一種集成光干涉和散射信息分析的顯微成像系統(tǒng)及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種集成光干涉和散射信息分析的顯微成像系統(tǒng)，是基于共軸邁克爾孫干涉光路和米勞干涉裝置，樣品位于載物臺上，載物臺為一半透半反鏡，反射光束通過米勞干涉裝置在邁克爾孫干涉光路上產(chǎn)生干涉，由顯微鏡得到放大的干涉圖像，從圖像可以提取樣品的相位信息。同時，通過樣品的前向透射光束經(jīng)過半透半反鏡面后，產(chǎn)生前向小角和大角散射，該散射圖像可由前向CCD接收，從中可獲取前向散射幅值分布，由散射理論可以解構樣品的大小。本發(fā)明裝置通過集成相位和散射信息可更加準確地檢測樣品的形態(tài)結(jié)構，在透明物體顯微形態(tài)測量方面具有重要的實用價值，特別是在生物細胞亞結(jié)構形態(tài)的檢測應用領域。
【專利說明】一種集成光干涉和散射信息分析的顯微成像系統(tǒng)及方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物細胞原態(tài)顯微成像【技術領域】，具體涉及一種綜合接收和分析干涉 信息和散射信息的顯微成像系統(tǒng)。

【背景技術】
[0002] 大部分細胞雖然常常被認為是無色透明的，但是從嚴格意義上講，不可能是完全 透明的，即不可能是純相位物體，因此當光透過細胞后，光的振幅和相位都會發(fā)生改變，透 過細胞的光的振幅和相位都包含了細胞的信息。相位成像檢測技術從細胞對入射光波的相 位調(diào)制量中去獲取細胞的信息，而光散射檢測技術則是從細胞對入射光的振幅調(diào)制量入手 得到細胞的信息。因此從理論上說，相位成像檢測技術與光散射檢測技術研究的是透過細 胞的光信息的兩個方面，既相互獨立又相互聯(lián)系，互為補充。
[0003] 現(xiàn)有的大部分相位成像檢測技術都是基于干涉法，可實現(xiàn)物體的全場成像，不僅 其橫向空間分辨率高，一般只受衍射極限的限制，而且其軸向分辨率高，可達亞波長量級， 適用于無散射物體或弱散射物體的檢測。根據(jù)兩干涉光（物光波和參考光波）在記錄平 面是否存在夾角，可以分為同軸式和離軸式。典型的同軸定量相位成像技術包括Gabriel Popescu教授研究小組2004年提出并發(fā)展起來的傅立葉相位顯微技術（FPM)，由杜克大學 Adam Wax教授研究小組提出的平行同軸全息相位顯微術，等等，同軸定量相位成像技術具 有較好的穩(wěn)定性，能夠抑制一定的相位噪聲，但是一般需要多次測量；典型的離軸定量成像 技術包括希爾伯特相位顯微術（HPM)，衍射相位顯微術（DPM)，兩步相移雙通道干涉等等， 此類成像技術成像速度快，但是需要大的CCD空間寬帶。近年來，Adam Wax教授提出了輕 微離軸干涉（Slightly Off-Axis Interference),此技術介于離軸干涉與同軸干涉之間， 相比離軸干涉需要更小的CCD空間寬帶，相比同軸干涉需要更少的測量，優(yōu)化了空間分辨 率。2006年Gabriel Popescu教授研究小組提出衍射相位顯微術（DPM)，它結(jié)合了離軸光 路和共軸光路的優(yōu)點：具有較好的穩(wěn)定性和高的采集速率，但是由于光源的原因，衍射相 位顯微技術（DPM)的圖像存在散斑，這將會降低空間相位的敏感度，并限制了其在細胞亞 結(jié)構研究中的應用，2011年同樣是由Gabriel Popescu教授研究小組提出空間光干涉技 術（SLIM)采用白光作為光源克服了散斑效應，但是此技術需要為每個定量相位圖采集四 幅強度圖像。之后，2012年Gabriel Popescu研究小組提出用白光作光源的衍射相位顯 微技術（wDPM)，以及其 2014 年發(fā)表的專利技術 US 2014/0085715A1 (Diffraction phase microscopy with white light:白光光源的衍射相位顯微技術）實現(xiàn)了單次拍攝以及高的 時間和空間上的靈敏性。但是以上提及的技術都是獲取樣品的干涉信息，僅僅可檢測透明 相位體樣品，對樣品的亞結(jié)構尚存在檢測困難。
