%的干燥室內(nèi)，取塑料底板，將已包被的NC膜放置在塑料底板的中部粘貼，將膠體金墊裁切成合適的寬度，在NC膜T線一側(cè)搭接膠體金墊，搭膠體金墊的1/4粘貼，在膠體金墊另一側(cè)搭接粘貼上樣墊，搭膠體金墊的1/3粘貼；在NC膜C線一側(cè)搭接吸樣墊，搭吸樣墊的1/10粘貼；最后用裁剪機(jī)將貼好的塑料板切成3?5_寬的試紙條,再裝入塑料卡內(nèi)，形成試紙卡。
[0032]所述試劑盒，檢測(cè)方法為:
[0033]I)將檢測(cè)試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡，平放；
[0034]2)精確吸取10 μ I血清、血漿樣本，樣本為全血時(shí)吸取20 μ I，加入潔凈的離心管中，再用樣本稀釋液(生理鹽水或PBS)進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)浞只靹颍?br> [0035]3)用移液槍吸取10μ I稀釋后的樣本加入到樣本孔中，再立即在下部的緩沖液孔中加入100 μ L樣本稀釋液，15?20分鐘內(nèi)用膠體金定量讀數(shù)儀或比色卡(半)定量判定
結(jié)果;
[0036]4)儀器判定時(shí)，設(shè)置好儀器相關(guān)參數(shù)后將試紙卡放入儀器內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，儀器將顯示出樣品濃度的定量測(cè)定結(jié)果；
[0037]5)用比色卡判定結(jié)果時(shí)，將試紙卡T線的顏色和比色卡上標(biāo)準(zhǔn)線的顏色深淺進(jìn)行對(duì)比，半定量判定樣品的濃度區(qū)間。
[0038]本發(fā)明專(zhuān)利的有益效果是:提供一種利用免疫層析膠體金技術(shù)制備的人髓過(guò)氧化物酶(MPO)、心臟脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP3)和任選的另一種心臟標(biāo)志物三聯(lián)快速定量免疫層析檢測(cè)試劑盒，定量檢測(cè)范圍寬，適合血清、血漿和全血樣本，并適合臨床上單人份檢測(cè)。具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于心肌梗塞的早期預(yù)警。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0039]圖1是心肌梗塞三聯(lián)快速定量檢測(cè)試劑盒的試紙條[0040]附圖符號(hào)說(shuō)明:
[0041]1:塑料底板；2:上樣墊；3:膠體金墊；4:NC膜；
[0042]5 =MPO檢測(cè)線T1 ；6:FABP3檢測(cè)線T2 ；7:另一種心臟標(biāo)志物檢測(cè)線T3 ；
[0043]8:質(zhì)控線(:；9:吸樣墊
具體實(shí)施方案
[0044]實(shí)施例1.MP0-FABP3-CRP三聯(lián)試劑盒的制備及檢測(cè)
[0045]I主要材料
[0046]1.1MPO, FABP3及CRP標(biāo)準(zhǔn)品:中檢所；MP0、FABP3及CRP特異性配對(duì)抗體、羊抗鼠IgG抗體:北京盛齊揚(yáng)桓科技有限公司產(chǎn)品；氯金酸:Sigma公司產(chǎn)品；硝酸纖維素(NC)膜:SART0RIUS(德國(guó))，CN140，德國(guó)賽多利斯公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇PEG20000、水解酪蛋白=Sigma產(chǎn)品；其它常用試劑均為分析純?cè)噭?br> [0047]1.2臨床樣本由公司在相關(guān)醫(yī)院獲得，共200份，其中血清樣本100份，血漿和全血樣本各50份，MPO、FABP3及CRP含量分布區(qū)間分別為6.25?400ng/ml、3.125?200ng/ml、0.25 ?16 μ g/ml。
[0048]2 方法
[0049]2.1MPO抗體、FABP3抗體及CRP抗體膠體金標(biāo)記氯金酸一檸檬酸三鈉還原法制備直徑為30?40nm的膠體金溶液，制備完成后取三份膠體金溶液，分別用0.2M K2CO3將溶液調(diào)到pH7.5、pH8.0和pH8.5。然后將溶液置于磁力攪拌器上緩慢攪拌，按每IOOml溶液加入
0.5mg、lmg、1.5mg將標(biāo)記用MPO抗體、FABP3抗體及CRP抗體緩慢滴加到膠體金溶液中，繼續(xù)攪拌2小時(shí)，再加入到終濃度為I %的PEG20000和I %的BSA進(jìn)行封閉20min，標(biāo)記結(jié)束后以12000r/m離心，棄上清，沉淀按50%原體積復(fù)溶至不同配比的膠體金工作液中(pH8.0,含BSA、羊血清、蔗糖和表面活性劑)。然后將標(biāo)記膠體金溶液按Iml溶液鋪20cm2的比例加樣于玻璃纖維膜或無(wú)紡布上，在溫度20?25°C,相對(duì)濕度< 30%的干燥間干燥2?5小時(shí)，制成膠體金墊。
