一種快速分析氨基酸混合物的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物分析【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種快速分析氨基酸混合物的方法，將待測(cè)氨基酸混合物用流動(dòng)相稀釋成供試品溶液，然后采用高效液相色譜法進(jìn)行氨基酸混合物的分析，色譜柱采用酰胺鍵合硅膠柱。該方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：1、同時(shí)方便的檢出多種氨基酸并能達(dá)到良好分離；2、分析靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、方法簡(jiǎn)便快捷，可用于氨基酸類物質(zhì)或含氨基酸雜質(zhì)的藥物的分析檢測(cè)；3、酰胺鍵合硅膠柱比氨基鍵合硅膠具有更低的背景噪音，有利于保護(hù)色譜柱，并且穩(wěn)定性良好；4、酰胺鍵合硅膠柱與氨基鍵合硅膠柱相比，價(jià)格低，降低分析成本；5、用酰胺柱進(jìn)行檢測(cè)所得峰的峰型較現(xiàn)有氨基色譜柱所出峰的峰型好。
【專利說明】一種快速分析氨基酸混合物的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物分析【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種使用高效液相色譜法快速分析氨基 酸混合物的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 氨基酸已廣泛應(yīng)用于食品、藥品中，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，有些藥物中常含有多種氨基酸， 各種氨基酸中有關(guān)物質(zhì)主要是其他氨基酸，目前采用的方法中多為薄層色譜法，定性和定 量都比較困難，尤其是其他氨基酸，含量在0. 1%左右時(shí)，薄層板上看不出雜質(zhì)斑點(diǎn)。氨基 酸比例多少直接影響了制劑的質(zhì)量，從而影響藥物的藥效。在色譜分離過程中，色譜柱、柱 溫、流速、流動(dòng)相的pH都會(huì)影響到色譜分離效果，例如：高柱溫、大流速都可能使出峰時(shí)間 提前，然而傳統(tǒng)硅膠色譜柱在高溫下工作會(huì)加快色譜柱的老化，縮短柱壽命，加大流速則會(huì) 使系統(tǒng)反壓升高，而通過改變梯度則要求在色譜柱、柱溫、流速等色譜條件相對(duì)固定的條件 下進(jìn)行，因此要能同時(shí)使多種氨基酸化合物在比較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到快速分離，色譜柱顯得 非常關(guān)鍵。
[0003] 酰胺鍵合硅膠色譜柱在反相條件下，可以有效的保留極性化合物，是一種嶄現(xiàn)出 比氨基柱更好的穩(wěn)定性，更好的分離效果，酰胺鍵合硅膠比氨基鍵合硅膠具有更低的背景 噪音。在現(xiàn)有的檢測(cè)氨基酸的方法中大多采用氨基鍵合硅膠柱，存在不能同時(shí)實(shí)現(xiàn)多種氨 基酸的有效分離，色譜柱的使用壽命短、成本高等缺點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)不足，本發(fā)明的目的是提供一種快速分析氨基酸混合物的方法，為 氨基酸的質(zhì)量控制提供有效的分析手段，并用于檢測(cè)氨基酸類化合物。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種快速分析氨基酸混合物的方法，將待測(cè)氨基酸 混合物用溶劑稀釋成供試品溶液，然后采用高效液相色譜法進(jìn)行氨基酸混合物的分析，色 譜柱采用酰胺鍵合硅膠柱。
[0006] 優(yōu)選的，所述供試品溶液中氨基酸混合物濃度為0. 01?lmg/mL。
[0007] 優(yōu)選的，所述流動(dòng)相由無機(jī)鹽水溶液與色譜純有機(jī)溶劑混合而成，所述無機(jī)鹽水 溶液與所述色譜純有機(jī)溶劑混合的體積比為35:65?40:60。
[0008] 優(yōu)選的，所述無機(jī)鹽水溶液與所述色譜純有機(jī)溶劑混合的體積比為40:60? 50:50。