[0004] 光散射檢測技術一般不需要干涉，直接測量的是散射強度分布、散射能量分布或 光強的衰減等，它提供的信息是測量體積內(nèi)的平均值，平均化了單個成分對散射的貢獻，樣 品亞結(jié)構形態(tài)對其散射影響較大，所以在細胞大小測量方面有著重要的應用，如專利技術 W0 2014/084957 A1 (Optical system, apparatus and method for flow-cytometry:流式 細胞儀的光學系統(tǒng)，裝置和方法），但是，此類技術對于細胞形態(tài)變化的定量測量，只是從散 射方面分析，不涉及干涉信息。
[0005] 本發(fā)明主要針對上述兩類技術存在的不足，發(fā)明了可同時接收樣品光散射和相位 顯微信息的裝置，應用該裝置可根據(jù)不同模型和算法計算，最終可得到高精確度的細胞亞 結(jié)構形態(tài)結(jié)果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種集成光干涉和散射信息分析的顯微成像系統(tǒng)及方法， 使之能夠綜合分析物體的干涉信息和散射信息，更加精確地獲得物體的亞結(jié)構形態(tài)。
[0007] 為了解決以上技術問題，本發(fā)明采用的具體技術方案如下： 一種集成光干涉和散射信息分析的顯微成像系統(tǒng)，其特征在于包括：共軸邁克爾孫干 涉光路和米勞干涉裝置，具體為： 所述的米勞干涉裝置由第三透鏡（7)、反光鏡（8)、第二分光鏡（9)組成；經(jīng)過所述米 勞干涉裝置的圖像經(jīng)顯微鏡（14)放大后，由干涉圖像接收器即(XD-2 (16)接收為數(shù)字相位 圖像并由計算機（17)進行數(shù)值計算和處理； 所述的邁克爾孫干涉光路由光源（1)、第一分光鏡（6)、反光鏡（8)、第二分光鏡（9)、載 物臺（10)組成；還包括由第四透鏡（11)和第五透鏡（12)組成的透鏡擴束準直系統(tǒng)、散射 強度接收器即CCD-1 (13)、干涉圖像接收器即CCD-2 (16)、顯微鏡（14)、第六透鏡（15)、用于 對散射信息和相位信息進行采集存儲和處理的計算機（17); 所述載物臺（10)為一個角度可調(diào)的半透半反鏡，與反光鏡（8)夾角可調(diào)，可實現(xiàn)同軸、 離軸和輕微離軸干涉的光路調(diào)節(jié)； 所述的載物臺（10)是半透半反鏡，以保證經(jīng)過樣品的散射光可以透過載物臺向下傳 輸； 第一分光鏡（6)與水平面成45度夾角；第二分光鏡（9)的擺放位置保證使載物臺（10) 的反射光與反光鏡（8)的反射光所經(jīng)過的路程相等；反光鏡（8)放在第三透鏡（7)下面的 中心位置，其尺寸在能保證發(fā)生反射的基礎上越小越好。
[0008] 根據(jù)所述的一種集成光干涉和散射信息分析的顯微成像系統(tǒng)的顯微成像方法，其 特征在于包括以下步驟： 步驟一，使光源（1)的光束經(jīng)由第一透鏡（2)、視場光闌（3)、第二透鏡（4)、孔徑光闌 (5)組成的光束整形系統(tǒng)后，傳輸至第一分光鏡（6);所述第一分光鏡（6)的反射光通過第 三透鏡（7)傳輸?shù)降诙止忡R（9)，光束由第二分光鏡（9)分成兩部分：一部分反射到反光 鏡（8)上，一部分透射到樣品上；透射到樣品上的光束經(jīng)載物臺（10)時，一部分發(fā)生反射得 反射光，所述反射光再次通過樣品之后和反光鏡（8)的反射光相遇產(chǎn)生干涉，先后經(jīng)第三 透鏡（7)、第一分光鏡（6)、顯微鏡（14)和第六透鏡（15)，在CCD-2 (16)上形成顯微干涉圖 像；所述顯微干涉圖像經(jīng)計算機（17)處理后得到反映樣品形態(tài)結(jié)構的相位分布信息； 