一種快速定量檢測mpo的膠體金試紙的制作方法
【專利摘要】本實用新型公開了一種快速定量檢測MPO的膠體金試紙，所述膠體金試紙包括支撐墊片5，位于所述支撐墊片上的硝酸纖維素膜1，所述硝酸纖維素膜的一端連接吸水墊4，另一端連接偶合物墊片2，所述偶合物墊片連接樣本墊片3，所述樣本墊片另一端部的下方設(shè)有第一固定部件7，上方設(shè)有第二固定部件6，其特征在于，所述硝酸纖維素膜1中間部位檢測線8包被有MPO抗體，檢測線兩邊分別設(shè)有控制線9，所述偶合物墊片2上涂布有金標(biāo)記的MPO單克隆抗體或多克隆抗體以及控制線偶合物。
【專利說明】一種快速定量檢測MPO的膠體金試紙

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本實用新型屬于臨床醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，具體涉及一種用于定量檢測ΜΡ0(髓過氧化物 酶）的膠體金試紙。

【背景技術(shù)】
[0002] ΜΡ0 (髓過氧化物酶）是一種血色素蛋白，分子質(zhì)量118kDa，含一對重鏈和輕鏈，它 存于嗜中性多核細(xì)胞的嗜天青顆粒和巨嗜細(xì)胞中，其功能是可將氯化物和過氧化氫轉(zhuǎn)變?yōu)?次氯酸鹽。在炎癥狀態(tài)下，它被釋放入細(xì)胞外液進(jìn)入循環(huán)，因此被認(rèn)為是一種殺菌的酶，在 人體的天然防御、免疫功能方面起重要作用。此酶還參與含低密度脂蛋白的脂氧化。以鄰 位二氨基苯胺鹽酸鹽為底物加過氧化氫可定量血中和組織中的酶活性。ΜΡ0能氧化低密度 脂蛋白膽固醇（LDLC)，從而有利于巨噬細(xì)胞攝取LDLC并轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞；能氧化高密度脂 蛋白（HDL)，使其失去正常的功能；另外，ΜΡ0可激活金屬蛋白酶、使粥樣硬化斑塊表面不穩(wěn) 定趨于破裂；同時ΜΡ0還催化消耗內(nèi)皮衍生的一氧化氮（N0)，從而減少N0的生物利用度， 損害N0的血管擴(kuò)張和抗炎功能。
[0003] 急性冠狀動脈綜合征（ACS)以冠狀動脈循環(huán)中血小板激活和聚集為特征，粥樣硬 化斑塊破裂或糜爛處的血栓形成和血小板聚集物對遠(yuǎn)端血管的栓塞，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞 死。形成冠心病的重要病理基礎(chǔ)是動脈粥樣硬化，以脈粥樣硬化作為一種慢性炎癥過程，動 脈壁中脂質(zhì)、炎癥細(xì)胞和壞死物質(zhì)聚集為主要特征。粥樣斑塊的形成機(jī)制、并發(fā)癥及其早期 檢測指標(biāo)一直是臨床研究的熱點。壞死心肌細(xì)胞釋放的肌I丐蛋白（cardiac troponin，cTn) 已經(jīng)成為對ACS患者進(jìn)行危險分層、選擇治療方案的重要參考指標(biāo)。但是，越來越多的證據(jù) 表明，心肌細(xì)胞損傷不僅與血小板激活有關(guān)，而且多形核中性粒細(xì)胞的募集和激活更加先 于血小板的變化。多形核中性粒細(xì)胞在ACS患者的冠狀動脈循環(huán)中存在著明顯的脫顆?，F(xiàn) 象，釋放出大量的ΜΡ0(髓過氧化物酶），導(dǎo)致不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死患者的血漿 ΜΡ0水平升高。炎癥在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中占有重要的地位，ΜΡ0(髓過氧化物酶） 是由活化的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和部分巨噬細(xì)胞分泌的，是中性粒細(xì)胞活化的標(biāo)志物。 ΜΡ0(髓過氧化物酶）及其氧化產(chǎn)物具有促進(jìn)動脈粥樣硬化的作用，并參與斑塊的不穩(wěn)定， 與急性冠狀動脈綜合征的發(fā)生密切相關(guān)。因此，ΜΡ0水平可以獨立預(yù)測心血管疾病的危險 性，急性胸痛患者血中ΜΡ0水平的升高，可以預(yù)測未來6個月內(nèi)發(fā)生心肌梗塞及其他嚴(yán)重心 血管疾病的危險性。更有意義的是，對于肌I丐蛋白I (Troponin I)及肌|丐蛋白T (Troponin T)等常規(guī)檢測為陰性的患者，ΜΡ0水平的升高可以預(yù)測發(fā)生心梗等嚴(yán)重心血管疾病的危險 性。
