本發(fā)明涉及一種抗生素的測(cè)定方法，特別是涉及一種水樣中四環(huán)素類(lèi)抗生素的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：四環(huán)素類(lèi)抗生素(Tetracyclineantibiotics，TCs)是由放線菌產(chǎn)生的一類(lèi)廣譜抗生素，包括四環(huán)素、土霉素、金霉素等，被廣泛用于人類(lèi)的疾病的治療以及畜禽養(yǎng)殖業(yè)。由于四環(huán)素類(lèi)抗生素的大量使用，且其在生物活體中的不完全代謝而被排泄至水環(huán)境中，故水環(huán)境中四環(huán)素類(lèi)抗生素的量逐步積累，可能激發(fā)微生物的選擇性遺傳變異而導(dǎo)致出現(xiàn)抗生素耐藥病原體，對(duì)環(huán)境微生物種群造成危害，并進(jìn)而對(duì)水體系統(tǒng)產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的破壞?，F(xiàn)有技術(shù)中，用于檢測(cè)四環(huán)素類(lèi)抗生素的方法有熒光分析法、毛細(xì)管電泳法、免疫分析法、薄層色譜法、液相色譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。例如高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有分離和檢測(cè)特點(diǎn)，被越來(lái)越多的用于四環(huán)素類(lèi)抗生素殘留的檢測(cè)。現(xiàn)有公開(kāi)的檢測(cè)方法，對(duì)于水體中痕量或超痕量的四環(huán)素類(lèi)抗生素的檢測(cè)顯得無(wú)能為力?，F(xiàn)有關(guān)于四環(huán)素類(lèi)殘留的研究，偏重于分析檢測(cè)。由于的特點(diǎn)，建立有效快速的分離富集技術(shù)對(duì)抗生素殘留污染監(jiān)控十分重要。因此，有希望開(kāi)發(fā)一種能夠檢測(cè)水體中痕量或超痕量的四環(huán)素類(lèi)抗生素的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種能夠檢測(cè)水體中痕量或超痕量的四環(huán)素類(lèi)抗生素的方法。本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種水樣中四環(huán)素類(lèi)抗生素的檢測(cè)方法，所述方法包括如下步驟：(1)樣品的預(yù)處理：往水樣中加入磁性材料，進(jìn)行磁固相萃??；萃取結(jié)束后過(guò)濾水樣得到磁性材料；往磁性材料中加入pH＝9～11的洗脫劑進(jìn)行超聲洗脫，形成洗脫液；將洗脫液進(jìn)行濾膜過(guò)濾，得到濾液；(2)檢測(cè)方法：使濾液通過(guò)高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜以測(cè)定濾液中的四環(huán)類(lèi)抗生素；所述液相色譜的條件為：色譜柱：ZORBAXEclipsePlusC18[(3.0～5.0mm)×(100～250mm)，1.8μm]，流動(dòng)相：乙腈和1％體積濃度的乙酸水溶液，柱溫：25～35℃，流速：0.3～0.5mL/min，進(jìn)樣量：5～10μL，所述質(zhì)譜條件為：干燥氣溫度：280～320℃，干燥氣流速：1～5l/min，霧化氣壓力：40～45psi，毛細(xì)管電壓：3000～4000V，噴嘴電壓：100～2000V；所述四環(huán)素類(lèi)抗生素包括選自差向四環(huán)素(ETC)、土霉素(OTC)、四環(huán)素(TC)、去甲金霉素(DMC)、金霉素(CTC)和脫水四環(huán)素(ATC)中的一種、兩種或三種以上的組合。本發(fā)明提供的水樣中四環(huán)素類(lèi)抗生素的檢測(cè)方法，在樣品檢測(cè)前需要先對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理方法包括：往水樣中加入磁性材料，進(jìn)行磁固相萃取；萃取結(jié)束后過(guò)濾水樣得到磁性材料；往磁性材料中加入pH＝9～11的洗脫劑進(jìn)行超聲洗脫，形成洗脫液；將洗脫液進(jìn)行濾膜過(guò)濾，得到濾液。優(yōu)選的是，磁性材料的用量為1～25mg磁性材料/100mL水樣，洗脫劑選自pH＝9～11的氨水溶液，萃取溫度為10～60℃，萃取時(shí)間為1～60min，濾膜為≤0.45μm的濾膜。本發(fā)明提供的水樣中四環(huán)素類(lèi)抗生素的檢測(cè)方法，在樣品預(yù)處理好后，通過(guò)高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜以測(cè)定濾液中的四環(huán)類(lèi)抗生素的含量。