一種用于測定重金屬鎘的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于測定重金屬鎘的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法，屬于重金屬免疫分析領(lǐng)域。一種用于測定重金屬鎘的膠體金免疫層析試紙條，它包括底板，底板上從左至右依次設(shè)置有樣品墊、膠體金結(jié)合墊、顯色區(qū)域和吸水區(qū)；膠體金結(jié)合墊為玻璃纖維素膜Ahlstrom8964；顯色區(qū)域包括測試線、控制線和硝酸纖維素膜載體，測試線、控制線、硝酸纖維素膜載體為硝酸纖維素膜制成的Millipore135膜。本發(fā)明基于Cd單克隆抗體的用于測定重金屬鎘的膠體金免疫層析試紙條，通過競爭法，定性/半定量測定樣品中金屬鎘的含量，可在3-5分鐘內(nèi)實現(xiàn)檢測，檢測更快速，檢測靈敏度可達到μg/L，操作簡便，可實現(xiàn)樣品中痕量重金屬鎘的快速篩查。
【專利說明】-種用于測定重金屬鎘的膠體金免疫層析試紙條及其制備 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于重金屬免疫分析領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種基于單克隆抗體的測定 重金屬鎘的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 重金屬污染物是對人類威脅最大的污染物之一，具有環(huán)境持久性、生物蓄積性和 三致效應(yīng)等特點，其在環(huán)境、食品、紡織品中的含量分布及可能存在的潛在危害一直倍受關(guān) 注。目前，傳統(tǒng)的重金屬檢測方法大多采用原子吸收法、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法、電 感耦合等離子體質(zhì)譜法等儀器方法。然而，這些借助儀器而進行的檢測方法雖然在精確度、 靈敏度方面具有一定的優(yōu)勢，但檢測儀器昂貴、操作技術(shù)復(fù)雜、測定時間較長，使其推廣普 及受到一定的限制。對于重金屬污染快速檢測技術(shù)，目前國內(nèi)外研究較多的有酶抑制法、酶 傳感器法和比色法等，但上述方法均有自己的缺點，難以實現(xiàn)快速篩查。因此，建立一種簡 單、快捷、安全的檢測方法對重金屬的分析研究與污染控制是非常必要的。
[0003] 近年來發(fā)展起來的重金屬免疫檢測法（ELISA)，克服了上述方法的缺點，利用抗原 抗體的特異性反應(yīng)實現(xiàn)可作為抗原或抗體的污染物的檢測，該方法檢測靈敏度高，特異性 強，目前已成功應(yīng)用于重金屬鎘、汞、鉛以及鋁的檢測。但是，ELISA法也有自身的缺陷，即 完成一批試樣的檢測仍至少需要3h，不能達到快速檢測的要求。在免疫檢測法基礎(chǔ)上發(fā)展 的同樣基于抗原抗體反應(yīng)的膠體金免疫層析試紙條法，很好彌補了 ELISA方法的缺陷，具 有迅速快捷、靈敏準(zhǔn)確、安全簡便、試劑穩(wěn)定和成本低廉等特點，可在l〇min內(nèi)判斷出污染 物的有無，亦可進行定量或半定量的測定，其敏感性與ELISA相比基本相近。
[0004] 將膠體金免疫層析試紙條法應(yīng)用于無機重金屬離子的檢測，基于重金屬單克隆抗 體，則可實現(xiàn)快速定性篩查和半定量檢測。但金屬離子是小分子物質(zhì)，既不具有免疫原性， 也不具有反應(yīng)原性，需要通過選擇合適的雙功能螯合劑螯合重金屬離子并與載體蛋白偶聯(lián) 合成完全抗原免疫動物從而獲得金屬特異性單克隆抗體。因此，高效價、高特異性單克隆抗 體的制備是制約免疫檢測技術(shù)的瓶頸。目前，本實驗室已成功制得重金屬鎘的單克隆抗體， 使得膠體金免疫層析試紙條法用于重金屬鎘的測定成為可能。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 1、發(fā)明要解決的技術(shù)問題
