基于熒光標記的o1群小川型霍亂弧菌免疫層析試紙條的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的O1群小川型霍亂弧菌免疫層析檢測試紙條及制備方法與應(yīng)用，本發(fā)明采用低噪聲激發(fā)式熒光染料作為標記，采用免疫層析技術(shù)，制備靶向于O1群小川型霍亂弧菌的免疫層析試紙條，檢測時，采用專用便攜式低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀分別掃描質(zhì)控線和檢測線，以檢測線熒光強度檢測值實現(xiàn)樣本的定性及定量檢測，該試紙條適用于食品及病理樣本中O1群小川型霍亂弧菌即時檢測，本發(fā)明具有快速、高敏、兼顧定性及精準定量及便攜的特點。
【專利說明】基于黃光標巧的01群小川型霍亂弧菌免疫層析試紙條

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學、食品安全檢測領(lǐng)域，具體地說設(shè)及一種基于低噪聲激發(fā)式巧光 染料標記的01群小川型霍亂弧菌免疫層析試紙條及其制備方法與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 01群小川型霍亂弧菌作為致病菌檢測的一項重要指標，在公共衛(wèi)生、食品衛(wèi)生、畜 牧獸醫(yī)和出入境檢驗檢疫中均有重要的意義，同時也對01群小川型霍亂弧菌的快速及高 精度的定量檢測提出了更高的要求。為探求快速、準確、高靈敏度、易操作且能夠定量的檢 測方法，世界各國學者進行了大量研究，從W傳統(tǒng)方法為基礎(chǔ)發(fā)展到W免疫學、分子生物學 為基礎(chǔ)的快速檢測方法，并在實踐中不斷取得新進展。
[0003] 免疫層析技術(shù)是一項有效結(jié)合了層析法卓越分離能力和免疫反應(yīng)高度特異性的 新型免疫檢測技術(shù)，當前在疾病快速診斷、環(huán)境污染物分析及致病生物因子檢定等領(lǐng)域得 到廣泛應(yīng)用。其原理是將特異抗原或抗體固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當該干燥的硝 酸纖維素膜一端浸入樣品后，由于毛細管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當遷移至交聯(lián)標 記抗體的特定區(qū)域時，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合形成抗原-標記抗體 復合物，經(jīng)標記物的顯色、發(fā)光或電化學反應(yīng)而使該區(qū)域顯示一定的信號，從而實現(xiàn)特異性 免疫診斷。常用的標記物包括生色型探針（包括膠體金、膠體碳、著色微球等）和巧光分子 (如有機巧光染料、量子點、稀±元素配合物、上轉(zhuǎn)磯光顆粒等）。
[0004] 然而上述的標記物卻存在靈敏度有限且無法實現(xiàn)精確定量檢測等缺陷，進而限制 了免疫層析技術(shù)的廣泛應(yīng)用。如現(xiàn)有技術(shù)中常見的利用酶標記催化生色底物的酶促反應(yīng) 而顯色，可用于抗原或抗體的直接檢測，將該方法應(yīng)用于食品中01群小川型霍亂弧菌的檢 巧。，通過單克隆抗體捕捉特異性蛋白可W大大降低假陽性率，但是該方法的靈敏度較分子 生物學方法低，且必須經(jīng)過增菌篩選純培養(yǎng)步驟，因此難W在短時間內(nèi)得到檢測結(jié)果。
[0005] 對于現(xiàn)有的膠體金免疫層析技術(shù)，通過膠體金等納米顆粒的聚集反應(yīng)而顯色，從 而實現(xiàn)結(jié)果判定。雖然該種方法具有便捷、快速、準確和無污染等特點被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學 檢測和臨床診斷，在病原體檢測方面，其敏感性、特異性具有其他免疫學方法無可比擬的優(yōu) 勢，且無需特殊儀器設(shè)備，對檢測人員的專業(yè)要求低，有良好的基層應(yīng)用開發(fā)前景。但該種 方法中存在標記物的穩(wěn)定性較差，顏色單一，靈敏度較低，受基質(zhì)的背景干擾大等缺陷，且 只能定性檢測，不能做到精確定量檢測，上述標記靈敏度有限且無法實現(xiàn)精確定量，限制了 免疫層析技術(shù)的應(yīng)用。