[0050]2.2NC膜包被用0.01MpH7.4PBS將包被MPO抗體、FABP3抗體及CRP抗體稀釋成
0.5mg/ml、lmg/ml、l.5mg/ml，羊抗鼠IgG分別稀釋成lmg/ml、2mg/ml，然后用噴膜儀在NC膜上按1.2 μ Ι/cm進(jìn)行分別劃線包被，包被完成后將NC膜在溫度20?25°C，相對(duì)濕度<30%的干燥間干燥2?5小時(shí)。
[0051]2.3試紙卡組裝在干燥室內(nèi)，溫度20?25°C，濕度小于40%，取塑料底板，將已包被的NC膜放置在塑料底板的中部粘貼，將膠體金墊裁切成合適的寬度，在NC膜T線一側(cè)搭接膠體金墊，搭膠體金墊的1/4粘貼，在膠體金墊另一側(cè)搭接粘貼上樣墊，搭膠體金墊的1/3粘貼；在NC膜C線一側(cè)搭接吸樣墊，搭吸樣墊的1/10粘貼；最后用裁剪機(jī)將貼好塑料板切成3?5_寬的試紙條,再裝入塑料卡內(nèi)，形成試紙卡。
[0052]2.4試紙工藝參數(shù)調(diào)試將濃度不同標(biāo)記、包被的試劑進(jìn)行組合配對(duì)，制備小樣，利用MPO、FABP3及CRP標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)試劑進(jìn)行測(cè)試，尋找最佳組合。
[0053]2.5比色卡制備和儀器曲線參數(shù)設(shè)置確定好試紙工藝參數(shù)后，分別用400、200、100、50、25、12.5,6.25ng/ml 的 MPO 標(biāo)準(zhǔn)品;200、100、50、25、12.5,6.25,3.125ng/ml 的FABP3標(biāo)準(zhǔn)品及16.0,8.0,4.0,2.0、1.0,0.50,0.25 μ g/ml的CRP標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)試紙進(jìn)行測(cè)定，不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品顯示出不同強(qiáng)度色帶，將相應(yīng)強(qiáng)度的色帶印刷到比色卡上，完成比色卡制備；將相應(yīng)強(qiáng)度的色帶數(shù)字化后輸入膠體金定量讀數(shù)儀中，完成儀器曲線參數(shù)設(shè)置。
[0054]2.6檢測(cè)方法
[0055]I)將檢測(cè)試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡，平放；
[0056]2)精確吸取10 μ I血清、血漿樣本，樣本為全血時(shí)吸取20 μ I，加入潔凈的離心管中，用樣本稀釋液(PBS)進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)浞只靹颍?br> [0057]3)用移液槍吸取10 μ I稀釋后的樣本加入到樣本孔中，15?20分鐘內(nèi)用膠體金定量讀數(shù)儀或比色卡(半)定量判定結(jié)果；
[0058]4)儀器判定時(shí)，設(shè)置好儀器相關(guān)參數(shù)后將試紙卡放入倉(cāng)內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，儀器將顯示出樣品濃度的定量測(cè)定結(jié)果；
[0059]5)用比色卡判定結(jié)果時(shí)，將試紙卡T線的顏色和比色卡上標(biāo)準(zhǔn)線的顏色深淺進(jìn)行對(duì)比，半定量判定樣品的濃度區(qū)間。
[0060]2.7臨床樣本檢測(cè)試劑制備完成后，按檢測(cè)方法對(duì)所有臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，并分析檢測(cè)結(jié)果。
[0061]3 結(jié)果
[0062]3.1試紙參數(shù)確定根據(jù)小樣的檢測(cè)結(jié)果,確定了試紙的最佳標(biāo)記pH值為8.0 ；ΜΡ0抗體最佳標(biāo)記量為lmg/100ml膠體金溶液，F(xiàn)ABP3抗體的最佳標(biāo)記量為1.5mg/100ml, CRP抗體的最佳標(biāo)記量為1.5mg/100ml ;最佳的膠體金工作液為20mM硼酸鹽緩沖液，pH8.0，含1% BSA、10%羊血清、2%蔗糖、0.2% Tween20 ;最佳包被MPO抗體濃度為L(zhǎng) 5mg/ml, FABP3抗體濃度為1.5mg/ml, CRP抗體濃度為1.5mg/ml。檢測(cè)結(jié)果的最佳判定時(shí)間為15?20分鐘。但以上參數(shù)在制備不同批次產(chǎn)品時(shí)可能需要適當(dāng)調(diào)整。
