一種奶牛乳汁孕酮膠體金檢測試紙條及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種奶牛乳汁孕酮膠體金檢測試紙條及其制備方法，包括主要溶液的配制，包括制備檸檬酸三鈉溶液、制備氯金酸溶液、制備K2CO3溶液、制備PBS溶液、制備牛血清白蛋白(BSA)溶液、制備樣品墊處理液、制備金標(biāo)復(fù)溶液；膠體金的制備與鑒定，包括膠體金的制備、膠體金質(zhì)量鑒定、金標(biāo)孕酮抗體復(fù)合物的制備與純化、抗原包被液和金標(biāo)稀釋液的選擇、金標(biāo)抗體稀釋液選擇和稀釋度的選擇、NC膜的選擇和二抗包被濃度選擇、NC膜封閉液和封閉時(shí)間的選擇、樣品墊的選擇、膠體金試紙條的組裝。本發(fā)明的試紙條穩(wěn)定效果好，具有良好的穩(wěn)定性，靈敏性和敏感性均較高，利于臨床應(yīng)用，利于指導(dǎo)臨床的配種工作，能夠有效地指導(dǎo)工作人員對疾病的診斷、治療，提高受胎率。
【專利說明】-種奶牛乳汁孕鋼膠體金檢測試紙條及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生化領(lǐng)域，尤其涉及一種奶牛乳汁孕麗膠體金檢測試紙條及其制備方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 在實(shí)際生產(chǎn)中對奶牛妊娠檢測普遍依靠直腸檢查和B超檢查，直腸檢查的不確定 性和B超儀器的價(jià)格高昂成為了臨床應(yīng)用的弊端。孕麗是一種留體類激素，作為卵巢的指 示劑，監(jiān)測奶牛體內(nèi)分泌孕麗含量的變化能夠有效對妊娠情況和繁殖狀況進(jìn)行檢測，是進(jìn) 行早孕檢查和繁殖疾病監(jiān)測的一種有效方法。
[0003] 膠體金試紙條檢測方法具有易學(xué)、快速、方便、成本低、無需任何儀器設(shè)備條件和 所用試劑無毒害性等優(yōu)點(diǎn)，適合在實(shí)際生產(chǎn)當(dāng)中的各項(xiàng)要求。通過檢測奶牛乳汁中孕麗的 含量通過膠體金呈現(xiàn)出的顏色反應(yīng)變化，很直觀的判定出孕麗的濃度高低，判定出奶牛妊 娠情況。國外在奶牛早孕檢測方面已經(jīng)有很多類似的產(chǎn)品，并得到了很好的應(yīng)用。國內(nèi)對 奶牛孕麗檢測的研究也有很多相關(guān)的產(chǎn)品如試劑盒、傳感器和膠體金等。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種奶牛乳汁孕麗膠體金檢測試紙條的制備方法，旨在解 決在實(shí)際生產(chǎn)中對奶牛妊娠檢測普遍依靠直腸檢查和B超檢查，直腸檢查具有不確定性和 B超儀器的價(jià)格高昂的問題。
[0005] 本發(fā)明是該樣實(shí)現(xiàn)的，一種奶牛乳汁孕麗膠體金檢測試紙條的制備方法的制備方 法包括：
[0006] 步驟一、主要溶液的配制，包括制備巧樣酸H軸溶液、制備氯金酸溶液、制備K2CO3 溶液、制備PBS溶液、制備BSA溶液、制備樣品墊處理液、制備金標(biāo)復(fù)溶液；
[0007] 步驟二、膠體金的制備與鑒定，包括膠體金的制備、膠體金質(zhì)量鑒定、金標(biāo)孕麗抗 體復(fù)合物的制備與純化、抗原包被液和金標(biāo)稀釋液的選擇、金標(biāo)抗體稀釋液選擇和稀釋度 的選擇、NC膜的選擇和二抗包被濃度選擇、NC膜封閉液和封閉時(shí)間的選擇、樣品墊的選擇、 膠體金試紙條的組裝。
[0008] 進(jìn)一步，所述的主要溶液的配制的具體方法如下：
[0009] 制備巧樣酸H軸溶液：稱取Ig巧樣酸H軸和IOOmL加超純水，制備成濃度為1 % 的巧樣酸H軸溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配；
[0010] 制備氯金酸溶液；稱取Ig氯金酸，和超純水IOOmU制備成氯金酸溶液，4C保存；