步驟二，利用第二分光鏡（9)透射到樣品上的光經(jīng)載物臺（10)時一部分光透過載物臺 (10)得透射光；所述透射光即包含樣品的散射信息，經(jīng)第四透鏡（11)、第五透鏡（12)組成 的透鏡擴束準直系統(tǒng)，所述散射信息由CCD-1 (13)接收為數(shù)字圖像并由計算機（17)進行數(shù) 值計算得散射強度并處理得反映樣品大小的散射幅值分布信息； 步驟三，計算機（17)對所述步驟一得到的干涉信息和步驟二得到的散射信息，基于散 射理論和相位成像理論開展計算，最終可獲得相位體樣品形態(tài)、結(jié)構和大小信息。
[0009] 本發(fā)明的工作原理如下： 由光源1發(fā)出的光束，向前傳輸經(jīng)由第一透鏡2、視場光闌3、第二透鏡4、孔徑光闌5 組成的光束整形系統(tǒng)后，傳輸至第一分光鏡6,所述第一分光鏡6的反射光繼續(xù)向下傳播， 經(jīng)第三透鏡7傳輸至第二分光鏡9,所述第二分光鏡9將光束分為兩部分，一部分反射到反 光鏡8上，一部分透射到樣品上：透射到樣品上的光一部分發(fā)生反射，這部分反射光和反光 鏡8的反射光在第二分光鏡9處相遇并發(fā)生干涉，之后經(jīng)第三透鏡7、第一分光鏡6、顯微鏡 14、第六透鏡15,由（XD-2 16接收顯微干涉圖樣；透射到樣品上的光還有一部分透過半透 半反鏡的載物臺，經(jīng)第四透鏡11、第五透鏡12組成的透鏡擴束準直系統(tǒng)，由（XD-1 13收集 樣品散射強度信息。最后計算機17對得到的干涉信息和散射信息，基于散射理論和相位成 像理論開展計算，最終可獲得高精確度的相位體樣品形態(tài)、結(jié)構和大小信息。
[0010] 本發(fā)明具有有益效果。本發(fā)明光源采用低相干白光源，提高分辨率，減少噪聲；本 發(fā)明采用共軸邁克爾孫干涉光路，提高了實驗的穩(wěn)定性；本發(fā)明載物臺為一角度可調(diào)的半 透半反鏡，能保證包含樣品散射信息的散射光可以透過載物臺繼續(xù)傳輸，并且與反光鏡角 度可調(diào)，可實現(xiàn)同軸、離軸和輕微離軸干涉的光路調(diào)節(jié)。本發(fā)利用CCD-1 13采集樣品散射 強度、CCD-2 16接收顯微干涉圖像，使計算機可以綜合分析散射信息和干涉信息，得到具有 高精確度的相位體樣品形態(tài)、結(jié)構和大小信息；本發(fā)明的顯微物鏡位于干涉系統(tǒng)之后，可減 少相位噪聲。因此，本發(fā)明系統(tǒng)應用面廣，具有很強的應用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1是本發(fā)明集成光干涉和散射信息分析的顯微成像系統(tǒng)對應的光路示意圖。
[0012] 圖中：1.光源；2.第一透鏡；3.視場光闌；4.第二透鏡；5.孔徑光闌；6.第一分 光鏡；7.第三透鏡；8.反光鏡；9.第二分光鏡；10.載物臺；11.第四透鏡；12.第五透鏡； 13. CCD-1 ;14.顯微鏡；15.第六透鏡；16. CCD-2 ;17.計算機。

【具體實施方式】
[0013] 下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明的技術方案做進一步詳細說明。
[0014] 本發(fā)明的集成光干涉和散射信息分析的顯微成像系統(tǒng)，是通過共軸邁克爾孫光路 和米勞干涉儀實現(xiàn)的，如圖1所示。