[0063]3.2臨床樣本檢測(cè)對(duì)200份臨床定值樣本檢測(cè)，用儀器定量判定結(jié)果時(shí)，在檢測(cè)范圍內(nèi)的195份樣品平均偏差值均小于15%，最大偏差小于20%，R2X).97，一致性系數(shù)>0.88。用比色卡判定結(jié)果時(shí)，區(qū)間判定結(jié)果和樣本值的符合率為95.5%，一致性系數(shù)>0.85。檢測(cè)結(jié)果表明制備的檢測(cè)試劑盒性能良好，適合用于臨床檢測(cè)，滿足不同客戶不同檢測(cè)場(chǎng)合的差異化需要。
[0064]實(shí)施例2.MP0-FABP3-cTnI三聯(lián)試劑盒的制備
[0065]I主要材料
[0066]1.1MP0、FABP3及cTnl標(biāo)準(zhǔn)品:中檢所；MP0、FABP3及cTnl特異性配對(duì)抗體、羊抗鼠IgG抗體:北京盛齊揚(yáng)桓科技有限公司產(chǎn)品；氯金酸:Sigma公司產(chǎn)品；硝酸纖維素(NC)膜:SARTORIUS(德國(guó))，CN140，德國(guó)賽多利斯公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇PEG20000、水解酪蛋白=Sigma產(chǎn)品；其它常用試劑均為分析純?cè)噭?br> [0067]1.2臨床樣本由公司在相關(guān)醫(yī)院獲得，共200份，血清樣本100份，血漿和全血樣本各 50 份，MPO、FABP3 及 cTnl 含量分布區(qū)間分別為 6.25 ?400ng/ml、3.125 ?200ng/ml、
0.1?24.4lng/ml之間的定值血清。
[0068]2 方法
[0069]2.1MPO抗體、FABP3抗體及cTnl抗體膠體金標(biāo)記枸櫞酸三鈉-鞣酸混合還原劑制備直徑為15nm?20nm的膠體金溶液，制備完成后取三份膠體金，分別用0.2M K2CO3將溶液調(diào)到PH7.5、pH8.0和pH8.5。然后將溶液置于磁力攪拌器上緩慢攪拌，按每IOOml溶液加入0.5mg、lmg、l.5mg將標(biāo)記用MPO抗體、FABP3抗體及cTnl抗體緩慢滴加到膠體金溶液中，繼續(xù)攪拌2小時(shí)，再加入至終濃度為I %的PEG20000和I %的BSA進(jìn)行封閉20min，標(biāo)記結(jié)束后以12000r/m離心，棄上清，沉淀按50%原體積復(fù)溶至不同配比的膠體金工作液中(pH8.0,含BSA、羊血清、蔗糖和表面活性劑)。然后將標(biāo)記膠體金溶液按Iml溶液鋪20cm2的比例加樣于玻璃纖維膜或無(wú)紡布上，在溫度20~25°C，相對(duì)濕度< 30%的干燥間干燥2~5小時(shí),制成膠體金墊。
[0070]2.2NC膜包被用0.01MpH7.4PBS將包被MPO抗體、FABP3抗體及cTnl抗體稀釋成
0.5mg/ml、lmg/ml、l.5mg/ml，羊抗鼠IgG分別稀釋成lmg/ml、2mg/ml，然后用噴膜儀在NC膜上按1.2 μ Ι/cm進(jìn)行分別劃線包被，包被完成后將NC膜在溫度20~25°C，相對(duì)濕度< 30%的干燥間干燥2~5小時(shí)。
[0071]2.3試紙卡組裝在干燥室內(nèi)，溫度20~25°C，濕度小于40%，取塑底板，將已包被的NC膜放置在塑料底板的中部粘貼，將膠體金墊裁切成合適的寬度，在NC膜T線一側(cè)搭接膠體金墊，搭膠體金墊的1/4粘貼，在膠體金墊另一側(cè)搭接粘貼上樣墊，搭膠體金墊的1/3粘貼；在NC膜C線一側(cè)搭接吸樣墊，搭吸樣墊的1/10粘貼；最后用裁剪機(jī)將貼好塑料板切成3~5mm寬的試紙條,再裝入塑料卡內(nèi)，形成試紙卡。
[0072]2.4試紙工藝參數(shù)調(diào)試將濃度不同標(biāo)記、包被的試劑進(jìn)行組合配對(duì)，制備小樣，利用MPO、FABP3及cTnl標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)試劑進(jìn)行測(cè)試，尋找最佳組合。
