本發(fā)明涉及一種預(yù)測(cè)細(xì)胞(通常是哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞)表型不穩(wěn)定性的方法。

發(fā)明背景

從調(diào)控的角度來看穩(wěn)定性的主要方面僅指產(chǎn)物，即該產(chǎn)物一致的特性(例如一致的糖型和更普遍的體內(nèi)活性)。

但是，從生產(chǎn)的角度來看，穩(wěn)定性的重要方面理所當(dāng)然的是產(chǎn)物的質(zhì)量，還有生產(chǎn)克隆細(xì)胞系的一致生長(zhǎng)和產(chǎn)率。例如，根據(jù)Lonza^TM指南，倍增數(shù)超過40(大約10次傳代)產(chǎn)物滴定度的變化超過30％則被認(rèn)為是不穩(wěn)定的細(xì)胞系。

該細(xì)胞系的改變可以歸因于基因復(fù)制數(shù)目、mRNA復(fù)制數(shù)目的改變，以及整個(gè)細(xì)胞潛在的改變(即蛋白質(zhì)組和代謝組的改變)。細(xì)胞基因組的改變表明一定程度的表型基因的不穩(wěn)定或者“突變表型”(Loeb等，1999)。任何已經(jīng)變成這種表型的克隆細(xì)胞系很有可能會(huì)出現(xiàn)表型中其它相關(guān)改變。

本發(fā)明的目的是至少解決一個(gè)上文提及的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種預(yù)測(cè)細(xì)胞系表型穩(wěn)定性的方法，包括以下步驟：

-在測(cè)定期培養(yǎng)所述細(xì)胞系；

-在測(cè)定期的多個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生細(xì)胞系的環(huán)境響應(yīng)指紋，其中每個(gè)環(huán)境響應(yīng)指紋通過在多種化學(xué)細(xì)胞應(yīng)激源存在時(shí)測(cè)定細(xì)胞的環(huán)境響應(yīng)產(chǎn)生；以及

-比較多個(gè)環(huán)境響應(yīng)指紋以檢測(cè)測(cè)定期所述環(huán)境響應(yīng)指紋的改變，其中在測(cè)定期所述環(huán)境響應(yīng)指紋的改變程度指示所述細(xì)胞系中預(yù)測(cè)的表型不穩(wěn)定性程度。

典型地，比較多個(gè)環(huán)境響應(yīng)指紋以檢測(cè)測(cè)定期環(huán)境響應(yīng)指紋改變的步驟包括：檢測(cè)所述或每種化學(xué)細(xì)胞應(yīng)激源特異性環(huán)境響應(yīng)的改變的步驟。

合適地，所述環(huán)境響應(yīng)是生長(zhǎng)響應(yīng)。

優(yōu)選地，所述多個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)在測(cè)定期跨越一代或多代。

典型地，所述環(huán)境響應(yīng)指紋在測(cè)定期內(nèi)產(chǎn)生三個(gè)或更多個(gè)時(shí)間點(diǎn)。

合適地，所述環(huán)境響應(yīng)指紋在測(cè)定期內(nèi)產(chǎn)生四個(gè)或更多個(gè)時(shí)間點(diǎn)。

通常，每個(gè)環(huán)境響應(yīng)指紋通過在至少三種不同的化學(xué)細(xì)胞應(yīng)激源中的每種存在時(shí)測(cè)定細(xì)胞的環(huán)境響應(yīng)而產(chǎn)生。

優(yōu)選地，每個(gè)環(huán)境響應(yīng)指紋通過在至少五種不同的化學(xué)細(xì)胞應(yīng)激源中的每種存在時(shí)測(cè)定細(xì)胞的環(huán)境響應(yīng)而產(chǎn)生。

合適地，該化學(xué)細(xì)胞應(yīng)激源選自于氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑、細(xì)胞周期抑制劑、碳源、滲透壓應(yīng)激源、氧化應(yīng)激源、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑、代謝效應(yīng)物、pH調(diào)節(jié)劑、糖酵解抑制劑和毒素。