[0009] 優(yōu)選的，所述無機(jī)鹽水溶液的濃度為0· 03?0· lmol/L。
[0010] 優(yōu)選的，所述無機(jī)鹽水溶液在制備中加入氨水，再用磷酸調(diào)pH值至4. 0?4. 6 ;進(jìn) 一步優(yōu)選的，pH值為4. 0±0. 5 ;pH范圍以4. 0±0. 1最佳；現(xiàn)有技術(shù)中調(diào)節(jié)pH在6.0左右， 會(huì)縮短酰胺柱的使用壽命。
[0011] 優(yōu)選的，所述無機(jī)鹽為磷酸鈉鹽、磷酸鉀鹽或磷酸二氫鹽；優(yōu)選的，所述磷酸二氫 鹽為磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉或磷酸氫二鉀。
[0012] 優(yōu)選的，所述色譜純有機(jī)溶劑為醇類或腈類；優(yōu)選的，所述色譜純有機(jī)溶劑為甲醇 或乙腈。
[0013] 使用酰胺柱，用上述流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，能實(shí)現(xiàn)各色譜峰的有效分離、分析靈敏度 高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、方法簡(jiǎn)便快捷，可用于氨基酸類物質(zhì)或含氨基酸雜質(zhì)的藥物的分析檢 測(cè)。解決了一般液相分析方法的不足。
[0014] 優(yōu)選的，所述高效液相色譜法的檢測(cè)波長(zhǎng)為UV205?400nm ;波長(zhǎng)為205nm最佳， 在此波長(zhǎng)下，大多氨基酸類物質(zhì)均有吸收。
[0015] 優(yōu)選的，設(shè)置的柱溫為20?40°C ;進(jìn)一步優(yōu)選的，柱溫為25°C ;
[0016] 優(yōu)選的，設(shè)置流動(dòng)相的流速為0. 6mL/min?2. 5mL/min ;進(jìn)一步優(yōu)選的流速為 0. 7mL/min ?L 0mT,/mi η 〇
[0017] 優(yōu)選的，一種快速分析氨基酸混合物的方法包括以下步驟：
[0018] 1)制備磷酸二氫鹽水溶液，加入氨水，用水稀釋后，再用磷酸調(diào)節(jié)pH值至4. 0? 4. 5,將緩沖鹽溶液作為無機(jī)鹽水溶液；加入氨水后形成的緩沖鹽能夠穩(wěn)定溶液的pH，略呈 酸性的pH值有利于提前保留時(shí)間，提高分析的效率，同時(shí)可以延長(zhǎng)酰胺柱的使用壽命。
[0019] 2)將無機(jī)鹽水溶液與乙腈按35:65?40:60的體積比混合，制得流動(dòng)相；優(yōu)選的， 無機(jī)鹽水溶液與乙腈體積比為40:60,溶解樣品所用溶劑為65%乙腈的水溶液（體積比）。 而現(xiàn)有技術(shù)無機(jī)鹽溶液濃度高，在實(shí)際操作過程中，鹽易結(jié)晶，對(duì)色譜柱和儀器的損傷都較 大。
[0020] 3)將氨基酸混合物用65%乙腈的水溶液稀釋成濃度為0. 01?lmg/mL的供試品 溶液；所用溶劑為65%乙腈的水溶液，有利于消除溶劑峰干擾，同時(shí)利于保護(hù)色譜柱。
[0021] 4)取供試品溶液適量，注入高效液相色譜儀中，使用酰胺鍵合硅膠柱，用流動(dòng)相進(jìn) 行洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為UV205?400nm，記錄液相色譜圖；所采用的酰胺鍵合硅膠柱比氨基鍵 合硅膠具有更低的背景噪音，有利于保護(hù)色譜柱。
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0023] 1、同時(shí)方便的檢出多種氨基酸并能達(dá)到良好分離；
[0024] 2、分析靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、方法簡(jiǎn)便快捷，可用于氨基酸類物質(zhì)或含氨基酸 雜質(zhì)的藥物的分析檢測(cè)；
[0025] 3、酰胺鍵合硅膠柱比氨基鍵合硅膠具有更低的背景噪音，有利于保護(hù)色譜柱，并 且穩(wěn)定性良好；
[0026] 4、酰胺鍵合娃膠柱與氨基鍵合娃膠柱相比，價(jià)格低，降低分析成本；