[0011] 制備K2CO3溶液；稱取0. 1恥C〇3溶于100血超純水，制成K2CO3溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配； [001引 制備PBS溶液：將8. OQgNa化、0. 29巧&口04、0. 29巧化和2. 99徑化2冊04. 2&0混合， 加蒸觸水至1000血，將抑值調(diào)至7. 4 ;
[001引制備BSA溶液；稱取5g的BSA加入100血超純水，充分溶解；
[0014]制備樣品墊處理液；含 1% (w/v)BSA，1% (w/v)PVP，0. 5% Tween-20 和 0. 02% (w/ V)疊氮軸的 Tris(0. 05M 抑=5. 5);
[0015] 制備金標(biāo)復(fù)溶液：含 20% (w/v)藏糖，1% (w/v)BSA，1% (w/v)PVP 和 0. 02% (w/ V)疊氮軸的 PBS (0. Ol5M 抑=7. 4)。
[0016] 進(jìn)一步，膠體金的制備的具體方法為：
[0017] 應(yīng)用巧樣酸H軸還原法巧引制備膠體金，操作步驟；將現(xiàn)配的1 %氯金酸溶液 1血，稀釋至100血（終濃度為0.01% )，用微波爐加熱至IOOC后，迅速向其中加入1 %巧 樣酸溶液2mU攬拌均勻，繼續(xù)加熱3min，直至溶液由灰黑色變成酒紅色時(shí)取出，繼續(xù)攬拌 lOmin，冷卻至室溫，用去離子水或超純水定容將所失水分補(bǔ)充至原體積，重復(fù)制備H到四 次，用一次性濾膜化22 y m)過濾后，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0018] 進(jìn)一步，膠體金質(zhì)量鑒定的具體方法為：
[0019] 直觀鑒定；肉眼觀察膠體金的顏色變化，看有無渾濁、是否透明、有無折光性和有 無凝膠；
[0020] 電鏡觀察；觀察膠體金顆粒大小、形態(tài)和密度；
[0021] 可見光譜觀察；在分光光度計(jì)0D400""至0D700""光譜范圍內(nèi)對膠體金溶液進(jìn)行掃 描，根據(jù)所得的數(shù)值判斷膠體金顆粒的直徑與最大吸收波長之間的關(guān)系，評價(jià)膠體金溶液 的質(zhì)量；
[0022] 穩(wěn)定性鑒定；將膠體金溶液放置于室溫、4C和37C分別存放2化，觀察其凝聚情 況。
[0023] 進(jìn)一步，金標(biāo)孕麗抗體復(fù)合物的制備與純化的具體方法為：
[0024] 單克隆抗體的除鹽；標(biāo)記前的單克隆抗體應(yīng)徹底除鹽，具體方法；將抗體溶液用 PBS溶液（pH = 7. 4) 4°C透析過夜，4°C離也Ih (15000巧m)，抽取上清去除沉淀，4°C保存?zhèn)?用；
[00巧]確定膠體金最適蛋白標(biāo)記量：通過Mey氏穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)確定膠體金最適蛋白標(biāo)記 量，具體方法；取2mL離也管7個(gè)，分別編號(hào)，分別加入ImL膠體金溶液，由10 y g/mL-60 y g/ mL加入逐級稀釋后的孕麗抗體蛋白溶液，其中一管為空白對照，室溫穩(wěn)定5分鐘后，分別向 各管加入0. ImL的10%氯化軸溶液。將上述溶液搖勻后，靜止化，最后觀察結(jié)果；
[0026] 紫外分光光度計(jì)確定最適抗體標(biāo)記量；將配置溶液靜置化，500化pm離也比，測定 溶液在520nm下的吸光度值；OD值為垂直縱坐標(biāo)，抗體蛋白用量為水平橫坐標(biāo)繪制曲線；
[0027] 膠體金標(biāo)記抗體最適抑值的測定；膠體金溶液對抑計(jì)電極有損害，本研究中關(guān)于 膠體金溶液抑值的測定使用抑試紙，確定膠體金標(biāo)記抗體的最適抑值；
[0028] 膠體金標(biāo)記抗體方法；稱取膠體金溶液置于錐形瓶，稱量100血的0. lmol/LK2C03 或0. Imol/L的肥1溶液將膠體金溶液的抑值調(diào)整至8. 6 ;加入48 y g/mL孕麗單克隆抗體 溶液48 y L逐滴加入，邊加邊攬拌，加完后再繼續(xù)攬拌30min ;再加入5%陽G2000溶液，最 終濃度為1%，再攬拌30min;