通常，所述細(xì)胞系是哺乳動(dòng)物的生產(chǎn)細(xì)胞系。

典型地，在測(cè)定期的環(huán)境響應(yīng)指紋的改變是測(cè)定的數(shù)學(xué)模型方法，適當(dāng)?shù)厥鞘褂靡粋€(gè)或多個(gè)具有已知的表型穩(wěn)定性或不穩(wěn)定性或二者的細(xì)胞環(huán)境響應(yīng)指紋產(chǎn)生的數(shù)學(xué)模型。典型地，所述數(shù)學(xué)模型使用選自于歐幾里得距離、馬哈拉諾比斯距離、LDA距離、PCA距離的方法。

本發(fā)明也提供一種鑒定細(xì)胞的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括：

-包括多個(gè)反應(yīng)室的裝置；

-單獨(dú)設(shè)置在所述反應(yīng)室中的多種化學(xué)細(xì)胞應(yīng)激源；

-在多種化學(xué)細(xì)胞應(yīng)激源中的每種存在時(shí)測(cè)定細(xì)胞的環(huán)境響應(yīng)的測(cè)定系統(tǒng)；

-存儲(chǔ)多個(gè)環(huán)境響應(yīng)指紋的存儲(chǔ)系統(tǒng)，每個(gè)環(huán)境響應(yīng)指紋對(duì)應(yīng)細(xì)胞的多個(gè)環(huán)境響應(yīng)；

-配置用于比較多個(gè)環(huán)境響應(yīng)指紋中的至少一些以檢測(cè)環(huán)境響應(yīng)指紋改變的比較系統(tǒng)；以及

-顯示比較步驟輸出的顯示系統(tǒng)。

合適地，所述環(huán)境響應(yīng)指紋是生長(zhǎng)響應(yīng)指紋。

典型地，所述裝置是微量滴定板。

合適地，所述比較系統(tǒng)包括計(jì)算模型，該計(jì)算模型配置用于輸入在測(cè)定期的多個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞環(huán)境響應(yīng)指紋，比較所述生長(zhǎng)響應(yīng)指紋以檢測(cè)指紋的改變，并且輸出部分基于指紋部分的改變的內(nèi)容。

發(fā)明詳述

在本說明書中，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”是指任何細(xì)胞類型，包括原核或真核細(xì)胞。合適地，所述細(xì)胞是真核細(xì)胞，理想情況下是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。典型地，所述細(xì)胞是生產(chǎn)細(xì)胞，優(yōu)選地是哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是克隆得到的或者非克隆得到的。在優(yōu)選實(shí)施例中，所述細(xì)胞是來自一組克隆細(xì)胞中克隆體，其來源于單親細(xì)胞群或來源于不同轉(zhuǎn)染細(xì)胞。所述細(xì)胞也可以是來源于不同的細(xì)胞系，比如基因修飾細(xì)胞(即“基因敲除”或者“基因敲入”突變細(xì)胞)。所述細(xì)胞系也可以來源于定向演化，通過選定已經(jīng)適應(yīng)特定目標(biāo)環(huán)境的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“不同的細(xì)胞組”應(yīng)該理解為彼此不相同的一組細(xì)胞。比如，該組細(xì)胞可以包括一組所有都來源于單親細(xì)胞群的克隆細(xì)胞?；蛘撸摻M細(xì)胞可以包括獨(dú)立克隆起源(比如攜帶有不同轉(zhuǎn)基因或不同突變基因)的細(xì)胞，該組細(xì)胞可以包括非克隆細(xì)胞。所述細(xì)胞系也可以來源于定向演化，通過選定已經(jīng)適應(yīng)特定目標(biāo)環(huán)境的細(xì)胞。該組細(xì)胞也可以包括不同細(xì)胞類型的細(xì)胞，比如不同細(xì)胞系、不同細(xì)菌或真菌的菌株、同樣的細(xì)胞類型但是在不同發(fā)育階段的細(xì)胞，以及遺傳上不同的同樣細(xì)胞類型的細(xì)胞，比如同樣類型或起源的細(xì)胞或者來源于攜帶不同轉(zhuǎn)基因的同樣親本細(xì)胞群的細(xì)胞。

在本說明中，術(shù)語(yǔ)“克隆細(xì)胞組”應(yīng)該理解為一組克隆細(xì)胞群，該克隆細(xì)胞群來源于單細(xì)胞群并且包括2到500或更多的克隆細(xì)胞群。產(chǎn)生克隆細(xì)胞組的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，該方法描述在“Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells(在培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)重組蛋白治療劑)”(2004)(Wurm,Florian M,New York,NY,Nature Biotechnology 22(2004),S.1393-1398)。典型地，該組克隆細(xì)胞群包含10-500、20-500、30-500、40-500、50-500、60-500、70-500、80-500、90-500或100-500個(gè)克隆細(xì)胞群。典型地，該組克隆細(xì)胞群包含100-500、100-400、150-400、150-350個(gè)克隆細(xì)胞群。