[0073]2.5比色卡制備和儀器曲線參數(shù)設(shè)置確定好試紙工藝參數(shù)后，分別用400、200、100、50、25、12.5,6.25ng/ml 的 MPO 標(biāo)準(zhǔn)品;200、100、50、25、12.5,6.25,3.125ng/ml 的FABP3 標(biāo)準(zhǔn)品及 24.41,9.77,3.91、1.56,0.625,0.25,0.lng/ml cTnl 標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)試紙進(jìn)行測(cè)定，不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品顯示出不同強(qiáng)度色帶，將相應(yīng)強(qiáng)度的色帶印刷到比色卡上，完成比色卡制備；將相應(yīng)強(qiáng)度的色帶數(shù)字化后輸入膠體金定量讀數(shù)儀中，完成儀器曲線參數(shù)設(shè)置。
[0074]實(shí)施例3.MP0-FABP3-cTnI三聯(lián)試劑盒對(duì)肌鈣蛋白陰性和陽(yáng)性患者的血清檢測(cè)
[0075]隨機(jī)各抽取16份肌鈣蛋白指標(biāo)為陰性和陽(yáng)性的患者血清，按如下操作進(jìn)行:
[0076]1)將檢測(cè)試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡，平放；
[0077]2)精確吸取10 μ I血清樣本，加入潔凈的離心管中，再用樣本稀釋液(生理鹽水或PBS)進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)浞只靹颍?br> [0078]3)用移液槍吸取10 μ I稀釋后的樣本加入到樣本孔中，15~20分鐘內(nèi)用膠體金定量讀數(shù)儀或比色卡(半)定量判定結(jié)果，見(jiàn)下表1:
[0079]表1.MP0-FABP3-cTnI三聯(lián)試劑盒對(duì)肌鈣蛋白陰性和陽(yáng)性患者血清檢測(cè)結(jié)果
[0080]
【權(quán)利要求】
1.一種心肌梗塞三聯(lián)快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于試劑盒由心肌梗塞生物標(biāo)志物人髓過(guò)氧化物酶(MPO)、心臟脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP3)和其他任意一種心肌梗塞生物標(biāo)志物組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的心肌梗塞三聯(lián)快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于試劑盒由人髓過(guò)氧化物酶(MPO)、心臟脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP3)和高敏C反應(yīng)蛋白(hsCRP)組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒由人髓過(guò)氧化物酶(MPO)、心臟脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP3)和肌鈣蛋白(cTnl)組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒由人髓過(guò)氧化物酶(MPO)、心臟脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP3)和脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2 (Lp-PLA2)組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒采用膠體金固相免疫層析法制備，試劑盒由試紙卡、比色卡和或膠體金定量讀數(shù)儀構(gòu)成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于MP0、FABP3等三種檢測(cè)抗體包被在同一張?jiān)嚰垪l上或分別包被在三張?jiān)嚰垪l上。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于試紙卡結(jié)構(gòu)為:在塑料底板一端粘貼上樣墊，上樣墊的一端緊密壓接含有標(biāo)記抗體的膠體金墊，膠體金墊一端緊密壓接硝酸纖維素NC膜，NC膜上包被有相互分離的檢測(cè)線T和質(zhì)控線C，T線為和標(biāo)記抗體配對(duì)的抗體，C線為羊抗鼠IgG抗體，NC膜的另一端連接吸樣墊形成試紙，試紙裝入塑料卡內(nèi)形成試紙卡。