[0029] 金標(biāo)抗體復(fù)合物純化：采用離也純化法純化金標(biāo)孕麗抗體，4°C條件下W 2, 00化/ min低速離也比，棄去沉淀；將上清液再次1500化/min高速離也比，棄上清；之后4°C條 件下18, OOOr/min離也比，反復(fù)離也兩次；最后將沉淀用金標(biāo)抗體稀釋液稀釋為原體積的 10 %，置于4C冰箱備用。
[0030] 進(jìn)一步，抗原包被液和金標(biāo)稀釋液的選擇的具體方法為：
[0031] 抗原包被稀釋液選擇：
[0032] A 溶液；0. Olmol/L 的 PBS (pH = 7. 4);
[003引 B溶液；0. Olmol/L的Tris-鹽酸緩沖液仰巧（pH = 7. 4);
[0034] C溶液；0. Olmol/L的碳酸鹽緩沖液（pH = 9. 6);
[00對 D溶液；0. Olmol/L的碳酸鹽緩沖液（pH = 9. 0);
[0036] E 溶液；0. Olmol/L 的 TBS (pH = 9. 0);
[0037] 抗原分別用A、B、C、D和E五種不同配方的包被液將包被抗原P4-OVA分別稀釋到 每毫升內(nèi)含有0. lmg、0. 3mg、0. 5mg和Img的抗原。之后在NC膜上點(diǎn)樣.室溫自然干燥，滴 加純化后的金標(biāo)抗體，水平放置5min后.用洗涂液充分沖洗，觀察五種溶液的顯色情況；
[0038] P4抗原包被條件的確定：
[0039] 將包被抗原 P4-0VA 稀釋到 0. Img/血、0. 5mg/血、Img/血、1. 5mg/mL 和 2mg/mL,分別 在NC膜上點(diǎn)樣，做為控制線（T線），室溫下自然干燥，將W上不同稀釋倍數(shù)的金標(biāo)抗體的金 標(biāo)墊和包被有不同濃度的競爭抗原的NC膜進(jìn)行組合，陰性樣品測試觀察比較檢測線（C線） 和T線的顯色情況，W此來確定競爭抗原的最佳包被濃度。
[0040] 進(jìn)一步，金標(biāo)抗體稀釋液選擇和稀釋度的選擇的具體方法為：
[0041] 金標(biāo)抗體稀釋液 A ;PBS0. Olmol/L，抑=7. 4(含 0. 1 % 陽G20000、0. 1 % BSA); 2.5.2金標(biāo)抗體稀釋液BTBS0.01mol/L，抑 = 8.0(含0.1%BSA、2%藏糖和0.02%NaN3);
[0042] 金標(biāo)抗體稀釋液 C PB0. 01mol/L，pH = 7. 4(含 0. 1% PEG2000、2%藏糖和 0. 02% NaNg)；
[0043] 將純化后的金標(biāo)抗體復(fù)合物經(jīng)高速離也得到的濃縮金標(biāo)抗體，用金標(biāo)抗體稀釋液 A、B和C分別作2 X、4X稀釋后，吸附于NC膜上，干燥后組裝成試紙條，觀察膠體金顯色情 況和金水分離情況W比較其結(jié)果。
[0044] 進(jìn)一步，NC膜的選擇和二抗包被濃度選擇
[0045] 用抗原包被液將二抗進(jìn)行梯度稀釋后，將其與幾種不同濃度的抗原溶液，分別在 NC膜上點(diǎn)樣，陰性和陽性的結(jié)果均顯色并清晰即；而可當(dāng)對照線不顯色時(shí)，視為失敗。
[0046] 進(jìn)一步，NC膜封閉液和封閉時(shí)間的選擇：
[0047] NC膜封閉液的選擇：
[0048] 封閉液A;0.01mol/L的PBST，抑=7.4(含10%小牛血清）；
[0049] 封閉液 B ;0. Olmol/L 的 TBS，抑=7. 4(含 3% BSA);
[0050] 封閉液 C ;0. Olmol/L 的 PBS，抑=7. 4(含 3% BSA)。
[0051] 在NC膜上包被孕麗完全抗原和羊抗鼠二抗后，分別用封閉液A、B和C進(jìn)行封閉， 封閉時(shí)間為20min，室溫自然干燥，之后滴加金標(biāo)孕麗抗體復(fù)合物，再用PBST洗涂液充分沖 洗后，觀察NC膜層析情況及檢測線的顯色情況。
[0052] 封閉時(shí)間的確定：
[0053] 在NC膜上包被孕麗完全抗原后，封閉液封閉后分別在自然室溫和37C條件下賠 育，時(shí)間分別為l〇min、30min和60min,觀察檢測線的顯色情況。
[0054] 進(jìn)一步，樣品墊的選擇的具體方法為：