本發(fā)明涉及用多種細(xì)胞應(yīng)激分子孵育細(xì)胞。這意味著將所述細(xì)胞與每種細(xì)胞應(yīng)激分子單獨(dú)培養(yǎng)，以在每種細(xì)胞應(yīng)激分子存在時(shí)獲得所述細(xì)胞的生長(zhǎng)響應(yīng)。用所述細(xì)胞應(yīng)激分子孵育細(xì)胞可以在任何合適的反應(yīng)釜中完成，比如在微量滴定板的孔中。典型地，該試驗(yàn)涉及將化學(xué)細(xì)胞應(yīng)激源和細(xì)胞樣品混合起來，并孵育該混合物1到4天，以及測(cè)定該細(xì)胞生長(zhǎng)程度。合適地，該細(xì)胞樣品的濃度為每毫升混合物有0.1至1.0×10⁶個(gè)細(xì)胞。典型地，該細(xì)胞應(yīng)激源的濃度為0.5至2×IC50，理想情況下約為1×IC50。合適地，在少于5天的孵育期后測(cè)定每種克隆細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。理想情況下，在1-4天之間的培養(yǎng)期后(理想情況下是在2到3天之后)測(cè)定每種克隆細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。優(yōu)選地，同時(shí)測(cè)定每種克隆細(xì)胞的生長(zhǎng)。

術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞應(yīng)激分子”或“細(xì)胞應(yīng)激源”應(yīng)該理解為能通過多種細(xì)胞途徑中的一種或多種引起細(xì)胞生長(zhǎng)下降的分子或化合物。典型地，多種化學(xué)細(xì)胞應(yīng)激源選自于由氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑、細(xì)胞周期抑制劑、碳源、滲透壓應(yīng)激源、氧化應(yīng)激源、細(xì)胞凋亡引發(fā)劑、代謝效應(yīng)物、pH調(diào)節(jié)劑、糖酵解抑制劑以及毒素組成的組。典型地，多種化學(xué)細(xì)胞應(yīng)激源包含的應(yīng)激源選自于包含該組至少4、5、6或者7組：氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑、細(xì)胞周期抑制劑、碳源、滲透壓應(yīng)激源、氧化應(yīng)激源、細(xì)胞凋亡引發(fā)劑、代謝效應(yīng)物、pH調(diào)節(jié)劑、糖酵解抑制劑以及毒素。

在本說明書中，應(yīng)用在細(xì)胞應(yīng)激分子中的術(shù)語(yǔ)“多種”應(yīng)該被理解為表示至少有三種不同的細(xì)胞應(yīng)激分子。典型地，該術(shù)語(yǔ)是指至少有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或者20種不同的細(xì)胞應(yīng)激分子。因此，可以通過使用少至三種不同的細(xì)胞應(yīng)激分子實(shí)施本發(fā)明所述方法以產(chǎn)生該細(xì)胞特異性生長(zhǎng)響應(yīng)指紋，比如：CoCl₂、NAV和MSB；Cadm、MSB和2DG；Cadm、dphe、MeiAB；dphe、MeIAB、Cadm；Dphe、Cadm、2dg；Dphe、乳酸鈉、2dg；Dphe、NaOx、檸檬酸；MeIAB、Cad、2dg。

術(shù)語(yǔ)“環(huán)境響應(yīng)”是指當(dāng)暴露在細(xì)胞應(yīng)激分子中時(shí)細(xì)胞可測(cè)量的響應(yīng)，比如生長(zhǎng)響應(yīng)、產(chǎn)量響應(yīng)(比如單克隆抗體滴定度)，或者糖基化響應(yīng)。典型地，該環(huán)境響應(yīng)是歸一化環(huán)境響應(yīng)，通過在存在和不存在細(xì)胞應(yīng)激分子時(shí)測(cè)量細(xì)胞的環(huán)境響應(yīng)以及確定由于存在細(xì)胞應(yīng)激分子時(shí)環(huán)境響應(yīng)的差異。