[0015] 由光源1發(fā)出的光束，向前傳輸經(jīng)第一透鏡2、視場光闌3、第二透鏡4、孔徑光闌 5組成的光束整形系統(tǒng)，到達第一分光鏡6,所述第一分光鏡6的反射光經(jīng)第三透鏡7傳輸 至第二反光鏡9,光束由第二分光鏡9分成兩部分，一部分反射到反光鏡8上，一部分透射 到樣品上：透射到樣品上的光一部分發(fā)生反射，這部分反射光和反光鏡8的反射光在第二 分光鏡9處相遇并發(fā)生干涉，之后經(jīng)第三透鏡7、第一分光鏡6、顯微鏡14、第六透鏡15,由 CCD-2 16接收顯微干涉圖像，并存儲在計算機17中；透射到樣品上的光還有部分透過半透 半反鏡的載物臺10繼續(xù)向下傳輸，經(jīng)第四透鏡11、第五透鏡12組成的透鏡擴束準直系統(tǒng)， 在CCD-1 13上采集散射強度，并存儲在計算機17中。最后計算機17根據(jù)得到的樣品顯微 干涉圖像和散射強度信息，基于散射理論和相位成像理論開展計算，最終可獲得相位體樣
【權利要求】
1. 一種集成光干涉和散射信息分析的顯微成像系統(tǒng)，其特征在于包括：共軸邁克爾孫 干涉光路和米勞干涉裝置，具體為： 所述的米勞干涉裝置由第三透鏡（7)、反光鏡（8)、第二分光鏡（9)組成；經(jīng)過所述米勞 干涉裝置的圖像經(jīng)顯微鏡（14)放大后，由干涉圖像接收器即(XD-2 (16)接收為數(shù)字相位圖 像并由計算機（17)進行數(shù)值計算和處理； 所述的邁克爾孫干涉光路由光源（1)、第一分光鏡（6)、反光鏡（8)、第二分光鏡（9)、載 物臺（10)組成；還包括由第四透鏡（11)和第五透鏡（12)組成的透鏡擴束準直系統(tǒng)、散射 強度接收器即CCD-1 (13)、干涉圖像接收器即CCD-2 (16)、顯微鏡（14)、第六透鏡（15)、用于 對散射信息和相位信息進行采集存儲和處理的計算機（17); 所述載物臺（10)為一個角度可調(diào)的半透半反鏡，與反光鏡（8)夾角可調(diào)，可實現(xiàn)同軸、 離軸和輕微離軸干涉的光路調(diào)節(jié)； 所述的載物臺（10)是半透半反鏡，以保證經(jīng)過樣品的散射光可以透過載物臺向下傳 輸； 第一分光鏡（6)與水平面成45度夾角；第二分光鏡（9)的擺放位置保證使載物臺（10) 的反射光與反光鏡（8)的反射光所經(jīng)過的路程相等；反光鏡（8)放在第三透鏡（7)下面的 中心位置，其尺寸在能保證發(fā)生反射的基礎上越小越好。
2. 根據(jù)權利要求所述的一種集成光干涉和散射信息分析的顯微成像系統(tǒng)的顯微成像 方法，其特征在于包括以下步驟： 步驟一，使光源（1)的光束經(jīng)由第一透鏡（2)、視場光闌（3)、第二透鏡（4)、孔徑光闌 (5)組成的光束整形系統(tǒng)后，傳輸至第一分光鏡（6);所述第一分光鏡（6)的反射光通過第 三透鏡（7)傳輸?shù)降诙止忡R（9)，光束由第二分光鏡（9)分成兩部分：一部分反射到反光 鏡（8)上，一部分透射到樣品上；透射到樣品上的光束經(jīng)載物臺（10)時，一部分發(fā)生反射得 反射光，所述反射光再次通過樣品之后和反光鏡（8)的反射光相遇產(chǎn)生干涉，先后經(jīng)第三 透鏡（7)、第一分光鏡（6)、顯微鏡（14)和第六透鏡（15)，在CCD-2 (16)上形成顯微干涉圖 像；所述顯微干涉圖像經(jīng)計算機（17)處理后得到反映樣品形態(tài)結(jié)構的相位分布信息； 步驟二，利用第二分光鏡（9)透射到樣品上的光經(jīng)載物臺（10)時一部分光透過載物臺 (10)得透射光；所述透射光即包含樣品的散射信息，經(jīng)第四透鏡（11)、第五透鏡（12)組成 的透鏡擴束準直系統(tǒng)，所述散射信息由CCD-1 (13)接收為數(shù)字圖像并由計算機（17)進行數(shù) 值計算得散射強度并處理得反映樣品大小的散射幅值分布信息； 步驟三，計算機（17)對所述步驟一得到的干涉信息和步驟二得到的散射信息，基于散 射理論和相位成像理論開展計算，最終可獲得相位體樣品形態(tài)、結(jié)構和大小信息。
【文檔編號】G01N21/45GK104122228SQ201410331575
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月14日 優(yōu)先權日:2014年7月14日
【發(fā)明者】季穎, 梁敏捷, 王亞偉, 徐媛媛 申請人:江蘇大學