[00巧]分別采用GF-06和GF-08兩種樣品墊組裝試紙條后，滴加等量PBS溶液，比較在 15s時(shí)間內(nèi)溶液在樣品墊上的吸收和擴(kuò)散情況；
[0056] 進(jìn)一步，膠體金試紙條的組裝的具體方法為：
[0057] 步驟一、準(zhǔn)備工作；將最佳包被濃度的競爭性孕麗抗原溶液和二抗溶液噴涂在NC 膜上，分別做為T線和C線，經(jīng)自然干燥，將最佳濃度的金標(biāo)孕麗抗體噴涂到已經(jīng)剪裁好的 金標(biāo)墊玻璃纖維膜上，4C干燥備用；
[0058] 步驟二、試紙條組裝：試紙條由2cm的玻璃纖維膜、0. 8cm的金標(biāo)墊、2cm的吸水紙 和2. 5cm的硝酸纖維素膜組成。將上述物質(zhì)依次包被于抗原帶和二抗帶等相應(yīng)部位，4C冰 箱保存?zhèn)溆谩?br> [0059] 效果匯總
[0060] 本發(fā)明的試紙條穩(wěn)定效果較好，對特異性和敏感性均達(dá)到了 85% W上，且在臨床 中數(shù)分鐘即可讀取結(jié)果，能夠及時(shí)準(zhǔn)確地檢測奶牛的妊娠情況，能在4C下保存2個(gè)月，具 有良好的穩(wěn)定性，靈敏性和敏感性均較高，利于臨床應(yīng)用，可W對處于黃體期的奶牛進(jìn)行確 診，利于指導(dǎo)臨床的配種工作，對患有持久黃體和黃體囊腫疾病奶牛的乳汁樣品進(jìn)行有效 地檢測，提高了臨床對上述兩種疾病的檢測效率，能夠有效地指導(dǎo)工作人員對此類疾病的 診斷、治療，也能夠有效地指導(dǎo)配種，提高受胎率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0061] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的奶牛乳汁孕麗膠體金檢測試紙條的制備方法的制備 方法流程圖；
[0062] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的膠體金溶液膠體金溶液的紫外波長曲線；
[0063] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的紫外分光光度計(jì)測定最佳蛋白濃度結(jié)果；
[0064] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的最佳標(biāo)記抑值確定結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0065] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，W下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用W解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0066] 在本發(fā)明實(shí)施例中，材料與主要溶液配制如下：
[0067] 主要儀器設(shè)備：
[0068] 96孔可拆酶標(biāo)板購自Costar公司；超純水制備裝置購自美國LABC0NC0公司； T肥-82A恒溫水浴鍋購自榮華儀器設(shè)備廠；TECAN酶標(biāo)儀購自美國SUNRISE公司；聚丙己帰 酶聯(lián)反應(yīng)板購自丹麥NUNC公司；旋潤混合器購自上海滬西分析儀器廠；透析袋DM25購自 上海生工生物工程公司；紫外分光光度計(jì)購自上海精密科學(xué)儀器公司；町-3型磁力攬拌器 購自江蘇金壇國華儀器廠；微型空氣壓縮機(jī)和細(xì)菌濾器，購自浙江紹興微型醫(yī)療設(shè)備有限 公司；XHF-I內(nèi)切式組織分散器購自寧波新芝生物科技股份公司；TCLklSG高速冷凍離也 機(jī)購自太倉市醫(yī)療器械公司；單道、多道移液器，購自美國化Pdo計(jì)公司。
[006引 主要試劑：