[0006] 另外，現(xiàn)有免疫層析技術(shù)一直主要用于對蛋白類的檢測，對于微生物的檢測則所 見甚少，同時更難W實現(xiàn)微生物的定量檢測，對于快速檢測致病菌而言，其應(yīng)用受到極大的 限制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于現(xiàn)有技術(shù)中難于快速定性或定量檢測01 群小川型霍亂弧菌的問題，進而提供一種基于低噪聲激發(fā)式巧光標記的01群小川型霍亂 弧菌免疫層析試紙條，并進一步公開了其應(yīng)用。
[000引為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的一種基于低噪聲激發(fā)式巧光標記的01群小 川型霍亂弧菌免疫層析試紙條，包括：
[0009] 底板W及沿所述底板的長度方向上依次粘附在所述底板上的樣品墊、結(jié)合墊、抗 體承載膜和吸水墊，且所述樣品墊、結(jié)合墊、抗體承載膜和吸水墊之間，依次與且僅與相鄰 部位相接觸且部分重疊；所述抗體承載膜粘附于所述底板的中間部位，其上設(shè)置有相間隔 的檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線靠近所述結(jié)合墊，所述質(zhì)控線靠近所述吸水墊；
[0010] 所述結(jié)合墊上噴涂有低噪聲激發(fā)式巧光染料標記的與01群小川型霍亂弧菌特異 性結(jié)合的單克隆抗體；
[0011] 所述檢測線由可與所述01群小川型霍亂弧菌特異性結(jié)合的多克隆抗體涂層形 成；所述質(zhì)控線由與所述01群小川型霍亂弧菌W及所述可與01群小川型霍亂弧菌特異性 結(jié)合的多克隆抗體均無關(guān)的抗體涂層形成。
[0012] 所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標記的01群小川型霍亂弧菌免疫層析試紙條，所 述結(jié)合墊上所述的可與01群小川型霍亂弧菌特異性結(jié)合的單克隆抗體為鼠抗01群小川型 霍亂弧菌單克隆抗體（購自Abeam公司）。
[0013] 所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標記的01群小川型霍亂弧菌免疫層析試紙條，所 述檢測線上的所述可與01群小川型霍亂弧菌特異性結(jié)合的多克隆抗體為兔抗01群小川型 霍亂弧菌（購自Abeam公司）。
[0014] 所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標記的01群小川型霍亂弧菌免疫層析試紙條，形 成所述質(zhì)控線的抗體為羊抗鼠IgG多克隆抗體（購自北京華大蛋白質(zhì)公司）。
[0015] 所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標記的01群小川型霍亂弧菌免疫層析試紙條，所 述的低噪聲激發(fā)式巧光染料為發(fā)射波長為650-1100nm。優(yōu)選的，所述的基于低噪聲激發(fā)式 巧光標記的染料為發(fā)射波長為777nm，發(fā)射光波長為790nm的巧光分子。
[0016] 所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標記的01群小川型霍亂弧菌免疫層析試紙條，所 述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標記的染料為DyLi曲巧00 (購自Thermofisher公司）。
[0017] 所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標記的01群小川型霍亂弧菌免疫層析試紙條，所 述質(zhì)控線與所述檢測線平行設(shè)置，所述檢測線和所述質(zhì)控線間距0. 5cm。