[0027] 5、用酰胺柱進(jìn)行檢測(cè)所得峰的峰型較現(xiàn)有氨基色譜柱所出峰的峰型好。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1實(shí)施例1中精氨酸的HPLC色譜圖；
[0029] 圖2實(shí)施例1中精氨酸的檢測(cè)限HPLC色譜圖；
[0030] 圖3實(shí)施例2中門冬氨酸和鳥氨酸的HPLC色譜圖；
[0031] 圖4實(shí)施例3測(cè)定甘氨酸含量的HPLC色譜圖；
[0032] 圖5實(shí)施例4丙氨酸0小時(shí)測(cè)定的HPLC色譜圖；
[0033] 圖6實(shí)施例4丙氨酸24小時(shí)測(cè)定的HPLC色譜圖；
[0034] 圖7實(shí)施例5空白溶劑測(cè)定的HPLC色譜圖；
[0035] 圖8實(shí)施例5使用酰胺柱分離混合液測(cè)定的HPLC色譜圖；
[0036] 圖9實(shí)施例6使用氨基柱分離混合液測(cè)定的HPLC色譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0037] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0038] 實(shí)施例1 HPLC(高效液相色譜法）測(cè)定精氨酸定量限、檢測(cè)限
[0039] 色譜柱：酰胺鍵合硅膠柱（WATERS3. 5 μ m4. 6 X 150mm)。
[0040] 流動(dòng)相：乙腈：磷酸鹽緩沖液=60:40 ;磷酸鹽緩沖液：取磷酸二氫鉀3. 2664g，加 水240mL溶解后，再加氨水5mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH至4. 5 ± 0. 1。
[0041] 檢測(cè)波長(zhǎng)：205nm，流速：1. OmL/min，柱溫：25°C。
[0042] 取精氨酸適量，用65%乙腈溶解，取20 μ L溶解液注入液相色譜儀，記錄液相色譜 圖（如圖1所示）。對(duì)供試品進(jìn)行逐級(jí)稀釋，用液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)信噪比為10 :1時(shí) 確立精氨酸的定量限，得定量限：1. 5 X l(T4mg/mL，再次用溶劑對(duì)供試品進(jìn)行稀釋，用液相進(jìn) 行檢測(cè)，記錄色譜圖，當(dāng)信噪比為3 :1時(shí)確立精氨酸的檢測(cè)限，得精氨酸檢測(cè)限：5Xl(T5mg/ mL(如圖2所示）。由此可見，該方法的靈敏度高，準(zhǔn)確度良好。
[0043] 實(shí)施例2 HPLC測(cè)定門鳥氨酸中門冬氨酸與鳥氨酸比例
[0044] 色譜柱：酰胺鍵合硅膠柱（WATERS3. 5 μ m4. 6 X 150mm)。
[0045] 流動(dòng)相：乙腈：磷酸鹽緩沖液=60:40 ;磷酸鹽緩沖液：取磷酸二氫鉀13. 61g，力口 水500mL溶解后，加入25?28%的氨水5mL，加水稀釋至lOOOmL，混合后用磷酸調(diào)節(jié)pH至 4. 2±0. 1。
[0046] 檢測(cè)波長(zhǎng)：205nm，流速：1. OmL/min，柱溫：25°C。
[0047] 本實(shí)施例的樣品組成為：門冬氨酸和鳥氨酸。
[0048] 取門鳥氨酸適量，加 65%的乙腈溶解并稀釋制成約4 μ g/mL的溶液作為供試品溶 液；精密量取20yL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖（如圖3所示）。經(jīng)與對(duì)照品溶液進(jìn)行比 較，結(jié)果表明，15分鐘左右為門冬氨酸，22分鐘左右為鳥氨酸，門冬氨酸和鳥氨酸能實(shí)現(xiàn)有 效分離。門冬氨酸和鳥氨酸比例符合測(cè)定要求。
[0049] 實(shí)施例3 HPLC測(cè)定甘氨酸含量
[0050] 色譜柱：酰胺鍵合硅膠柱（WATERS3. 5 μ m4. 6 X 150mm)。
[0051] 流動(dòng)相：乙腈：磷酸鹽緩沖液=60:40 ;磷酸鹽緩沖液：取磷酸二氫鉀13. 61g，力口 水500mL溶解后加入25?28 %的氨水5mL，加水稀釋至lOOOmL，混合后用磷酸調(diào)節(jié)pH至 4. 2±0. 1。