術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)響應(yīng)”是指存在細(xì)胞應(yīng)激分子時(shí)細(xì)胞的生長(zhǎng)。典型地，該生長(zhǎng)響應(yīng)是歸一化生長(zhǎng)響應(yīng)，通過在存在和不存在細(xì)胞應(yīng)激分子時(shí)測(cè)量生長(zhǎng)以及確定由于存在細(xì)胞應(yīng)激分子時(shí)生長(zhǎng)響應(yīng)的差異。可以使用任何該領(lǐng)域熟知的技術(shù)測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施例中，將染料加入到孵育混合物中并隨時(shí)間監(jiān)控染料發(fā)射的信號(hào)并將其與生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)起來。例如，可以使用熒光或者磷光染料。合適的染料例子是氧化還原染料，例如Presto(Invitrogen,Paisley,UK)。

術(shù)語(yǔ)“表型不穩(wěn)定”應(yīng)該理解為表示一種或多種細(xì)胞表型特征的不穩(wěn)定，比如生長(zhǎng)、生產(chǎn)能力以及重組蛋白產(chǎn)物特征。

術(shù)語(yǔ)“環(huán)境響應(yīng)指紋”是指應(yīng)通過將細(xì)胞與多種細(xì)胞應(yīng)激分子單獨(dú)反應(yīng)獲得針對(duì)特定細(xì)胞的多個(gè)環(huán)境響應(yīng)。該指紋具體表現(xiàn)為多個(gè)環(huán)境響應(yīng)值，或者可以具體表現(xiàn)為圖表或任何其它類型的可視圖像(比如圖案)的形式。指紋隨著時(shí)間的改變可以通過監(jiān)測(cè)所述或每個(gè)化學(xué)微環(huán)境中的環(huán)境改變來測(cè)定。

術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)響應(yīng)指紋”是指通過將該細(xì)胞與多種細(xì)胞應(yīng)激分子單獨(dú)反應(yīng)獲得針對(duì)特定細(xì)胞的多個(gè)生長(zhǎng)響應(yīng)。該指紋具體表現(xiàn)為多個(gè)生長(zhǎng)響應(yīng)值，或者可以具體表現(xiàn)為圖表或任何其它類型的可視圖像(比如圖案)的形式。

術(shù)語(yǔ)“測(cè)定期”是指待測(cè)細(xì)胞被培養(yǎng)的時(shí)間段。典型地，該測(cè)定期跨越至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或者20代細(xì)胞。

術(shù)語(yǔ)“多個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)”是指至少2、3、4、5、6、7、8、9或者10個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)。通常每個(gè)時(shí)間點(diǎn)間隔至少1、2或者3次傳代。