[0070] 孕麗單克隆抗體和孕麗完全抗原均為實(shí)驗(yàn)室自制；TMB購自Sigma公司；四甲基聯(lián) 苯胺（TMB)、BSA購自Sigma公司；吐溫-20 (Tween-20)購自華美生物工程公司；標(biāo)記二抗 羊抗鼠IgG、卵清蛋白（Ova化umin，OVA) ,Sigma公司；DMEM培養(yǎng)液購自Gibco B化公司；胎 牛血清購自杭州四季青生物工程材料公司；考馬斯亮藍(lán)G-250(Coomassie化illiant Blue G250)購自瑞± Fhika公司；無水己醇、辛酸、無水己酸軸、硫酸饋、甲醇、二氧化娃、石蠟、二 氧化娃和陽G20000等均為國產(chǎn)分析純或優(yōu)級純試劑；玻璃纖維素膜、PVC板、MAX線、吸水 紙和硝酸纖維素膜等耗材，購自于上海捷寧生物科技有限公司。
[0071] 本發(fā)明是該樣實(shí)現(xiàn)的，一種奶牛乳汁孕麗膠體金檢測試紙條的制備方法的制備方 法包括：
[0072] SlOl ;主要溶液的配制，包括制備巧樣酸H軸溶液、制備氯金酸溶液、制備K2CO3溶 液、制備PBS溶液、制備BSA溶液、制備樣品墊處理液、制備金標(biāo)復(fù)溶液；
[0073] S102;膠體金的制備與鑒定，包括膠體金的制備、膠體金質(zhì)量鑒定、金標(biāo)孕麗抗體 復(fù)合物的制備與純化、抗原包被液和金標(biāo)稀釋液的選擇、金標(biāo)抗體稀釋液選擇和稀釋度的 選擇、NC膜的選擇和二抗包被濃度選擇、NC膜封閉液和封閉時(shí)間的選擇、樣品墊的選擇、膠 體金試紙條的組裝。
[0074] 進(jìn)一步，所述的主要溶液的配制的具體方法如下：
[007引制備巧樣酸H軸溶液：稱取Ig巧樣酸H軸和IOOmL加超純水，制備成濃度為1% 的巧樣酸H軸溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配；
[0076] 制備氯金酸溶液；稱取Ig氯金酸，和超純水IOOmU制備成氯金酸溶液，4C保存；
[0077] 制備K2CO3溶液；稱取0. 1恥C〇3溶于100血超純水，制成K2CO3溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配；
[0078] 制備PBS溶液：將8. OQgNa化、0. 29巧&口〇4、〇. 29巧化和2. 99徑化2冊〇4. 2&0混合， 加蒸觸水至1000血，將抑值調(diào)至7. 4 ;
[007引制備BSA溶液；稱取5g的BSA加入100血超純水，充分溶解；
[0080] 制備樣品墊處理液；含 1% (w/v)BSA，1% (w/v)PVP，0. 5% Tween-20 和 0. 02% (w/ V)疊氮軸的 Tris(0. 05M 抑=5. 5);
[0081] 制備金標(biāo)復(fù)溶液：含 20% (w/v)藏糖，1% (w/v)BSA，1% (w/v)PVP 和 0. 02% (w/ V)疊氮軸的 PBS (0. Ol5M 抑=7. 4)。
[0082] 進(jìn)一步，膠體金的制備的具體方法為：
[0083] 應(yīng)用巧樣酸H軸還原法制備膠體金，操作步驟；將現(xiàn)配的1 %氯金酸溶液ImU稀 釋至100血（終濃度為0. Ol % )，用微波爐加熱至100°C后，迅速向其中加入1 %巧樣酸溶液 2mU攬拌均勻，繼續(xù)加熱3min，直至溶液由灰黑色變成酒紅色時(shí)取出，繼續(xù)攬拌lOmin，冷 卻至室溫，用去離子水或超純水定容將所失水分補(bǔ)充至原體積，重復(fù)制備H到四次，用一次 性濾膜化22 y m)過濾后，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0084] 進(jìn)一步，膠體金質(zhì)量鑒定的具體方法為：
[0085] 直觀鑒定；肉眼觀察膠體金的顏色變化，看有無渾濁、是否透明、有無折光性和有 無凝膠；
[008引電鏡觀察；觀察膠體金顆粒大小、形態(tài)和密度；
[0087] 可見光譜觀察；在分光光度計(jì)0D400""至0D700""光譜范圍內(nèi)對膠體金溶液進(jìn)行掃 描，根據(jù)所得的數(shù)值判斷膠體金顆粒的直徑與最大吸收波長之間的關(guān)系，評價(jià)膠體金溶液 的質(zhì)量；
