一種快速定量檢測kim-1的膠體金試紙的制作方法
【專利摘要】本實用新型公開了一種快速定量檢測KIM-1的膠體金試紙，所述膠體金試紙包括支撐墊片5，位于所述支撐墊片上的硝酸纖維素膜1，所述硝酸纖維素膜的一端連接吸水墊4，另一端連接偶合物墊片2，所述偶合物墊片連接樣本墊片3，所述樣本墊片另一端部的下方設有第一固定部件7，上方設有第二固定部件6，其特征在于，所述硝酸纖維素膜1中間部位檢測線8包被有KIM-1抗體，檢測線兩邊分別設有控制線9，所述偶合物墊片2上涂布有金標記的KIM-1單克隆抗體或多克隆抗體以及控制線偶合物。
【專利說明】—種快速定量檢測KIM-1的膠體金試紙
【技術領域】
[0001]本實用新型屬于臨床醫(yī)學診斷領域，具體涉及一種用于定量檢測腎損傷分子-1 (IQM-1)的膠體金試紙。
【背景技術】
[0002]腎損傷分子-1 (KM-1)是由334個氨基酸殘基組成的I型跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白基因超家族。在正常的腎組織中幾乎不表達，但是在缺血及腎損傷后的人近曲小管上皮細胞中卻呈高表達狀態(tài)。KM-1參與腎臟疾病的損傷及修復過程，在近端小管上皮細胞黏附、生長及分化中起重要作用。腎損傷發(fā)生后組織KM-1胞外功能區(qū)被金屬蛋白酶介導裂解并釋放入尿，并且尿IQM-1水平和組織KM-1水平呈正相關。在診斷藥源性腎小管壞死、退化和/或膨脹，及組織細微變化或腎功能嚴重紊亂引起的嗜酸性粒細胞增多方面，KIM-1的檢測是高度靈敏、特異和精確的。
[0003]KIM-1是一種伴有細胞外免疫球蛋白和高度O糖基化mucin子域的跨膜蛋白成份。KIM-1分子的細胞外ectodomain(金屬蛋白酶水解脫下來的,可以分泌到尿液中)是AKI (急性腎衰竭)的一個定量標志物。在腎小管間質損害區(qū)域內(nèi)(伴有炎癥細胞浸潤與纖維化)高表達KM-1。在急性蛋白尿，小管上皮細胞表達KM-1增強。反過來，由于它可與其它蛋白質進行反應，它可能會主動性調節(jié)與損傷或修復相關的細胞事件或過程。尿中KIM-1的外功能域是人類AKI的特異性、敏感性、有前途的標志物，不受尿液理化物性的影響。腎小管受損后第I天KM-1升高至少5倍以上，而血清肌酐與尿素氮晚到受損后第3天才升高。心臟手術后幾個小時就會檢測到KM-1在尿液中大幅增長現(xiàn)象。尿KM-1排泄水平升高對于檢測腎臟缺血相當有特異性，而且?guī)缀酹毩⒂诼阅I病的類型或尿道感染。對于AKI患者而g，聞水平KIM-1預不患者的預后較差。
[0004]有研究數(shù)據(jù)顯示ICU危重病患者80%的ARF(急性腎臟衰竭)由急性腎小管損傷所致，而非腎小球或間質性病變。KIM-1是腎小管損傷最敏感的標志物。多個動物實驗和臨床實驗證明KM-1與多種因素所致腎小管損傷有關:1.缺血腎小管損傷；2.中毒性腎小管損傷；3.蛋白負荷過重腎小管損傷。KIM-1作為AKI診斷標志物具有以下的優(yōu)勢:1.敏感性高。其在正常組織不表達，AKI發(fā)生時，其在近端小管上皮細胞的表達才顯著上調，并一直持續(xù)到細胞完全康復；2.特異性很高，特別是對缺血性或腎毒性AKI特異性更高，在其他器官很少表達；3.其胞外部分脫落進入尿液后性質比較穩(wěn)定，容易檢測；4.極少受到慢性腎臟疾病和尿路感染的影響。