本發(fā)明的一個(gè)方面涉及在測(cè)定期比較細(xì)胞的環(huán)境響應(yīng)指紋(即生長(zhǎng)響應(yīng)指紋)，以檢測(cè)環(huán)境響應(yīng)指紋的改變，然后將其與所述細(xì)胞的穩(wěn)定性或不穩(wěn)定性關(guān)聯(lián)起來。應(yīng)用到環(huán)境響應(yīng)指紋的術(shù)語(yǔ)“改變”是指在測(cè)定期中發(fā)生環(huán)境響應(yīng)指紋的的至少一種差異?？梢圆捎酶鞣N方法來檢測(cè)環(huán)境響應(yīng)指紋隨著時(shí)間的改變，包括：數(shù)學(xué)建模、圖案識(shí)別或者通過肉眼觀察。比如，細(xì)胞在時(shí)間點(diǎn)A、B和C的環(huán)境響應(yīng)可以通過對(duì)細(xì)胞應(yīng)激源作圖來代表細(xì)胞在時(shí)間點(diǎn)A、B和C的環(huán)境響應(yīng)指紋。環(huán)境響應(yīng)指紋可以通過肉眼比較去鑒定指紋隨著時(shí)間的改變。通常，在測(cè)定期指紋的變化越大，細(xì)胞就越不穩(wěn)定。例如，根據(jù)Lonza^TM指南，倍增數(shù)超過40(大約10次傳代)產(chǎn)物滴定度的變化超過30％被認(rèn)為是不穩(wěn)定的細(xì)胞系。使用本發(fā)明的方法可以定量確定生長(zhǎng)響應(yīng)指紋的改變程度，根據(jù)Lonza定義將其與不穩(wěn)定的細(xì)胞系關(guān)聯(lián)起來，從而使用本發(fā)明的方法鑒定不穩(wěn)定的細(xì)胞系。在優(yōu)選實(shí)施例中，所述比較步驟可以通過數(shù)學(xué)建模實(shí)現(xiàn)，通常使用的數(shù)學(xué)模型是利用從具有已知的表型穩(wěn)定性和/或不穩(wěn)定性的細(xì)胞(例如，具有預(yù)先測(cè)定的穩(wěn)定性和預(yù)先測(cè)定的不穩(wěn)定性的細(xì)胞系)的環(huán)境響應(yīng)指紋(或者化學(xué)特異性環(huán)境響應(yīng))產(chǎn)生。該建模方法可以使用“線性判別分析”和“最相鄰歐幾里得距離最小化”，使用化學(xué)生長(zhǎng)響應(yīng)的子集。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，該方法涉及將測(cè)試細(xì)胞系的環(huán)境響應(yīng)指紋輸入到計(jì)算模型的步驟，其中該計(jì)算模型利用從具有已知的表型穩(wěn)定性的細(xì)胞系校準(zhǔn)組獲得的環(huán)境響應(yīng)指紋產(chǎn)生，其中該計(jì)算模型配置用于輸出該細(xì)胞系預(yù)測(cè)的穩(wěn)定性。該環(huán)境響應(yīng)指紋可以是在環(huán)境響應(yīng)(ΔCE)中的一個(gè)或者多個(gè)化學(xué)特異性變化。

本發(fā)明也提供一種鑒定細(xì)胞的系統(tǒng)或者試劑盒。該系統(tǒng)或者試劑盒通常包括帶有多個(gè)反應(yīng)室的裝置。優(yōu)選地，該裝置是微量滴定板，通常是至少具有12、24、48或者96個(gè)孔的微量滴定板。

該系統(tǒng)或者試劑盒通常包括多種細(xì)胞應(yīng)激分子。優(yōu)選地，該細(xì)胞應(yīng)激分子單獨(dú)放置在微量滴定板的孔內(nèi)，并且優(yōu)選地粘附在微量滴定板的孔內(nèi)。

該系統(tǒng)或者試劑盒包括在多種化學(xué)細(xì)胞應(yīng)激源中的每個(gè)存在時(shí)測(cè)定細(xì)胞環(huán)境(即生長(zhǎng))響應(yīng)的測(cè)定系統(tǒng)。通常，該測(cè)定系統(tǒng)包括配置用于檢測(cè)細(xì)胞在微量滴定板孔內(nèi)生長(zhǎng)的微量滴定板讀數(shù)器。合適的微量滴定板讀數(shù)器可以在市場(chǎng)上買到，并且由BMG公司出售。該測(cè)定系統(tǒng)通常具有計(jì)算機(jī)可執(zhí)行指令，以提供例如計(jì)算機(jī)可讀形式的生長(zhǎng)響應(yīng)數(shù)據(jù)。

該系統(tǒng)或者試劑盒也包括存儲(chǔ)系統(tǒng)以及比較系統(tǒng)(用于比較細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)響應(yīng)指紋)。這些功能模塊可以在一個(gè)或者多個(gè)計(jì)算機(jī)上執(zhí)行，或者通過利用一個(gè)或者多個(gè)計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)執(zhí)行。該測(cè)定系統(tǒng)具有計(jì)算機(jī)執(zhí)行指令，以提供例如計(jì)算機(jī)可讀形式的序列信息。