[0004] 免疫膠體金技術(shù)（Immune colloidal gold technique)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志 物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸（HAuC14)在還原劑如 白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成 為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正 電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體 金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合。根據(jù)膠體金的一些物理性 狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而使膠 體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。
[0005] 目前，檢測ΜΡ0 (髓過氧化物酶）的方法目前主要是酶聯(lián)免疫技術(shù)（ELISA)，ELISA 技術(shù)存在以下缺點：檢測設(shè)備要求高，成本高；干擾因素較多，重復(fù)性不好；檢測時間長。因 此酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測ΜΡ0(髓過氧化物酶）不適合臨床快速診斷。鑒于目前尚無快速的定 量檢測方法，本實用新型的目的是提供一種可用于快速定量檢測ΜΡ0 (髓過氧化物酶）的膠 體金試紙以及一種可用于快速定量檢測ΜΡ0 (髓過氧化物酶）的膠體金試紙盒，所述膠體金 試紙和膠體金試紙盒具有方便快捷、操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點。 實用新型內(nèi)容
[0006] 本實用新型的一個目的是提供一種快速定量檢測ΜΡ0 (髓過氧化物酶）的膠體金 試紙，本實用新型所述快速定量檢測ΜΡ0的膠體金試紙具有方便快捷、操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確 等優(yōu)點，適于臨床快速檢測。
[0007] 本實用新型的技術(shù)方案是：
[0008] -種快速定量檢測ΜΡ0的膠體金試紙，包括支撐墊片5,位于所述支撐墊片上的硝 酸纖維素膜1，所述硝酸纖維素膜的一端連接吸水墊4,另一端連接偶合物墊片2,所述偶合 物墊片連接樣本墊片3,所述樣本墊片另一端部的下方設(shè)有第一固定部件7,上方設(shè)有第二 固定部件6,其特征在于，所述硝酸纖維素膜1中間部位檢測線8包被有ΜΡ0抗體，檢測線兩 邊分別設(shè)有控制線9,所述偶合物墊片2上涂布有金標(biāo)記的ΜΡ0單克隆抗體或多克隆抗體以 及控制線偶合物。
[0009] 優(yōu)選地，所述控制線9包被有抗DNP抗體，所述控制線偶合物為DNP-BSA標(biāo)記的膠 體金。BSA是牛血清白蛋白。
[0010] 優(yōu)選地，所述第一固定部件7為雙面膠，第二固定部件6為單面膠。
[0011] 優(yōu)選地，所述兩條控制線9與檢測線8為平行設(shè)置。
[0012] 本實用新型的另一個目的是提供了一種快速定量檢測ΜΡ0的膠體金試紙盒，在本 實用新型所述的定量檢測ΜΡ0的膠體金試紙的基礎(chǔ)上還包括一外殼10。
[0013] 所述外殼優(yōu)選塑料外殼。
[0014] 所述外殼包裹所述試紙，露出樣本墊片3、硝酸纖維素膜1上的檢測線8和兩條控 制線9、以及吸水墊4。
[0015] 本實用新型所述的試紙盒具有方便攜帶和貯存的優(yōu)點。