[0006] 針對現(xiàn)有技術(shù)將膠體金免疫層析試紙條法應(yīng)用于無機重金屬離子的檢測中存在 的難以制得重金屬鎘的單克隆抗體的問題，本發(fā)明提供一種用于測定重金屬鎘的膠體金免 疫層析試紙條及其制備方法，用以解決樣品中重金屬鎘的定性及半定量快速檢測，該試紙 條檢測耗時短、靈敏，性能可靠，操作簡單。
[0007] 2、技術(shù)方案
[0008] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)。
[0009] -種用于測定重金屬鎘的膠體金免疫層析試紙條，它包括底板，所述的底板上從 左至右依次設(shè)置有樣品墊、膠體金結(jié)合墊、顯色區(qū)域和吸水區(qū)；
[0010] 所述的膠體金結(jié)合墊為玻璃纖維素膜Ahlstrom8964 ;
[0011] 所述的顯色區(qū)域包括測試線、控制線和硝酸纖維素膜載體，所述的測試線、控制 線、硝酸纖維素膜載體為硝酸纖維素膜制成的Millip 〇rel35膜。
[0012] 優(yōu)選地，所述的免疫層析試紙條的寬度為4mm。
[0013] 優(yōu)選地，所述的底板為PVC板。
[0014] 一種所述的用于測定重金屬鎘的膠體金免疫層析試紙條的制備方法，其步驟為：
[0015] (A)將抗Cd-ITCBE單克隆抗體與納米膠體金顆粒結(jié)合形成帶抗體標(biāo)記的納米膠 體金，并噴涂在底板上形成膠體金結(jié)合墊；
[0016] (B)將抗原Cd-ITCBE-BSA包被在硝酸纖維素膜Milliporel35預(yù)先劃定的條帶上， 作為測試線（即T線）；
[0017] (C)將羊抗鼠 IgG二抗包被在硝酸纖維素膜Milliporel35預(yù)先劃定的條帶上，作 為控制線（即C線）；
[0018] (D)按從左至右的順序?qū)悠穳|、膠體金結(jié)合墊、包被有抗原的測試線、包被有二 抗的控制線以及吸水紙依次粘貼在所述的底板上，在膠體金結(jié)合墊的一端粘貼MAX線，組 裝成膠體金免疫層析試紙條；
[0019] 所述的吸水紙構(gòu)成硝酸纖維素膜載體；
[0020] 膠體金結(jié)合墊、包被有抗原的測試線、包被有二抗的控制線以及硝酸纖維素膜載 體構(gòu)成顯色區(qū)域，該底板上與硝酸纖維素膜載體相鄰的一端為吸水區(qū)。
[0021] 優(yōu)選地，在所述的免疫層析試紙條上，所述的納米膠體金顆粒的粒徑為10_20nm。
[0022] 優(yōu)選地，所述的抗Cd-ITCBE單克隆抗體，抗體包被濃度為5 X 104倍稀釋濃度。
[0023] 優(yōu)選地，所述的免疫層析試紙條包被原Cd-ITCBE-BSA，包被濃度為5 X 103倍稀釋 濃度，羊抗鼠 IgG二抗的包被濃度為5 X 103倍稀釋濃度。
[0024] 3、有益效果
[0025] 相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：
[0026] (1)本發(fā)明基于Cd單克隆抗體的用于測定重金屬鎘的膠體金免疫層析試紙條，通 過競爭法，定性/半定量測定樣品中金屬鎘的含量，可在3-5分鐘內(nèi)實現(xiàn)檢測，檢測更快速， 檢測靈敏度可達到μ g/L，操作簡便，靈敏可靠，可實現(xiàn)樣品中痕量重金屬鎘的快速篩查；
[0027] (2)本發(fā)明采用基于抗Cd-ITCBE的單克隆抗體的膠體金免疫層析試紙條對樣品 中重金屬鎘進行快速定性、半定量測試，可廣泛用于含重金屬鎘的水溶液樣品的分析測試 和快速篩查；