[0005]免疫膠體金技術(Immune colloidal gold technique)是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術。膠體金是由氯金酸(HAuC14)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷，可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合，由于這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物特性。膠體金除了與蛋白質結合以外，還可以與許多其它生物大分子結合。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結合物的免疫和生物學特性，因而使膠體金廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。
[0006]目前，檢測腎損傷分子-1(KM-1)的方法目前主要是酶聯(lián)免疫技術(ELISA)，ELISA技術存在以下缺點:檢測設備要求高，成本高；干擾因素較多，重復性不好；檢測時間長。因此酶聯(lián)免疫技術檢測腎損傷分子-1 (KIM-1)不適合臨床快速診斷。鑒于目前尚無快速的定量檢測方法，本實用新型的目的是提供一種可用于快速定量檢測腎損傷分子-1 (KIM-1)的膠體金試紙以及一種可用于快速定量檢測腎損傷分子-1 (KIM-1)的膠體金試紙盒，所述膠體金試紙和膠體金試紙盒具有方便快捷、操作簡單、結果準確等優(yōu)點。
實用新型內(nèi)容
[0007]本實用新型的一個目的是提供一種快速定量檢測腎損傷分子-1 (KIM-1)的膠體金試紙，本實用新型所述快速定量檢測腎損傷分子-1 (KIM-1)的膠體金試紙具有方便快捷、操作簡單、結果準確等優(yōu)點，適于臨床快速診斷。
[0008]本實用新型的技術方案是:
[0009]一種快速定量檢測腎損傷分子-1的膠體金試紙，包括支撐墊片5，位于所述支撐墊片上的硝酸纖維素膜1，所述硝酸纖維素膜的一端連接吸水墊4，另一端連接偶合物墊片2，所述偶合物墊片連接樣本墊片3，所述樣本墊片另一端部的下方設有第一固定部件7，上方設有第二固定部件6，其特征在于，所述硝酸纖維素膜I中間部位檢測線8包被有KIM-1抗體，檢測線兩邊分別設有控制線9，所述偶合物墊片2上涂布有金標記的KM-1單克隆抗體或多克隆抗體以及控制線偶合物。
[0010]優(yōu)選地,所述控制線9包被有抗DNP抗體,所述控制線偶合物為DNP-BSA標記的膠體金。BSA是牛血清白蛋白。
[0011]優(yōu)選地，所述第一固定部件7為雙面膠，第二固定部件6為單面膠。
[0012]優(yōu)選地，所述兩條控制線9與檢測線8為平行設置。
[0013]本實用新型的另一個目的是提供了一種快速定量檢測腎損傷分子-1的膠體金試紙盒，在本實用新型所述的定量檢測腎損傷分子-1的膠體金試紙的基礎上還包括一外殼10。
[0014]所述外殼優(yōu)選塑料外殼。
[0015]所述外殼包裹所述試紙，露出樣本墊片3、硝酸纖維素膜I上的檢測線8和兩條控制線9、以及吸水墊4。
[0016]本實用新型所述的試紙盒具有方便攜帶和貯存的優(yōu)點。
[0017]本實用新型所述的快速定量檢測腎損傷分子-1 (KIM-1)的膠體金試紙或試紙盒的工作原理是:采用雙向側流免疫反應原理,通過雙抗體夾心法制備而成。檢驗時樣本中的KIM-1抗原首先與偶合墊上的KM-1抗體偶合物發(fā)生免疫反應，形成免疫復合物。其后免疫復合物隨著樣本在硝基纖維素膜上層析流動，當免疫復合物層析至硝基纖維素膜上的檢測區(qū)(IQM-1檢測線)時，與預先包被在硝基纖維素膜上的抗KM-1抗體發(fā)生反應從而被固定在硝基纖維素膜的檢測線上。樣本中的KM-1越多，檢測線上的復合物越多，條帶上的光密度值就越高。同時，在檢測過程中，控制線偶合物(即DNP-BSA標記的膠體金)，也會隨樣本在硝基纖維素膜上層析，當層析至硝基纖維素膜的控制線時，DNP-BSA膠體金會與預先包被在硝基纖維素膜上的抗DNP抗體發(fā)生反應從而被固定在對照區(qū)(控制線)上。由于膠體金為紅色，因而固定在硝基纖維素膜控制線上的抗DNP中的DNP-BSA膠體金免疫復合物將顯示紅色。當樣本中不含KM-1時，則只顯示兩條控制線。當樣本含KM-1時，檢測線就會清晰的顯示出來。