[001引本發(fā)明提供了一種制備所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標記的01群小川型霍亂弧 菌免疫層析試紙條的方法，包括如下步驟：
[0019] A)取WPBS(PH為7. 4)緩沖液稀釋10倍的所述低噪聲激發(fā)式巧光染料，所述染料 與01群小川型霍亂弧菌單克隆抗體按1:2質(zhì)量比混合均勻，室溫條件下避光反應(yīng)2小時， 隨后將所得的標記產(chǎn)物放入含有PBS緩沖液的透析袋中，4°C透析4小時，向所述標記好的 標記產(chǎn)物中添加終濃度為1. 5% BSA、0. 15% Tween20和0. 15%。疊氮化鋼，4°C保存，備用；
[0020] B)在所述結(jié)合墊上噴涂W層析緩沖液稀釋1000倍后的上述步驟A)中的所述標記 產(chǎn)物，然后室溫風干，備用；
[002U C)使用PH為7. 4的含5% BSA，0. 1 % Tween 20的PBS緩沖液噴涂在所述樣品墊 上，室溫風干后，備用；
[0022] D)分別取所述01群小川型霍亂弧菌多克隆抗體和所述與01群小川型霍亂弧菌W 及可與01群小川型霍亂弧菌特異性結(jié)合的多克隆抗體均無關(guān)的抗體用劃線機在所述抗體 承載膜上劃所述檢測線和所述質(zhì)控線，室溫風干，備用；
[0023] 巧將上述步驟獲得的所述樣品墊、所述結(jié)合墊、所述抗體承載膜和所述吸水墊沿 所述底板的長度方向上依次粘附，然后切割成試紙條，即得；
[0024] 本發(fā)明提供了一種由上述的制備方法制得的基于低噪聲激發(fā)式巧光標記的01群 小川型霍亂弧菌免疫層析試紙條在定性及定量檢測01群小川型霍亂弧菌領(lǐng)域中的用途。
[0025] 本發(fā)明提供了一種利用所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標記的01群小川型霍亂弧 菌免疫層析試紙條定性檢測01群小川型霍亂弧菌的方法，包括如下步驟：
[0026] a) W含5% BSA，0. 1 % Tween 20的PBS (抑為7. 4)緩沖液稀釋處理待測樣品，取 洗脫液超聲破菌后作為待檢樣，用所述的試紙條進行免疫層析；
[0027] b)巧光掃描所述檢測線和所述質(zhì)控線，分別測定所述檢測線和所述質(zhì)控線區(qū)域的 巧光強度，若所述質(zhì)控線區(qū)域出現(xiàn)巧光發(fā)射峰，則表明該試紙條有效，反之則無效；若所述 檢測線區(qū)域同時出現(xiàn)巧光發(fā)射峰則為陽性結(jié)果，反之則為陰性。
[002引所述的檢測01群小川型霍亂弧菌的方法，還包括制備標準曲線及定量檢測的步 驟；其中：
[0029] 所述制備標準曲線的步驟包括：取01群小川型霍亂弧菌菌株（實驗室分離株）配 制成1-100倍梯度濃度的系列標準品；并將上述濃度系列標準品超聲破菌后分別用所述的 試紙條進行免疫層析，巧光掃描所述檢測線和所述質(zhì)控線，分別測定所述檢測線和所述質(zhì) 控線區(qū)域的巧光強度，制作抗原濃度與巧光強度比之間關(guān)系的標準曲線，并擬合方程；
[0030] 所述定量檢測的步驟包括；取待測樣品W所述的試紙條進行免疫層析檢測，利用 上述標準曲線及工作方程求得所述01群小川型霍亂弧菌濃度。
[0031] 本發(fā)明的上述技術(shù)方案相比現(xiàn)有技術(shù)具有W下優(yōu)點：
[0032] (1)本發(fā)明所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標記的01群小川型霍亂弧菌免疫層析 試紙條，其發(fā)射光譜位于低噪聲激發(fā)式區(qū)域（波長為650-1100nm)的低噪聲激發(fā)式巧光探 針具有較高的信噪比，并由此保障了其高檢測靈敏度，同時由于生物基體極少在低噪聲激 發(fā)式光譜區(qū)自發(fā)巧光，使得基于此類探針標記的分析檢測免受背景巧光干擾；因散射光強 度與波長的四次方成反比，發(fā)射光位于長波區(qū)的低噪聲激發(fā)式巧光探針受其干擾小。與常 用的膠體金免疫層析試紙條相比，基于低噪聲激發(fā)式巧光染料標記的免疫層析體系對祀標 菌的靈敏度提高約10倍；如01群小川型霍亂弧菌膠體金免疫層析試紙條的最低檢出限為 l*10 4CFU/mU而本發(fā)明中基于低噪聲激發(fā)式巧光染料標記的01群小川型霍亂弧菌免疫層 析試紙條的最低檢出限為l*l〇3CFU/mL ;