所述液相色譜的測(cè)試條件為：色譜柱：ZORBAXEclipsePlusC18[(3.0～5.0mm)×(100～250mm)，1.8μm]，流動(dòng)相：乙腈和1％體積濃度的乙酸水溶液，柱溫：25～35℃，流速：0.3～0.5mL/min，進(jìn)樣量：5～10μL，梯度洗脫。優(yōu)選的是，色譜柱：ZORBAXEclipsePlusC18(3.0mm×100mm，1.8μm)，流動(dòng)相：乙腈和1％(v/v)乙酸水溶液，柱溫：35℃，流速：0.3mL/min，進(jìn)樣體積：10μL。上述梯度洗脫，優(yōu)選的是，按照下表1進(jìn)行：表1所述質(zhì)譜的測(cè)試條件為：干燥氣溫度：280～320℃，干燥氣流速：1～5l/min，霧化氣壓力：40～45psi，毛細(xì)管電壓：3000～4000V，噴嘴電壓：100～2000V。優(yōu)選的是，干燥氣溫度：300℃，干燥氣流速：5l/min，霧化氣壓力：45psi，毛細(xì)管電壓：3500V，噴嘴電壓：1000V。優(yōu)選的是，所述質(zhì)譜的測(cè)試條件中，干燥氣、霧化氣和鞘氣均為高純氮?dú)?，?shù)據(jù)采集模式：多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)。本發(fā)明提供的水樣中四環(huán)素類(lèi)抗生素的檢測(cè)方法，所述四環(huán)素類(lèi)抗生素的含量按照外標(biāo)法方法計(jì)算。附圖說(shuō)明圖1為樣品1中四環(huán)素類(lèi)抗生素的MRM譜圖，其中：1為差向四環(huán)素(ETC)，2為土霉素(OTC)。圖2為樣品2中四環(huán)素類(lèi)抗生素的MRM譜圖，其中：1為差向四環(huán)素(ETC)，2為土霉素(OTC)，3為四環(huán)素(TC)，4為脫水四環(huán)素(ATC)。圖3為樣品3中四環(huán)素類(lèi)抗生素的MRM譜圖，其中：1為土霉素(OTC)，2為脫水四環(huán)素(ATC)。圖4為樣品4中四環(huán)素類(lèi)抗生素的MRM譜圖，其中：1為差向四環(huán)素(ETC)，2為四環(huán)素(TC)。圖5為樣品5中四環(huán)素類(lèi)抗生素的MRM譜圖，其中：1為土霉素(OTC)，2為去甲金霉素(DMC)，3為金霉素(CTC)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，但并不將本發(fā)明局限于這些具體實(shí)施方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明涵蓋了權(quán)利要求書(shū)范圍內(nèi)所可能包括的所有備選方案、改進(jìn)方案和等效方案。實(shí)施例1、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制六種1000mg·L-1四環(huán)素類(lèi)抗生素的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱(chēng)取差向四環(huán)素(ETC)，土霉素(OTC)，四環(huán)素(TC)，去甲金霉素(DMC)，金霉素(CTC)，脫水四環(huán)素(ATC)各10mg(精確至0.0001g)于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解至刻度，搖勻。各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液均在避光、-4℃的冰箱中保存，備用。1000μg·L-1六種四環(huán)素類(lèi)抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：將1000mg·L-1的差向四環(huán)素(ETC)、土霉素(OTC)、四環(huán)素(TC)、去甲金霉素(DMC)、金霉素(CTC)、脫水四環(huán)素(ATC)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液分別用甲醇逐級(jí)稀釋至10mg·L-1，得到差向四環(huán)素(ETC)、土霉素(OTC)、四環(huán)素(TC)、去甲金霉素(DMC)、金霉素(CTC)和脫水四環(huán)素(ATC)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。各取1mL于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解至刻度，搖勻，在避光、-4℃的冰箱中保存，備用。實(shí)施例2、樣品預(yù)處理100mL水樣經(jīng)0.45μm濾膜除去懸浮物，并加入約1.5mg磁性材料，在40℃恒溫水浴中加熱攪拌15min進(jìn)行磁固相萃取，使用磁鐵收集萃取完全后的磁性材料，棄去萃取后的水樣。然后用10mL氨水(pH＝11)超聲10min進(jìn)行洗脫，并在磁鐵作用下收集洗脫溶液，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后，得到濾液待用。