[0052] 取甘氨酸適量，精密稱定，加65 %的乙腈稀釋制成每lmL溶液中約含甘氨酸2 μ g， 檢測(cè)波長(zhǎng)為205nm，流速為1. OmL/min，柱溫：25°C。取20 μ L注入液相色譜儀，記錄液相色 譜圖，參見圖4,圖中2. 7分鐘左右為甘氨酸的峰，在此測(cè)定條件下，甘氨酸峰型良好，用主 成分自身對(duì)照法經(jīng)6次測(cè)定，取6次測(cè)定含量的平均值，其結(jié)果和標(biāo)示的含量結(jié)果一致，說 明本法具有較好的準(zhǔn)確度。
[0053] 實(shí)施例4 HPLC測(cè)定丙氨酸穩(wěn)定性
[0054] 色譜柱：酰胺鍵合硅膠柱（WATERS3. 5 μ m4. 6 X 150mm)。
[0055] 流動(dòng)相：乙腈：磷酸鹽緩沖液=60:40 ;磷酸鹽緩沖液：取磷酸二氫鉀13. 61g，力口 水500mL溶解后加入25?28 %的氨水5mL，加水稀釋至1000mL，混合后用磷酸調(diào)節(jié)pH至 4. 2±0. 1。
[0056] 取丙氨酸適量，精密稱定，用65%的乙腈溶解并制成每lmL溶液中約含2mg的丙氨 酸，作為供試品溶液。
[0057] 檢測(cè)波長(zhǎng)為205nm，流速為1. OmL/min，柱溫：25°C。分別于不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣，記錄 色譜圖，典型色譜圖分別如圖5、圖6所示，圖中2. 5分鐘左右為丙氨酸，圖5為丙氨酸在0 小時(shí)測(cè)試結(jié)果，將樣品在自然條件下放置24小時(shí)后再次檢測(cè)（如圖6所示），考察丙氨酸峰 面積的變化。通過不同時(shí)間點(diǎn)取樣檢查，得計(jì)算結(jié)果顯示該溶液在24小時(shí)內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定，含 量變化在允許的范圍內(nèi)，同時(shí)說明本測(cè)定方法具有較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。
[0058] 實(shí)施例5 HPLC測(cè)定混合樣
[0059] 色譜柱：酰胺鍵合硅膠柱（WATERS3. 5 μ m4. 6 X 150mm)。
[0060] 流動(dòng)相：乙腈：磷酸鹽緩沖液=60:40 ;磷酸鹽緩沖液：取磷酸二氫鉀13. 61g，力口 水500mL溶解后加入25?28 %的氨水5mL，加水稀釋至lOOOmL，混合后用磷酸調(diào)節(jié)pH至 4. 2±0. 1。
[0061] 檢測(cè)波長(zhǎng)為205nm，流速為1. OmL/min，柱溫：25°C。
[0062] 分別取富馬酸、谷氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸適量于同一容量瓶中，用65%的乙腈溶 解并稀釋至刻度，制得含四種物質(zhì)的混合液，分別取空白溶劑、混合液20 μ L注入液相色譜 儀，記錄液相色譜圖（如圖7、圖8所示）。
[0063] 結(jié)果顯示，所用空白溶劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果無干擾作用，混合液中四種物質(zhì)在同一條件 下得到有效分離，保留時(shí)間分別在1. 3分鐘左右、2. 4分鐘左右、3. 1分鐘左右、4. 3分鐘左右 的峰依次對(duì)應(yīng)于富馬酸、谷氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸，有效的提升了檢測(cè)效率。
[0064] 對(duì)比例采用氨基柱分離實(shí)施例5中混合樣
[0065] 通過只改變實(shí)施例5中檢測(cè)條件的色譜柱，而其它條件相同情況下，將色譜柱換 為氨基鍵合硅膠柱，進(jìn)行同樣混合樣的分離，記錄色譜圖（如圖9所示）。結(jié)果顯示，有兩個(gè) 峰不容易分開，并且最后一個(gè)峰峰型差，對(duì)稱性不好。