[0018]當反應結束后，利用多功能免疫檢測儀(瑞萊生物工程(深圳)有限公司)將控制線和檢測線的光密度進行分析，并將所分析得到的結果進行運算，從而得到相對光密度值(RI)。然后檢測儀根據(jù)已預先設置在檢測儀內(nèi)的標準曲線對KM-1的濃度進行計算并顯示結果，以ng/mL為單位表示。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是本實用新型所述快速定量檢測腎損傷分子-1的膠體金試紙的一種優(yōu)選實施方式的結構示意圖。
[0020]其中，1:硝酸纖維素膜，2:偶合物墊片，3:樣本墊片，4:吸水墊，5:支撐墊片，6:第二固定部件，7:第一固定部件，8:檢測線，9:控制線。
[0021]圖2是本實用新型所述快速定量檢測腎損傷分子-1的膠體金試紙盒的一種優(yōu)選實施方式的示圖。
[0022]其中，3:樣本墊片，8:檢測線，9:控制線，4:吸水墊，10:外殼。
【具體實施方式】
[0023]以下結合附圖對 本實用新型所述快速定量檢測腎損傷分子-1的膠體金試紙或試紙盒進行詳細說明，不能理解為是對本實用新型的限制。以下實施例中所使用的材料和試劑除特別說明外，均為普通市售。
[0024]【實施例1】制備快速定量檢測腎損傷分子-1的膠體金試紙
[0025]如圖1所示的膠體金試紙結構，包括支撐墊片5，位于所述支撐墊片上的硝酸纖維素膜1，所述硝酸纖維素膜的一端上方層疊連接吸水墊4，另一端上方層疊連接偶合物墊片2，所述偶合物墊片遠離硝酸纖維素膜I的一端上方層疊連接樣本墊片3，所述樣本墊片另一端部的下方粘接第一固定部件7，上方粘接第二固定部件6，其特征在于，所述硝酸纖維素膜I中間部位檢測線8包被有KIM-1抗體，檢測線兩邊分別設有控制線9，所述偶合物墊片2上涂布有金標記的KM-1單克隆抗體或多克隆抗體以及控制線偶合物。
[0026]所述控制線9包被有抗DNP抗體,所述控制線偶合物為DNP-BSA標記的膠體金。
[0027]其中，硝酸纖維素膜I在膠體金試紙中用于固定包被抗體，同時也是免疫反應的發(fā)生處；檢測線8是將KM-1抗體使用1*PBS、甲醇等緩沖液稀釋到0.5mg/ml的濃度，取lul/cm劃線于所述硝酸纖維素膜I上，37°C過夜干燥及60°C烘烤3天，即得；控制線9是將抗DNP抗體使用1*PBS、甲醇等緩沖液稀釋到0.5mg/ml的濃度,取lul/cm劃線于所述硝酸纖維素膜I上，37°C過夜干燥及60°C烘烤3天，即得。
[0028]其中，所述偶合物墊片2的原材料為玻璃纖維濾膜，將用于制備偶合物墊片的玻璃纖維濾膜放入預封閉緩沖液(包含0.1-1%的酪蛋白，0.5-5%的牛血清白蛋白、0.005-0.5%的硼酸、0.01-0.2%的PEG)中浸泡5分鐘后取出，37°C干燥后，用B1dot包膜儀器將金標記的KIM-1單克隆抗體或多克隆抗體以及控制線偶合物涂布在偶合物墊片2上，涂布量是lul/mm，干燥，即得。優(yōu)選地，所述偶合物墊片2的預封閉緩沖液包含0.8%的酪蛋白，4%的牛血清白蛋白，0.007%的硼酸，0.1 %的PEG。
[0029]其中，所述樣本墊片3可對液態(tài)樣品起到初步過濾作用。將樣本墊片用141封閉液(包含:0.1-1% 的 Tris，0.1-1% 的 Tween20，0.1-1% 的酪蛋白，0.05-0.5% 的鼠抗人紅細胞)浸泡5分鐘后，過夜37°C干燥，即得。優(yōu)選地，所述141封閉液包含:0.3%的Tris，
0.8%的酪蛋白，0.3%的鼠抗人紅細胞。
[0030]將上述各組成部件按圖1所示結構粘貼在支撐墊片5上，獲得快速定量檢測腎損傷分子-1的膠體金試紙。
[0031]【實施例2】用本實用新型所述膠體金試紙快速定量檢測腎損傷分子-1