實(shí)施例3、方法的線性相關(guān)性和靈敏度按照實(shí)施例1所述的方法，準(zhǔn)確量取適量的六種四環(huán)素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000μg·L-1)，用甲醇稀釋?zhuān)@得質(zhì)量濃度分別為1、5、10、20、50和100μg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，實(shí)驗(yàn)表明，六種四環(huán)素在1～100μg·L-1的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)定量離子的峰面積(y)與質(zhì)量濃度(x)的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2≥0.995，檢出限(LOD，S/N＝3)和定量限(LOQ，S/N＝10)范圍分別是2.44～25.21ng·L-1和8.14～84.03ng·L-1。(見(jiàn)表2)表2六種四環(huán)素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限四環(huán)素類(lèi)抗生素線性回歸方程相關(guān)系數(shù)(r2)檢出限/(ng/L)定量限/(ng/L)差向四環(huán)素y＝26781.9x+25238.90.99759.2030.67土霉素y＝26322.5x+53807.50.99843.4911.64四環(huán)素y＝31525.8x+12857.20.99934.7815.92去甲金霉素y＝11614.6x-372.30.999125.2184.03金霉素y＝8760.0x+2799.70.999320.9869.93脫水四環(huán)素y＝25278.8x+30483.60.99672.448.14實(shí)施例4、方法的回收率和精密度在已知濃度為10μg·L-1的水樣中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行加標(biāo)回收率的測(cè)定。加入不同體積的六種四環(huán)素混標(biāo)(100μg·L-1)，配制成30、50和70μg·L-1的水樣進(jìn)行3個(gè)水平濃度實(shí)際樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)。按樣品預(yù)處理方法處理后進(jìn)行HPLC-MS/MS測(cè)定，計(jì)算回收率。分別在樣品處理當(dāng)日不同時(shí)間點(diǎn)和不同處理天數(shù)進(jìn)樣分析(n＝6)，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度。六種四環(huán)素的加標(biāo)回收率均大于80％，日內(nèi)精密度和日間精密度分別小于2.5％和7.1％。方法的回收率和精密度結(jié)果見(jiàn)表3。從回收率數(shù)據(jù)可知，本申請(qǐng)?zhí)峁┑臉悠奉A(yù)處理方法具有較高的回收率，能夠滿(mǎn)足測(cè)試要求。表3六種四環(huán)素的回收率和精密度實(shí)施例5、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)檢測(cè)條件(1)液相色譜的測(cè)試條件為：色譜柱：ZORBAXEclipsePlusC18(3.0mm×100mm，1.8μm)；流動(dòng)相：A為乙腈，B為1％(v/v)乙酸水溶液，梯度洗脫；柱溫：35℃；流速：0.3mL/min；進(jìn)樣體積：10μL；梯度洗脫按照下表進(jìn)行：表4(2)質(zhì)譜的測(cè)試條件為：干燥氣溫度：300℃；干燥氣流速：5l/min；霧化氣壓力：45psi；鞘氣溫度：250℃；鞘氣流速：10l/min；毛細(xì)管電壓：3500V；噴嘴電壓：1000V；干燥氣、霧化氣和鞘氣均為高純氮?dú)?；?shù)據(jù)采集模式：多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)。實(shí)施例6、實(shí)際樣品的測(cè)定按照實(shí)施例5所述高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)檢測(cè)條件，對(duì)杭州市某河段中得到樣品1～5中進(jìn)行測(cè)試分析，確定其中四環(huán)素抗生素的殘留濃度。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。測(cè)試譜圖見(jiàn)附圖1～5。表5廢水樣品中6種四環(huán)素的測(cè)定(n＝3)注：ND是未檢出。由表5和附圖1-5可知，本發(fā)明提供的方法能夠準(zhǔn)確測(cè)出水樣中四環(huán)素類(lèi)抗生素的含量，操作簡(jiǎn)便、快速、綠色環(huán)保、結(jié)果可靠、檢出限低、重現(xiàn)性好。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3