[0066] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明、【具體實(shí)施方式】及試驗(yàn)，對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描 述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見 的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的 范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種快速分析氨基酸混合物的方法，其特征在于，將待測(cè)氨基酸混合物用流動(dòng)相稀 釋成供試品溶液，然后采用高效液相色譜法進(jìn)行氨基酸混合物的分析，色譜柱采用酰胺鍵 合娃膠柱。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述供試品溶液中氨基酸混合物的濃度 為 0·01 ?lmg/mL。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述流動(dòng)相由無機(jī)鹽水溶液與色譜 純有機(jī)溶劑混合而成，所述無機(jī)鹽水溶液與所述色譜純有機(jī)溶劑混合的體積比為35:65? 40:60。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述無機(jī)鹽水溶液與所述色譜純有機(jī) 溶劑混合的體積比為40:60?50:50。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述無機(jī)鹽水溶液的濃度為0. 03? 0·lmol/L〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述無機(jī)鹽水溶液在制備中加入氨 水，再用磷酸調(diào)pH值至4. 0?4. 6。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述無機(jī)鹽為磷酸鈉鹽、磷酸鉀鹽或 磷酸二氫鹽；優(yōu)選的，所述磷酸二氫鹽為磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉或磷酸氫二 鉀。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述色譜純有機(jī)溶劑為醇類或腈類；優(yōu)選 的，所述色譜純有機(jī)溶劑為甲醇或乙腈。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述高效液相色譜法的檢測(cè)波長(zhǎng)為UV205? 400nm ； 設(shè)置的柱溫為20?40°C ; 設(shè)置流動(dòng)相的流速為〇. 6mL/min?2. 5mL/min。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9任一所述的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 制備磷酸二氫鹽水溶液，加入氨水，用水稀釋后，再用磷酸調(diào)節(jié)pH值至4. 0?4. 5， 將緩沖鹽溶液作為無機(jī)鹽水溶液； 2) 將無機(jī)鹽水溶液與乙腈溶液按35:65?40:60的體積比混合，制得流動(dòng)相； 3) 將氨基酸混合物用65%乙腈的水溶液稀釋成濃度為0. 01?lmg/mL的供試品溶液； 4) 取供試品溶液適量，注入高效液相色譜儀中，使用酰胺鍵合硅膠柱，用流動(dòng)相進(jìn)行洗 脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為UV205?400nm，記錄液相色譜圖。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK104155378SQ201410400994
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年8月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月14日
【發(fā)明者】李國艷, 孫建華, 李園, 劉銅梅, 熊媛媛 申請(qǐng)人:蚌埠豐原醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司