[0088] 穩(wěn)定性鑒定；將膠體金溶液放置于室溫、4C和37C分別存放2化，觀察其凝聚情 況。
[0089] 進(jìn)一步，金標(biāo)孕麗抗體復(fù)合物的制備與純化的具體方法為：
[0090] 單克隆抗體的除鹽；標(biāo)記前的單克隆抗體應(yīng)徹底除鹽，具體方法；將抗體溶液用 PBS溶液（pH = 7. 4) 4°C透析過夜，4°C離也Ih (15000巧m)，抽取上清去除沉淀，4°C保存?zhèn)?用；
[0091] 確定膠體金最適蛋白標(biāo)記量：通過Mey氏穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)確定膠體金最適蛋白標(biāo)記 量，具體方法；如表1，取2mL離也管7個(gè)，分別編號(hào)A-G，分別加入ImL膠體金溶液，由 10 U g/mL-60 y g/mL加入逐級稀釋后的孕麗抗體蛋白溶液，其中G管為空白對照，室溫穩(wěn)定 5分鐘后，分別向各管加入0. ImL的10%氯化軸溶液。將上述溶液搖勻后，靜止化，最后觀 察結(jié)果；
[0092] 表1最適標(biāo)記蛋白濃度

【權(quán)利要求】
1. 一種奶牛乳汁孕酮膠體金檢測試紙條的制備方法，其特征在于，所述的奶牛乳汁孕 酮膠體金檢測試紙條的制備方法包括： 步驟一、主要溶液的配制，包括制備檸檬酸三鈉溶液、制備氯金酸溶液、制備1(2〇)3溶 液、制備PBS溶液、制備BSA溶液、制備樣品墊處理液、制備金標(biāo)復(fù)溶液； 步驟二、膠體金的制備與鑒定，包括膠體金的制備、膠體金質(zhì)量鑒定、金標(biāo)孕酮抗體復(fù) 合物的制備與純化、抗原包被液和金標(biāo)稀釋液的選擇、金標(biāo)抗體稀釋液選擇和稀釋度的選 擇、NC膜的選擇和二抗包被濃度選擇、NC膜封閉液和封閉時(shí)間的選擇、樣品墊的選擇、膠體 金試紙條的組裝。
2. 如權(quán)利要求1所述的奶牛乳汁孕酮膠體金檢測試紙條的制備方法，其特征在于，所 述的主要溶液的配制的具體方法如下： 制備檸檬酸三鈉溶液：稱取lg檸檬酸三鈉和l〇〇mL加超純水，制備成濃度為1 %的檸 檬酸三鈉溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配； 制備氯金酸溶液：稱取lg氯金酸，和超純水l〇〇mL，制備成氯金酸溶液，4°C保存； 制備K2C03溶液：稱取0. lgK2C03溶于100mL超純水，制成K2C03溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配； 制備 PBS 溶液：將 8. 09gNaCL、0. 29gKH2P04、0. 29gKCL 和 2. 99gNa2HP04. 2H20 混合，加蒸 餾水至l〇〇〇mL，將pH值調(diào)至7. 4 ; 制備BSA溶液：稱取5g的BSA加入100mL超純水，充分溶解； 制備樣品墊處理液：含 1% (w/v)BSA，l% (w/^PVTSO.S^iTween-ZO 和 0.02% (w/v) 疊氮鈉的 Tris(0. 05M pH = 5· 5); 制備金標(biāo)復(fù)溶液：含 20% (w/v)鹿糖，1% (w/v)BSA，l% (w/v)PVP 和 0. 02% (w/v)疊 氮鈉的 PBS(0. 015M pH = 7. 4)。
3. 如權(quán)利要求1所述的奶牛乳汁孕酮膠體金檢測試紙條的制備方法，其特征在于，膠 體金的制備的具體方法為： 應(yīng)用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，操作步驟：將現(xiàn)配的1 %氯金酸溶液lmL，稀釋至 100mL (終濃度為0. 01 % )，用微波爐加熱至100°C后，迅速向其中加入1 %檸檬酸溶液2mL， 攪拌均勻，繼續(xù)加熱3min，直至溶液由灰黑色變成酒紅色時(shí)取出，繼續(xù)攪拌10min，冷卻至 室溫，用去離子水或超純水定容將所失水分補(bǔ)充至原體積，重復(fù)制備三到四次，用一次性濾 膜（0.22 μ m)過濾后,4°C保存?zhèn)溆谩?br> 4. 