[0016] 本實用新型所述的快速定量檢測ΜΡ0的膠體金試紙或試紙盒的工作原理是：采用 雙向側(cè)流免疫反應(yīng)原理，通過雙抗體夾心法制備而成。檢驗時樣本中的ΜΡ0抗原首先與偶 合墊上的ΜΡ0抗體偶合物發(fā)生免疫反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物。其后免疫復(fù)合物隨著樣本在硝 基纖維素膜上層析流動，當(dāng)免疫復(fù)合物層析至硝基纖維素膜上的檢測區(qū)（ΜΡ0檢測線）時， 與預(yù)先包被在硝基纖維素膜上的抗ΜΡ0抗體發(fā)生反應(yīng)從而被固定在硝基纖維素膜的檢測 線上。血液中的ΜΡ0越多，檢測線上的復(fù)合物越多，條帶上的光密度值就越高。同時，在檢 測過程中，控制線偶合物（即DNP-BSA標(biāo)記的膠體金)，也會隨樣本在硝基纖維素膜上層析， 當(dāng)層析至硝基纖維素膜的控制線時，DNP-BSA膠體金會與預(yù)先包被在硝基纖維素膜上的抗 DNP抗體發(fā)生反應(yīng)從而被固定在對照區(qū)(控制線)上。由于膠體金為紅色，因而固定在硝基纖 維素膜控制線上的抗DNP中的DNP-BSA膠體金免疫復(fù)合物將顯示紅色。當(dāng)樣本中不含MPO 時，則只顯示兩條控制線。當(dāng)樣本含MPO時，檢測線就會清晰的顯示出來。
[0017] 當(dāng)反應(yīng)結(jié)束后，利用多功能免疫檢測儀（瑞萊生物工程(深圳）有限公司）將控制 線和檢測線的光密度進(jìn)行分析，并將所分析得到的結(jié)果進(jìn)行運算，從而得到相對光密度值 (RI)。然后檢測儀根據(jù)已預(yù)先設(shè)置在檢測儀內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線對ΜΡ0的濃度進(jìn)行計算并顯示結(jié) 果，以pmol/L為單位表示。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1是本實用新型所述快速定量檢測ΜΡ0的膠體金試紙的一種優(yōu)選實施方式的結(jié) 構(gòu)示意圖。
[0019] 其中，1:硝酸纖維素膜，2 :偶合物墊片，3:樣本墊片，4:吸水墊，5:支撐墊片，6: 單面膠，7:雙面膠，8:檢測線，9:控制線。
[0020] 圖2是本實用新型所述快速定量檢測ΜΡ0的膠體金試紙盒的一種優(yōu)選實施方式的 示圖。
[0021] 其中，3:樣本墊片，8:檢測線，9:控制線，4:吸水墊，10 :外殼。

【具體實施方式】
[0022] 以下結(jié)合附圖對本實用新型所述快速定量檢測ΜΡ0的膠體金試紙或試紙盒進(jìn)行 詳細(xì)說明，不能理解為是對本實用新型的限制。以下實施例中所使用的材料和試劑除特別 說明外，均為普通市售。
[0023] 【實施例1】制備快速定量檢測ΜΡ0的膠體金試紙
[0024] 如圖1所示的膠體金試紙結(jié)構(gòu)，包括支撐墊片5,位于所述支撐墊片上的硝酸纖維 素膜1，所述硝酸纖維素膜的一端上方層疊連接吸水墊4,另一端上方層疊連接偶合物墊片 2,所述偶合物墊片遠(yuǎn)離硝酸纖維素膜1的一端上方層疊連接樣本墊片3,所述樣本墊片另 一端部的下方粘接雙面膠7,上方粘接單面膠6,其特征在于，所述硝酸纖維素膜1中間部位 檢測線8包被有ΜΡ0抗體，檢測線兩邊分別設(shè)有控制線9,所述偶合物墊片2上涂布有金標(biāo) 記的ΜΡ0單克隆抗體或多克隆抗體以及控制線偶合物。
[0025] 所述控制線9包被有抗DNP抗體，所述控制線偶合物為DNP-BSA標(biāo)記的膠體金。
[0026] 其中，硝酸纖維素膜1在膠體金試紙中用于固定包被抗體，同時也是免疫反應(yīng)的 發(fā)生處；檢測線8是將ΜΡ0抗體使用1*PBS、甲醇等緩沖液稀釋到0. 5mg/ml的濃度，取lul/ cm劃線于所述硝酸纖維素膜1上，37°C過夜干燥及60°C烘烤3天，即得；控制線9是將抗 DNP抗體使用1*PBS、甲醇等緩沖液稀釋到0. 5mg/ml的濃度，取lul/cm劃線于所述硝酸纖 維素膜1上，37°C過夜干燥及60°C烘烤3天，即得。
[0027] 其中，所述偶合物墊片2的原材料為玻璃纖維濾膜，將用于制備偶合物墊片 的玻璃纖維濾膜放入預(yù)封閉緩沖液(包含〇. 1-1%的酪蛋白，〇. 5-5%的牛血清白蛋白、 0. 005-0. 5%的硼酸、0. 01-0. 2%的PEG)中浸泡5分鐘后取出，37°C干燥后，用Biodot包膜 儀器將金標(biāo)記的ΜΡ0單克隆抗體或多克隆抗體以及控制線偶合物涂布在偶合物墊片2上， 涂布量是lul/mm，干燥，即得。優(yōu)選地，所述偶合物墊片2的預(yù)封閉緩沖液包含0. 8%的酪蛋 白，4%的牛血清白蛋白，0. 007%的硼酸，0. 1%的PEG。