[0033] (2)本發(fā)明所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標記的01群小川型霍亂弧菌免疫層析 試紙條定性檢測01群小川型霍亂弧菌的方法具有便攜的優(yōu)勢，適用于現(xiàn)場、即時、快速檢 巧。，本方法所設(shè)的免疫層析試紙條及低噪聲激發(fā)式巧光掃描儀均屬于便攜可移動裝置，且 整個檢測過程可在45min內(nèi)完成，適用于現(xiàn)場、即時、快速檢測，相對于傳統(tǒng)培養(yǎng)法5-6天的 檢測周期及繁瑣的培養(yǎng)基配制等過程具有顯著的時效性優(yōu)勢；相對于PCR及實時巧光定量 PCR法等分子生物學方法則在儀器的檢測速度、便攜性及現(xiàn)場適用性上呈現(xiàn)明顯優(yōu)勢；
[0034] (3)本發(fā)明所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標記的01群小川型霍亂弧菌免疫層析 試紙條定量檢測01群小川型霍亂弧菌的方法可對所述01群小川型霍亂弧菌進行定量檢 ，傳統(tǒng)的免疫層析法依賴膠體金顆粒的聚集效應(yīng)而生色w判讀結(jié)果，其顏色深淺雖與樣 品中祀標菌的濃度存在一定的數(shù)量關(guān)系，但無法進行準確定量，而本發(fā)明將低噪聲激發(fā)式 巧光染料標記于特異性抗體上，檢測線的巧光強度直接體現(xiàn)了與捕獲分子相結(jié)合的祀標菌 的量，加之質(zhì)控線不隨樣本改變的巧光強度作為內(nèi)參，通過掃描檢測線及質(zhì)控線上的巧光 強度、計算比值，并與標準曲線比較即可得出檢樣中祀標菌的濃度。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] 為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實施例并結(jié)合 附圖，對本發(fā)明作進一步詳細的說明，其中
[0036] 圖1是實施例1中所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標記的01群小川型霍亂弧菌免 疫層析試紙條的示意圖；
[0037] 圖2是實施例2中所述的01群小川型霍亂弧菌低噪聲激發(fā)式巧光檢測圖；
[003引圖3是實施例3中所述的01群小川型霍亂弧菌的標準曲線。
[0039] 圖中附圖標記表示為；1-樣品墊，2-結(jié)合墊，3-硝酸纖維素膜，4-檢測線，5-質(zhì)控 線，6-吸水墊，7-底板。

【具體實施方式】
[0040] 實施例1
[0041] 本實施例所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標記的01群小川型霍亂弧菌免疫層析試 紙條如圖1所示，其包括，底板7 W及沿所述底板7的長度方向上依次粘附在所述底板上的 樣品墊1、結(jié)合墊2、抗體承載膜3和吸水墊6 ;且所述樣品墊1、結(jié)合墊2、抗體承載膜3和 吸水墊6之間，依次與且僅與相鄰部位相接觸且部分重疊；所述抗體承載膜3上粘附于所述 底板7的中間部位，其上設(shè)置有相間隔的檢測線4的質(zhì)控線5,所述檢測線4靠近所述結(jié)合 墊2,所述質(zhì)控線5靠近所述吸水墊6 ;所述質(zhì)控線4與所述檢測線5平行設(shè)置，所述檢測線 5和所述質(zhì)控線4間距0. 5畑1。
[0042] 所述結(jié)合墊2上噴涂有低噪聲激發(fā)式巧光染料標記的可與01群小川型霍亂弧菌 特異性結(jié)合的單克隆抗體為鼠抗01群小川型霍亂弧菌單克隆抗體；所述檢測線4由可與所 述01群小川型霍亂弧菌特異性結(jié)合的多克隆抗體兔抗01群小川型霍亂弧菌多克隆抗體涂 層形成；所述質(zhì)控線5由與所述01群小川型霍亂弧菌W及所述可與01群小川型霍亂弧菌 特異性結(jié)合的多克隆抗體均無關(guān)的羊抗鼠IgG多克隆抗體（購自北京華大蛋白質(zhì)公司）涂 層形成。