如權(quán)利要求1所述的奶牛乳汁孕酮膠體金檢測試紙條的制備方法，其特征在于，膠 體金質(zhì)量鑒定的具體方法為： 直觀鑒定：肉眼觀察膠體金的顏色變化，看有無渾濁、是否透明、有無折光性和有無凝 膠； 電鏡觀察：觀察膠體金顆粒大小、形態(tài)和密度； 可見光譜觀察：在分光光度計(jì)0D400?至0D700?光譜范圍內(nèi)對膠體金溶液進(jìn)行掃描， 根據(jù)所得的數(shù)值判斷膠體金顆粒的直徑與最大吸收波長之間的關(guān)系，評價(jià)膠體金溶液的質(zhì) 量； 穩(wěn)定性鑒定：將膠體金溶液放置于室溫、4°C和37°C分別存放24h，觀察其凝聚情況。
5. 如權(quán)利要求1所述的奶牛乳汁奶牛乳汁孕酮膠體金檢測試紙條的制備方法，其特征 在于，金標(biāo)孕酮抗體復(fù)合物的制備與純化的具體方法為： 單克隆抗體的除鹽：標(biāo)記前的單克隆抗體應(yīng)徹底除鹽，具體方法：將抗體溶液用PBS溶 液（pH = 7.4)4°C透析過夜，4°C離心lh(15000rpm)，抽取上清去除沉淀，4°C保存?zhèn)溆茫?確定膠體金最適蛋白標(biāo)記量：通過Mey氏穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)確定膠體金最適蛋白標(biāo)記量，具 體方法：取2mL離心管7個(gè)，分別編號(hào)，分別加入lmL膠體金溶液，由10 μ g/mL-60 μ g/mL加 入逐級稀釋后的孕酮抗體蛋白溶液，其中一管為空白對照，室溫穩(wěn)定5分鐘后，分別向各管 加入0. lmL的10%氯化鈉溶液。將上述溶液搖勻后，靜止2h，最后觀察結(jié)果； 紫外分光光度計(jì)確定最適抗體標(biāo)記量：將配置溶液靜置4h，5000rpm離心lh，測定溶液 在520nm下的吸光度值；OD值為垂直縱坐標(biāo)，抗體蛋白用量為水平橫坐標(biāo)繪制曲線； 膠體金標(biāo)記抗體最適pH值的測定：膠體金溶液對pH計(jì)電極有損害，本研究中關(guān)于膠體 金溶液pH值的測定使用pH試紙，確定膠體金標(biāo)記抗體的最適pH值； 膠體金標(biāo)記抗體方法：稱取膠體金溶液置于錐形瓶，稱量l〇〇mL的0. lmol/LK2C03或 0. lmol/L的HC1溶液將膠體金溶液的pH值調(diào)整至8. 6 ;加入48 μ g/mL孕酮單克隆抗體溶 液48 μ L，逐滴加入，邊加邊攪拌，加完后再繼續(xù)攪拌30min ;再加入5% PEG2000溶液，最終 濃度為1%，再攪拌30min ; 金標(biāo)抗體復(fù)合物純化：采用離心純化法純化金標(biāo)孕酮抗體，4°C條件下以2, 000r/min 低速離心lh,棄去沉淀；將上清液再次15000r/min高速離心lh,棄上清；之后4°C條件下 18, 000r/min離心lh，反復(fù)離心兩次；最后將沉淀用金標(biāo)抗體稀釋液稀釋為原體積的10%， 置于4°C冰箱備用。
6. 如權(quán)利要求1所述的奶牛乳汁孕酮膠體金檢測試紙條的制備方法，其特征在于，抗 原包被液和金標(biāo)稀釋液的選擇的具體方法為： 抗原包被稀釋液選擇： A 溶液：0· 01mol/L 的 PBS (pH = 7. 4); B 溶液：0· 01mol/L 的 Tris-鹽酸緩沖液（TBS) (pH = 7. 4); C溶液：0· 01m〇l/L的碳酸鹽緩沖液（pH = 9· 6); D溶液：0· 01m〇l/L的碳酸鹽緩沖液（pH = 9· 0); Ε 溶液：0· 01mol/L 的 TBS(pH = 9· 0); 抗原分別用A、Β、C、D和Ε五種不同配方的包被液將包被抗原P4-〇VA分別稀釋到每毫 升內(nèi)含有〇. lmg、0. 3mg、0. 5mg和lmg的抗原。之后在NC膜上點(diǎn)樣·室溫自然干燥，滴加純 化后的金標(biāo)抗體，水平放置5min后.用洗滌液充分沖洗，觀察五種溶液的顯色情況； P4抗原包被條件的確定： 將包被抗原 P4-0VA 稀釋到 0· lmg/mL、0. 5mg/mL、lmg/mL、l. 5mg/mL 和 2mg/mL，分別在 NC膜上點(diǎn)樣，做為控制線（T線），室溫下自然干燥，將以上不同稀釋倍數(shù)的金標(biāo)抗體的金標(biāo) 墊和包被有不同濃度的競爭抗原的NC膜進(jìn)行組合，陰性樣品測試觀察比較檢測線（C線） 和T線的顯色情況，以此來確定競爭抗原的最佳包被濃度。