[0028] (3)現(xiàn)有技術(shù)中，高效價、高特異性單克隆抗體的制備是制約免疫檢測技術(shù)的瓶 頸。目前，本發(fā)明成功制得重金屬鎘的單克隆抗體，使得膠體金免疫層析試紙條法用于重金 屬鎘的測定成為可能。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0030] 圖中：1、樣品墊；2、膠體金結(jié)合墊；3、測試線；4、控制線；5、顯色區(qū)域；6、硝酸纖 維素膜載體；7、吸水區(qū)。

【具體實施方式】
[0031] 下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明作詳細描述。
[0032] 實施例1
[0033] 如圖1所示，測定重金屬鎘的膠體金免疫層析試紙條，它的主體為底板，底板上從 左至右依次設(shè)置有樣品墊1、膠體金結(jié)合墊2、顯色區(qū)域5和吸水區(qū)7。顯色區(qū)域5包括測試 線3、控制線4和硝酸纖維素膜載體6,所述的測試線3、控制線4、硝酸纖維素膜載體6為硝 酸纖維素膜制成的Milliporel35膜。免疫層析試紙條的寬度為4mm。底板為PVC板。
[0034] 該試紙的制備方法，步驟如下：
[0035] (A)將抗Cd-ITCBE單克隆抗體與納米膠體金顆粒（平均粒徑10_20nm)結(jié)合形成 帶抗體標(biāo)記的納米膠體金，并噴涂在底板上形成膠體金結(jié)合墊2 ;其中，抗Cd-ITCBE單克隆 抗體，抗體包被濃度為5 X 104倍稀釋濃度。
[0036] (B)將抗原Cd-ITCBE-BSA包被在硝酸纖維素膜Milliporel35預(yù)先劃定的條帶上， 作為測試線3 ;其中，所述的免疫層析試紙條包被原Cd-ITCBE-BSA，包被濃度為5 X 103倍 稀釋濃度。
[0037] (C)將羊抗鼠 IgG二抗包被在硝酸纖維素膜Milliporel35預(yù)先劃定的條帶上，作 為控制線4 ;其中，羊抗鼠 IgG二抗的包被濃度為5 X 103倍稀釋濃度。
[0038] (D)按從左至右的順序?qū)悠穳|1、膠體金結(jié)合墊2、包被有抗原的測試線3、包被 有二抗的控制線4以及硝酸纖維素膜載體6依次粘貼在所述的底板上，在膠體金結(jié)合墊2 的一端粘貼MAX線，組裝成膠體金免疫層析試紙條；
[0039] 硝酸纖維素膜載體6為。該底板上與硝酸纖維素膜載體6相鄰的一端為吸水區(qū)7。
[0040] 基于上述制的免疫層析試紙條，在使用時，首先，將含有不同濃度的Cd的標(biāo)準(zhǔn)溶 液與過量的EDTA螯合形成含鎘的標(biāo)準(zhǔn)樣品，滴于樣品墊1上，通過纖維膜的毛細管作用，樣 品流過自制Cd-ITCBE單克隆抗體標(biāo)記的膠體金結(jié)合墊2。對于測試線3 (T線）、控制線4 (C 線），通過在顯色區(qū)域5觀察試紙條顏色的變化，定性判斷樣品是否含有重金屬鎘以及半定 量分析樣品中重金屬鎘的含量。
[0041] 樣品與包被在T線上的Cd-ITCBE-BSA包被原競爭結(jié)合膠體金結(jié)合墊2上的單克 隆抗體-膠體金結(jié)合物，T線顏色的深淺與樣品中Cd含量成一定比例關(guān)系，從而確定膠體 金免疫層析試紙條快速測定重金屬Cd的檢測范圍與靈敏度；若樣品中分析物濃度很高，則 樣品的中Cd-EDTA完全與膠體金結(jié)合墊2上單克隆抗體-膠體金復(fù)合物結(jié)合，因此T線不 顯色；若樣品中分析物較低，則T線顏色與C線顏色相比較淺；若樣品中無分析物，則T線顏 色與C線顏色深淺相同；由此，可建立半定量/定性快速測定重金屬Cd的方法。