[0043] 所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標記的染料為發(fā)射波長為777nm，發(fā)射光波長為 790nm的巧光分子的N服活化的低噪聲激發(fā)式巧光染料DyLi曲巧00作為巧光分子。
[0044] 上述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標記的01群小川型霍亂弧菌免疫層析試紙條的制 備方法，包括如下步驟：
[0045] A)取W PBS (PH為7. 4)緩沖液稀釋10倍的所述低噪聲激發(fā)式巧光染料，所述染料 與01群小川型霍亂弧菌單克隆抗體按1:2質(zhì)量比混合均勻，室溫條件下避光反應(yīng)2小時， 隨后將所得的標記產(chǎn)物放入含有PBS緩沖液的透析袋中，4°C透析4小時，向所述標記好的 標記產(chǎn)物中添加終濃度為1. 5% BSA、0. 15% Tween20和0. 15%。疊氮化鋼，4°C保存，備用；
[0046] B)在所述結(jié)合墊2上噴涂W層析緩沖液稀釋1000倍后的上述步驟A)中的所述標 記產(chǎn)物，然后室溫風干，備用；
[0047] C)使用PH為7. 4的含5% BSA，0. 1 % Tween 20的PBS緩沖液噴涂在所述樣品墊 1上，室溫風干后，備用；
[0048] D)分別取所述01群小川型霍亂弧菌多克隆抗體和所述與01群小川型霍亂弧菌W 及可與01群小川型霍亂弧菌特異性結(jié)合的多克隆抗體均無關(guān)的抗體用劃線機在所述抗體 承載膜3上劃所述檢測線4和所述質(zhì)控線5,室溫風干，備用；
[0049] 巧將上述步驟獲得的所述樣品墊1、所述結(jié)合墊2、所述抗體承載膜3和所述吸水 墊6沿所述底板7的長度方向上依次粘附，具體為在底板7中間先鋪設(shè)抗體承載膜3,然后 在抗體承載膜3的與質(zhì)控線5相臨近的一端鋪吸水墊6,使吸水墊6與抗體承載膜3部分重 疊，然后在抗體承載膜3的與所述檢測線4相臨近的一端鋪所述結(jié)合墊2,使所述抗體承載 膜3與所述結(jié)合墊2的一端部分重疊，隨后在所述結(jié)合墊2的另一端再部分重疊的鋪設(shè)所 述樣品墊1，最后切割成0. 5cm寬，即得試紙條。
[0050] 實施例2
[0化1] 本實施例提供了一種利用上述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標記的01群小川型霍亂 弧菌免疫層析試紙條進行定性檢測01群小川型霍亂弧菌的方法，包括如下步驟：
[005引 a)取海頗樣品25g，用225血含5% BSA，0. 1 % Tween 20的PBS (抑為7. 4)緩沖 液稀釋樣品，取上清液1ml，超聲破菌，直徑3mm探頭，工作5s，休息5s，40 %能量（由寧波先 倡電子科技有限公司提供的超聲細胞粉碎機，型號為XC-CD型），共計30次循環(huán)，吸取所述 處理后的樣品50 y L滴加到樣品墊1上，待吸收干后再滴加50 y L上述PBS緩沖液；
[0化3] b)室溫放置lOmin后，用便攜式低噪聲激發(fā)式巧光掃描儀（購自北京博潤福得科 技發(fā)展有限公司）分別測定所述檢測線4和所述質(zhì)控線5區(qū)域的巧光強度，若所述質(zhì)控線 5區(qū)域出現(xiàn)巧光發(fā)射峰，則表明該試紙條有效，反之則無效；若所述檢測線4區(qū)域和質(zhì)控線 5區(qū)域同時出現(xiàn)巧光發(fā)射峰則為陽性結(jié)果，反之則為陰性，附圖2給出了對上述樣品的定性 檢測結(jié)果?？梢?，本發(fā)明所述試紙條可有效對所述01群小川型霍亂弧菌進行定性的檢測。
[0054] 實施例3
[0055] 本實施例還提供了一種利用所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標記的01群小川型霍 亂弧菌免疫層析試紙條定量檢測01群小川型霍亂弧菌的方法：