7. 如權(quán)利要求1所述的奶牛乳汁孕酮膠體金檢測試紙條的制備方法，其特征在于，金 標(biāo)抗體稀釋液選擇和稀釋度的選擇的具體方法為： 金標(biāo)抗體稀釋液 A :0· 01mol/L PBS，pH = 7. 4 (含 0· 1 % PEG20000、0. 1 % BSA); 金標(biāo)抗體稀釋液8:0.01111〇1/1了854!1 = 8.0(含0.1%854、2%蔗糖和0.02%似隊(duì)）； 金標(biāo)抗體稀釋液 C :ΡΒ0· 01mol/L，pH = 7. 4(含 0· 1 % PEG2000、2% 蔗糖和 0· 02% NaN3)； 將純化后的金標(biāo)抗體復(fù)合物經(jīng)高速離心得到的濃縮金標(biāo)抗體，用金標(biāo)抗體稀釋液A、B 和C分別作2 X、4X稀釋后，吸附于NC膜上，干燥后組裝成試紙條，觀察膠體金顯色情況和 金水分離情況以比較其結(jié)果。
8. 如權(quán)利要求1所述的奶牛乳汁孕酮膠體金檢測試紙條的制備方法，其特征在于，NC 膜的選擇和二抗包被濃度選擇 用抗原包被液將二抗進(jìn)行梯度稀釋后，將其與幾種不同濃度的抗原溶液，分別在NC膜 上點(diǎn)樣，陰性和陽性的結(jié)果均顯色并清晰即；而可當(dāng)對照線不顯色時(shí)，視為失敗。
9. 如權(quán)利要求1所述的奶牛乳汁孕酮膠體金檢測試紙條的制備方法，其特征在于，NC 膜封閉液和封閉時(shí)間的選擇： NC膜封閉液的選擇： 封閉液六：0.01111〇1/1的？851'，？!1=7.4(含10%小牛血清）； 封閉液 B :0· Olmol/L 的 TBS，pH = 7. 4(含 3% BSA); 封閉液 C :0· Olmol/L 的 PBS，pH = 7. 4(含 3% BSA)。 在NC膜上包被孕酮完全抗原和羊抗鼠二抗后，分別用封閉液A、B和C進(jìn)行封閉，封閉 時(shí)間為20min，室溫自然干燥，之后滴加金標(biāo)孕酮抗體復(fù)合物，再用PBST洗滌液充分沖洗 后，觀察NC膜層析情況及檢測線的顯色情況。 封閉時(shí)間的確定： 在NC膜上包被孕酮完全抗原后，封閉液封閉后分別在自然室溫和37°C條件下孵育，時(shí) 間分別為l〇min、30min和60min，觀察檢測線的顯色情況； 樣品墊的選擇的具體方法為： 分別采用GF-06和GF-08兩種樣品墊組裝試紙條后，滴加等量PBS溶液，比較在15s時(shí) 間內(nèi)溶液在樣品墊上的吸收和擴(kuò)散情況； 膠體金試紙條的組裝的具體方法為： 步驟一、準(zhǔn)備工作；將最佳包被濃度的競爭性孕酮抗原溶液和二抗溶液噴涂在NC膜 上，分別做為T線和C線，經(jīng)自然干燥，將最佳濃度的金標(biāo)孕酮抗體噴涂到已經(jīng)剪裁好的金 標(biāo)墊玻璃纖維膜上，4°C干燥備用； 步驟二、試紙條組裝：試紙條由2cm的玻璃纖維膜、0. 8cm的金標(biāo)墊、2cm的吸水紙和 2. 5cm的硝酸纖維素膜組成。將上述物質(zhì)依次包被于抗原帶和二抗帶等相應(yīng)部位，4°C冰箱 保存?zhèn)溆谩?br> 10. -種如權(quán)利要求1-9任意一項(xiàng)所述的奶牛乳汁孕酮膠體金檢測試紙條的制備方法 制備的奶牛乳汁孕酮膠體金檢測試紙條。
【文檔編號(hào)】G01N33/74GK104237538SQ201410319825
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年7月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月7日
【發(fā)明者】夏成, 吳凌, 徐闖, 鄭家三, 包凱, 孫雨航, 李穎, 許楚楚, 張洪友 申請人:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)