[0032]取本實用新型優(yōu)選的一種快速定量檢測腎損傷分子-1的膠體金試紙，如圖1所示，所述膠體金試紙包括支撐墊片5，位于所述支撐墊片上的硝酸纖維素膜1，所述硝酸纖維素膜的一端上方層疊連接吸水墊4，另一端上方層疊連接偶合物墊片2，所述偶合物墊片遠離硝酸纖維素膜I的一端上方層疊連接樣本墊片3，所述樣本墊片另一端部的下方粘接第一固定部件7，上方粘第二固定部件6，其特征在于，所述硝酸纖維素膜I中間部位檢測線8包被有KM-1抗體，檢測線兩邊分別設有控制線9，所述偶合物墊片2上涂布有金標記的KIM-1單克隆抗體或多克隆抗體以及控制線偶合物。優(yōu)選地，所述控制線9包被有抗DNP抗體，所述控制線偶合物為DNP-BSA標記的膠體金。按以下步驟進行檢測:1)收集的病人尿液樣品，如低溫保存樣本需恢復至室溫。2)將待測樣品加入樣本墊片3上，反應。3)判讀，將所述膠體金試紙置于多功能免疫檢測儀，SSJ-2或MINI (瑞萊生物工程(深圳)有限公司)中判定結果。 [0033]【實施例3】用本實用新型所述膠體金試紙盒快速定量檢測腎損傷分子-1
[0034]取本實用新型優(yōu)選的一種快速定量檢測腎損傷分子-1的膠體金試紙盒，如圖1和圖2所示，所述膠體金試紙包括支撐墊片5，位于所述支撐墊片上的硝酸纖維素膜1，所述硝酸纖維素膜的一端連接吸水墊4，另一端連接偶合物墊片2，所述偶合物墊片連接樣本墊片3，所述樣本墊片另一端部的下方粘接第一固定部件7，上方粘接第二固定部件6，其特征在于，所述硝酸纖維素膜I中間部位檢測線8包被有KIM-1抗體，檢測線兩邊分別設有控制線9，所述偶合物墊片2上涂布有金標記的KM-1單克隆抗體或多克隆抗體以及控制線偶合物。優(yōu)選地，所述控制線9包被有抗DNP抗體，所述控制線偶合物為DNP-BSA標記的膠體金。所述膠體金試紙還包括一外殼10，所述外殼包裹所述試紙，露出樣本墊片3、硝酸纖維素膜I上的檢測線8和兩條控制線9、以及吸水墊4。按以下步驟進行檢測:I)收集的病人尿液樣品，如低溫保存樣本需恢復至室溫。2)將待測樣品加入樣本墊片3上，反應。3)判讀，將所述膠體金試紙置于多功能免疫檢測儀，SSJ-2或MINI (瑞萊生物工程(深圳)有限公司)中判定結果。
【權利要求】
1.一種快速定量檢測KM-1的膠體金試紙，包括支撐墊片(5)，位于所述支撐墊片上的硝酸纖維素膜(I)，所述硝酸纖維素膜的一端連接吸水墊(4)，另一端連接偶合物墊片(2)，所述偶合物墊片連接樣本墊片(3)，所述樣本墊片另一端部的下方設有第一固定部件(7)，上方設有第二固定部件出)，其特征在于，所述硝酸纖維素膜(I)中間部位檢測線(8)包被有KM-1抗體，檢測線兩邊分別設有控制線(9)，所述偶合物墊片(2)上涂布有金標記的KIM-1單克隆抗體或多克隆抗體以及控制線偶合物。
2.如權利要求1所述的膠體金試紙，其特征在于，所述控制線(9)包被有抗DNP抗體，所述控制線偶合物為DNP-BSA標記的膠體金。
3.如權利要求1所述的膠體金試紙，其特征在于，所述第一固定部件(7)為雙面膠，第二固定部件(6)為單面膠。
4.如權利要求1-3中任一項所述的膠體金試紙，其特征在于，所述膠體金試紙外還包括一外殼(10),所述外殼包裹所述膠體金試紙外,露出樣本墊片(3)、硝酸纖維素膜(I)上的檢測線⑶和兩條控制線(9)、以及吸水墊(4)。
5.如權利要求4所述的膠體金試紙，其特征在于，所述兩條控制線(9)與檢測線(8)為平行設置。
【文檔編號】G01N33/68GK203825013SQ201420119325
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年3月14日 優(yōu)先權日:2014年3月14日
【發(fā)明者】劉紅劍, 趙俊平, 何曉紅, 劉春莉 申請人:瑞萊生物工程（深圳）有限公司