[0056] 制備標準曲線：取l*l〇6CFU/mL的01群小川型霍亂弧菌純菌（本實驗室分離株）， 用含5% BSA，0. 1% Tween 20的PBS (抑7. 4)稀釋液將所述純菌進行倍數(shù)系列稀釋，制成 0. 5*l〇6CFU/mL、l*l〇5c即/mL、0. 5*l〇5CFU/mL、l*l〇4c即/mL、0. 5*l〇4CFU/mL、l*l〇3CFU/mL、 l*102CFU/mL的樣品，超聲破菌，直徑3mm探頭，工作5s，休息5s，40%能量（由寧波先倡電 子科技有限公司提供的超聲細胞粉碎機，型號為XC-CD型），共計30次循環(huán)，吸取所述處理 后的樣品50 y L滴加到樣品墊1上，待吸收干后再滴加50 y L上述PBS緩沖液；室溫靜置10 分鐘，將上述試紙條放入便攜式低噪聲激發(fā)式巧光掃描儀（由北京博潤福得科技發(fā)展有限 公司提供）中讀數(shù)。
[0化7] 上述系列稀釋的01群小川型霍亂弧菌標準品分別進行檢測，掃描獲得檢測線4 和質(zhì)控線5的巧光值，同時出現(xiàn)檢測區(qū)域巧光峰和質(zhì)控區(qū)域巧光峰方表明反應(yīng)正常。每個 稀釋度樣本平行測量兩次，取平均值作為測量值，檢測結(jié)果見表1，W該值對相應(yīng)的樣品濃 度制作標準工作曲線，如圖3所示，并擬合得適用的標準曲線，y = 1.0247X+2.9584, R2 = 0.9745。
[0化引表1 ;不同濃度01群小川型霍亂弧菌標準品對應(yīng)檢測結(jié)果
[0059]

【權(quán)利要求】
1. 一種基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的01群小川型霍亂弧菌免疫層析試紙條，其特征 在于，包括： 底板（7)以及沿所述底板（7)的長度方向上依次粘附在所述底板上的樣品墊（1)、結(jié)合 墊（2)、抗體承載膜（3)和吸水墊（6)，且所述樣品墊（1)、結(jié)合墊（2)、抗體承載膜（3)和吸 水墊（6)之間，依次與且僅與相鄰部位相接觸且部分重疊；所述抗體承載膜（3)粘附于所述 底板（7)的中間部位，其上設(shè)置有相間隔的檢測線（4)和質(zhì)控線（5)，所述檢測線（4)靠近 所述結(jié)合墊（2)，所述質(zhì)控線（5)靠近所述吸水墊（6); 所述結(jié)合墊（2)上噴涂有低噪聲激發(fā)式熒光染料標記的可與所述01群小川型霍亂弧 菌特異性結(jié)合的單克隆抗體； 所述檢測線（4)由可與所述01群小川型霍亂弧菌特異性結(jié)合的多克隆抗體涂層形成； 所述質(zhì)控線（5)由與所述01群小川型霍亂弧菌以及所述可與01群小川型霍亂弧菌特異性 結(jié)合的多克隆抗體均無關(guān)的抗體涂層形成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的01群小川型霍亂弧菌免疫層 析試紙條，其特征在于，所述結(jié)合墊（2)上噴涂的所述可與01群小川型霍亂弧菌特異性結(jié) 合的單克隆抗體為鼠抗01群小川型霍亂弧菌單克隆抗體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的01群小川型霍亂弧菌免 疫層析試紙條，其特征在于，形成所述檢測線（4)的所述可與01群小川型霍亂弧菌特異性 結(jié)合的多克隆抗體為兔抗01群小川型霍亂弧菌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的01群小川型霍亂弧菌 免疫層析試紙條，其特征在于，形成所述質(zhì)控線（5)的抗體為羊抗鼠 IgG多克隆抗體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的01群小川型霍亂弧菌 免疫層析試紙條，其特征在于，所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光的染料為激發(fā)波長為777nm， 發(fā)射波長為790nm的焚光分子。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的01群小川型霍亂弧菌免疫層 析試紙條，其特征在于，所述的低噪聲激發(fā)式熒光染料為NHS活化的低噪聲激發(fā)式熒光染 料 DyLight800。