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于比色卡為白色背景上印有系列不同深淺紅色線條，用于對(duì)檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比判斷及定量判斷，不同深淺紅色線條分別對(duì)應(yīng)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于膠體金定量讀數(shù)儀是一種光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，用于對(duì)檢測(cè)結(jié)果的定量判定。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于人髓過(guò)氧化物酶、心臟脂肪酸結(jié)合蛋白、高敏C反應(yīng)蛋白的檢測(cè)臨界值分別為:3ng/ml、3ng/ml、l.0ug/ml。
11.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于試劑盒由人髓過(guò)氧化物酶、心臟脂肪酸結(jié)合蛋白、和肌鈣蛋白的檢測(cè)臨界值分別為:3ng/ml、3ng/ml、0.lng/ml。
12.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于試劑盒由人髓過(guò)氧化物酶、心臟脂肪酸結(jié)合蛋白、和脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的檢測(cè)臨界值分別為:3ng/ml、3ng/ml、175ng/ml。
13.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的制備方法如下: 1)準(zhǔn)備好底板、樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜及吸水墊； 2)膠體金墊的制備:將標(biāo)記有MPO、FABP3、CRP或cTnl或Lp_PLA2的膠體金噴涂于玻璃纖維素膜或無(wú)紡布上，烘干備用； 3)包被膜制備:將與I)中標(biāo)記抗體配對(duì)的抗體稀釋成適合的濃度，噴涂于硝酸纖維素NC膜，烘干備用； 4)試紙制備:在底板上依次相互交錯(cuò)地粘上制備的樣品墊、膠體金墊、包被膜和吸水墊，按適合的尺寸切割成條，形成試紙條，試紙條裝入塑料卡內(nèi)，形成試紙卡。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的制備方法，其特征在于膠體金墊制備過(guò)程為:以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑為15~50nm的膠體金溶液,制備完成后取100mL膠體金液放在燒杯內(nèi)，用0.2M K2CO3調(diào)至pH8.0左右，分別加入三種0.5~2mg配對(duì)抗體至100mL膠體金溶液中，室溫?cái)嚢?小時(shí)，加入終濃度為I %牛血清白蛋白，I %聚乙二醇20000封閉20min, 12000r/m離心30分鐘，棄上清，用膠體金工作液復(fù)溶至50ml，按Iml溶液鋪20cm2的比例均勻地鋪在玻璃纖維膜或無(wú)紡布上，再置干燥間(溫度20~25°C，濕度小于30% )干燥2~5小時(shí),制成膠體金墊。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的制備方法，其特征在于NC膜抗體的包被過(guò)程為:以0.01MPH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)將MPO抗體、FABP3抗體及CRP抗體或cTnl抗體或Lp_PLA2抗體分別配制成0.5~3mg/ml的溶液,將抗鼠IgG配制0.5~2mg/ml的溶液,用噴膜儀在NC膜上部、中部和下部以1-1.5 μ gl/cm的參數(shù)進(jìn)行分別劃線，包被C、T線，劃線后將NC膜放置在溫度20~25°C,濕度小于30%的干燥間干燥2~5小時(shí)。
16.根據(jù)權(quán)利要求 5所述的試劑盒，臨床用于心肌梗塞風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)警和監(jiān)測(cè)。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103954778SQ201410217355
【公開(kāi)日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月22日
【發(fā)明者】胡文波, 楊軍, 李靜 申請(qǐng)人:江蘇金標(biāo)世紀(jì)生物科技有限公司, 胡文波, 楊軍