[0042] 本實施例基于Cd單克隆抗體的用于測定重金屬鎘的膠體金免疫層析試紙條，通 過競爭法，定性/半定量測定樣品中金屬鎘的含量，可在3-5分鐘內(nèi)實現(xiàn)檢測，檢測更快速， 檢測靈敏度可達到μ g/L，可實現(xiàn)樣品中痕量重金屬鎘的快速篩查。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于測定重金屬鎘的膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，它包括底板，所述的 底板上從左至右依次設(shè)置有樣品墊（1)、膠體金結(jié)合墊（2)、顯色區(qū)域（5)和吸水區(qū)（7); 所述的膠體金結(jié)合墊（2)為玻璃纖維素膜Ahlstrom8964; 所述的顯色區(qū)域（5)包括測試線（3)、控制線（4)和硝酸纖維素膜載體￠)，所述的測 試線（3)、控制線（4)、硝酸纖維素膜載體（6)為硝酸纖維素膜制成的Millip〇rel35膜。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于測定重金屬鎘的膠體金免疫層析試紙條，其特征在 于，所述的免疫層析試紙條的寬度為4mm。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于測定重金屬鎘的膠體金免疫層析試紙條，其特征在 于，所述的底板為PVC板。
4. 一種權(quán)利要求1所述的用于測定重金屬鎘的膠體金免疫層析試紙條的制備方法，其 步驟為： (A) 將抗Cd-ITCBE單克隆抗體與納米膠體金顆粒結(jié)合形成抗體標(biāo)記的納米膠體金，并 噴涂在底板上形成膠體金結(jié)合墊（2); (B) 將抗原Cd-ITCBE-BSA包被在硝酸纖維素膜Milliporel35預(yù)先劃定的條帶上，作為 測試線（3); (C) 將羊抗鼠 IgG二抗包被在硝酸纖維素膜Milliporel35預(yù)先劃定的條帶上，作為控 制線（4); (D) 按從左至右的順序?qū)悠穳|（1)、膠體金結(jié)合墊（2)、包被有抗原的測試線（3)、包 被有二抗的控制線（4)以及吸水紙依次粘貼在所述的底板上，在膠體金結(jié)合墊（2)的一端 粘貼MAX線，組裝成膠體金免疫層析試紙條； 所述的吸水紙構(gòu)成硝酸纖維素膜載體（6); 膠體金結(jié)合墊（2)、包被有抗原的測試線（3)、包被有二抗的控制線（4)以及硝酸纖維 素膜載體（6)構(gòu)成顯色區(qū)域（5)，該底板上與硝酸纖維素膜載體（6)相鄰的一端為吸水區(qū) ⑵。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于測定重金屬鎘的膠體金免疫層析試紙條的制備方法，其 特征在于，在所述的免疫層析試紙條上，所述的納米膠體金顆粒的粒徑為10_20nm。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的用于測定重金屬鎘的膠體金免疫層析試紙條的制備方 法，其特征在于，所述的抗Cd-ITCBE單克隆抗體，抗體包被濃度為5 X 104倍稀釋濃度。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于測定重金屬鎘的膠體金免疫層析試紙條的制備方法，其 特征在于，所述的免疫層析試紙條包被原Cd-ITCBE-BSA，包被濃度為5 X 103倍稀釋濃度， 羊抗鼠 IgG二抗的包被濃度為5 X 103倍稀釋濃度。
【文檔編號】G01N33/577GK104090110SQ201410360880
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月25日
【發(fā)明者】丁友超, 何歡, 王亞春, 孫成, 何重輝, 蔡建和 申請人:江蘇省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院, 南京大學(xué)