7. -種制備權(quán)利要求1-6任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的01群小川型霍亂 弧菌免疫層析試紙條的方法，其特征在于，包括如下步驟： A) 取以PH為7. 4的PBS緩沖液稀釋10倍的所述低噪聲激發(fā)式熒光染料，所述染料與 01群小川型霍亂弧菌單克隆抗體按1:2質(zhì)量比混合均勻，室溫條件下避光反應(yīng)2小時，隨后 將所得的標記產(chǎn)物放入含有PBS緩沖液的透析袋中，4°C透析4小時，向所述標記好的標記 產(chǎn)物中添加終濃度為1. 5% BSA、0. 15% Tween20和0. 15%。疊氮化鈉，4°C保存，備用； B) 在所述結(jié)合墊（2)上噴涂以層析緩沖液稀釋1000倍后的上述步驟A)中的所述標記 產(chǎn)物，然后室溫風干，備用； C) 使用PH為7. 4的含5% BSA，0. 1% Tween 20的PBS緩沖液噴涂在所述樣品墊（1) 上，室溫風干后，備用； D) 分別取所述01群小川型霍亂弧菌多克隆抗體和所述與01群小川型霍亂弧菌以及可 與01群小川型霍亂弧菌特異性結(jié)合的多克隆抗體均無關(guān)的抗體用劃線機在所述抗體承載 膜（3)上劃所述檢測線（4)和所述質(zhì)控線（5)，室溫風干，備用； E)將上述步驟獲得的所述樣品墊（1)、所述結(jié)合墊（2)、所述抗體承載膜（3)和所述吸 水墊（6)沿所述底板（7)的長度方向上依次粘附，然后切割成試紙條，即得。
8. 權(quán)利要求1-6任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的01群小川型霍亂弧菌免疫 層析試紙條在定性及定量檢測01群小川型霍亂弧菌領(lǐng)域中的用途。
9. 一種利用權(quán)利要求1-6任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的01群小川型霍亂 弧菌免疫層析試紙條檢測01群小川型霍亂弧菌的方法，其特征在于，包括如下步驟： a) 以pH為7. 4的含5 % BSA，0. 1 % Tween 20的PBS緩沖液稀釋處理待測樣品，取洗脫 液超聲破菌后作為待檢樣，以利用權(quán)利要求1-6任一所述的試紙條進行免疫層析檢測； b) 熒光掃描所述檢測線（4)和所述質(zhì)控線（5)，分別測定所述檢測線（4)和所述質(zhì)控 線（5)區(qū)域的熒光強度，若所述質(zhì)控線（5)區(qū)域出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，則表明該試紙條有效，反 之則無效；若所述檢測線（4)區(qū)域同時出現(xiàn)熒光發(fā)射峰則為陽性結(jié)果，反之則為陰性。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測01群小川型霍亂弧菌的方法，其特征在于，還包括制備 標準曲線及定量檢測的步驟：其中 所述制備標準曲線的步驟包括：取01群小川型霍亂弧菌菌株（本實驗室分離株）配制 成1-100倍梯度濃度的系列標準品；并將上述濃度系列標準品超聲破菌后分別用所述的試 紙條進行免疫層析，熒光掃描所述檢測線（4)和所述質(zhì)控線（5)，分別測定所述檢測線（4) 和所述質(zhì)控線（5)區(qū)域的熒光強度，制作抗原濃度與熒光強度比之間關(guān)系的標準曲線，并 擬合方程； 所述定量檢測的步驟包括：取待測樣品超聲破菌后以所述的試紙條進行免疫層析檢 測，利用上述標準曲線及方程計算得到所述01群小川型霍亂弧菌濃度。
【文檔編號】G01N33/577GK104502598SQ201410815561
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月23日
【發(fā)明者】張捷, 高靜, 張雷, 李莉, 劉潔, 尚士進, 張曉光, 舒咬根, 陳廣全 申請人:北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心, 廈門市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院, 中國檢驗檢疫科學研究院