[0028] 其中，所述樣本墊片3可對液態(tài)樣品起到初步過濾作用。將樣本墊片用141封閉 液(包含：〇. 1-1%的Tris，0. 1-1%的酪蛋白，0. 05-0. 5%的鼠抗人紅細(xì)胞）浸泡5分鐘后，過 夜37°C干燥，即得。優(yōu)選地，所述141封閉液包含：0. 3%的Tris，0. 8%的酪蛋白，0. 3%的鼠 抗人紅細(xì)胞。
[0029] 將上述各組成部件按圖1所示結(jié)構(gòu)粘貼在支撐墊片5上，獲得快速定量檢測ΜΡ0 的膠體金試紙。
[0030] 【實施例2】用本實用新型所述膠體金試紙快速定量檢測ΜΡ0
[0031] 取本實用新型優(yōu)選的一種快速定量檢測ΜΡ0的膠體金試紙，如圖1所示，所述膠體 金試紙包括支撐墊片5,位于所述支撐墊片上的硝酸纖維素膜1，所述硝酸纖維素膜的一端 上方層疊連接吸水墊4,另一端上方層疊連接偶合物墊片2,所述偶合物墊片遠(yuǎn)離硝酸纖維 素膜1的一端上方層疊連接樣本墊片3,所述樣本墊片另一端部的下方粘接雙面膠7,上方 粘接單面膠6,其特征在于，所述硝酸纖維素膜1中間部位檢測線8包被有ΜΡ0抗體，檢測線 兩邊分別設(shè)有控制線9,所述偶合物墊片2上涂布有金標(biāo)記的ΜΡ0單克隆抗體或多克隆抗體 以及控制線偶合物。優(yōu)選地，所述控制線9包被有抗DNP抗體，所述控制線偶合物為DNP-BSA 標(biāo)記的膠體金。按以下步驟進(jìn)行檢測：1)抽取的病人血清、血漿或全血等待檢樣本，如低溫 保存樣本需恢復(fù)至室溫。2)將待測樣品加入樣本墊片3上，反應(yīng)。3)判讀，將所述膠體金 試紙置于多功能免疫檢測儀，SSJ-2或MINI (瑞萊生物工程(深圳）有限公司）中判定結(jié)果。
[0032] 【實施例3】用本實用新型所述膠體金試紙盒快速定量檢測ΜΡ0
[0033] 取本實用新型優(yōu)選的一種快速定量檢測ΜΡ0的膠體金試紙盒，如圖1和圖2所示， 所述膠體金試紙包括支撐墊片5,位于所述支撐墊片上的硝酸纖維素膜1，所述硝酸纖維素 膜的一端連接吸水墊4,另一端連接偶合物墊片2,所述偶合物墊片連接樣本墊片3,所述樣 本墊片另一端部的下方粘接雙面膠7,上方粘接單面膠6,其特征在于，所述硝酸纖維素膜1 中間部位檢測線8包被有ΜΡ0抗體，檢測線兩邊分別設(shè)有控制線9,所述偶合物墊片2上涂 布有金標(biāo)記的ΜΡ0單克隆抗體或多克隆抗體以及控制線偶合物。優(yōu)選地，所述控制線9包 被有抗DNP抗體,所述控制線偶合物為DNP-BSA標(biāo)記的膠體金。所述膠體金試紙還包括一 外殼10,所述外殼包裹所述試紙，露出樣本墊片3、硝酸纖維素膜1上的檢測線8和兩條控 制線9、以及吸水墊4。按以下步驟進(jìn)行檢測：1)抽取的病人血清、血漿或全血等待檢樣本， 如低溫保存樣本需恢復(fù)至室溫。2)將待測樣品加入樣本墊片3上，反應(yīng)。3)判讀，將所述 膠體金試紙置于多功能免疫檢測儀，SSJ-2或MINI (瑞萊生物工程(深圳）有限公司）中判 定結(jié)果。
【權(quán)利要求】
1. 一種快速定量檢測MPO的膠體金試紙，包括支撐墊片（5)，位于所述支撐墊片上的硝 酸纖維素膜（1)，所述硝酸纖維素膜的一端連接吸水墊（4)，另一端連接偶合物墊片（2)，所 述偶合物墊片連接樣本墊片（3)，所述樣本墊片另一端部的下方設(shè)有第一固定部件（7)，上 方設(shè)有第二固定部件（6)，其特征在于，所述硝酸纖維素膜（1)中間部位檢測線（8)包被有 MP0抗體，檢測線兩邊分別設(shè)有控制線（9)，所述偶合物墊片（2)上涂布有金標(biāo)記的MP0單 克隆抗體或多克隆抗體以及控制線偶合物，所述控制線（9)包被有抗DNP抗體，所述控制線 偶合物為DNP-BSA標(biāo)記的膠體金。
2. 如權(quán)利要求1所述的膠體金試紙，其特征在于，所述第一固定部件（7)為雙面膠，第 二固定部件（6)為單面膠。
3. 如權(quán)利要求1-2中任一項所述的膠體金試紙，其特征在于，所述膠體金試紙外還包 括一外殼（10)，所述外殼包裹所述膠體金試紙外，露出樣本墊片（3)、硝酸纖維素膜（1)上 的檢測線（8)和兩條控制線（9)、以及吸水墊（4)。
4. 如權(quán)利要求3所述的膠體金試紙，其特征在于，所述兩條控制線（9)與檢測線（8)為 平行設(shè)置。
【文檔編號】G01N33/68GK203881771SQ201420113007
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月13日
【發(fā)明者】趙俊平, 劉紅劍, 黃華都, 彭曉倩 申請人:瑞萊生物工程（深圳）有限公司