在測(cè)定系統(tǒng)中測(cè)定的信息能被存儲(chǔ)系統(tǒng)讀取。這里使用的“存儲(chǔ)系統(tǒng)”意在包括配置用于或者適用于存儲(chǔ)數(shù)據(jù)或信息的任何合適的計(jì)算或者處理設(shè)備或者其它的裝置。本發(fā)明適合使用的電子設(shè)備的例子包括獨(dú)立的計(jì)算機(jī)設(shè)備、數(shù)據(jù)電信網(wǎng)絡(luò)(包括局域網(wǎng)(LAN)、廣域網(wǎng)(WAN)、因特網(wǎng)、內(nèi)聯(lián)網(wǎng)和外聯(lián)網(wǎng))，以及本地和分布式計(jì)算機(jī)處理系統(tǒng)。存儲(chǔ)裝置還包括，但不限于：磁存儲(chǔ)介質(zhì)(比如軟盤、硬盤存儲(chǔ)介質(zhì)、磁帶)、光存儲(chǔ)介質(zhì)(比如CD-ROM、DVD)、電子存儲(chǔ)介質(zhì)(比如RAM、ROM、EPROM、EEPROM等)、普通硬盤和這些類型的混合體(比如磁/光存儲(chǔ)介質(zhì))。該存儲(chǔ)系統(tǒng)適于或配置用于攜帶在其上記錄的生長(zhǎng)響應(yīng)信息和生長(zhǎng)響應(yīng)指紋信息。這些信息以數(shù)字形式提供，能被電子傳輸和讀取，比如通過因特網(wǎng)、軟盤、通過USB(通用串行總線)或者通過任何其它合適的通信模式。

該存儲(chǔ)系統(tǒng)可以具有存儲(chǔ)在其中的參考環(huán)境(即生長(zhǎng))響應(yīng)指紋信息。正如這里使用的，“存儲(chǔ)”是指在存儲(chǔ)裝置上編碼信息的過程。在一個(gè)實(shí)施例中，比較模塊通過讀取存儲(chǔ)在存儲(chǔ)裝置中的該參考數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，比如將查詢的細(xì)胞特異性生長(zhǎng)響應(yīng)指紋和一套或一組參考生長(zhǎng)響應(yīng)指紋進(jìn)行比較。

所述“比較系統(tǒng)”能使用各種各樣可用的軟件程序和格式作為比較手段去比較細(xì)胞在測(cè)定期不同時(shí)間點(diǎn)的環(huán)境響應(yīng)指紋，以檢測(cè)環(huán)境(即生長(zhǎng))響應(yīng)指紋的改變。在一個(gè)實(shí)施例中，該比較模塊配置用于利用圖案識(shí)別技術(shù)將一個(gè)或多個(gè)輸入信息和一個(gè)或多個(gè)參考數(shù)據(jù)圖案進(jìn)行比較。該比較模塊配置用于使用現(xiàn)有的商業(yè)可得的或免費(fèi)可得的軟件用于比較圖案，以及可以對(duì)特殊數(shù)據(jù)比較進(jìn)行優(yōu)化。該比較模塊提供關(guān)于樣品基因型的計(jì)算機(jī)可讀信息。優(yōu)選地，該比較系統(tǒng)使用計(jì)算機(jī)模型用于比較目的。

該比較模塊，或任何其它本發(fā)明的模塊，可以包括在其上運(yùn)行相關(guān)的數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)的操作系統(tǒng)(如UNIX)、萬維網(wǎng)應(yīng)用程序和萬維網(wǎng)服務(wù)器。萬維網(wǎng)應(yīng)用程序包括產(chǎn)生數(shù)據(jù)庫(kù)語(yǔ)言語(yǔ)句(比如結(jié)構(gòu)化查詢語(yǔ)言(SQL)語(yǔ)句)所必需的可執(zhí)行代碼。通常可執(zhí)行文件包括嵌入式SQL語(yǔ)句。另外，所述萬維網(wǎng)應(yīng)用程序包括配置文件，該配置文件包括各種軟件實(shí)體的指示器和地址，該軟件實(shí)體包括服務(wù)器以及各種外部和內(nèi)部的能讀取服務(wù)器用戶請(qǐng)求的數(shù)據(jù)庫(kù)。該配置文件還能使服務(wù)器資源請(qǐng)求定向到合適的硬件—若服務(wù)器分布到超過兩個(gè)或更多的獨(dú)立式計(jì)算機(jī)上是必需的。在一個(gè)實(shí)施例中，所述萬維網(wǎng)服務(wù)器支持TCP/IP協(xié)議。類似這樣的本地網(wǎng)絡(luò)有時(shí)稱為“內(nèi)聯(lián)網(wǎng)”。這種內(nèi)聯(lián)網(wǎng)的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是它們能容易地與駐留在萬維網(wǎng)(比如GenBank或Swiss Pro萬維網(wǎng)址)中的公共領(lǐng)域數(shù)據(jù)庫(kù)通信。因此，在本發(fā)明的特別優(yōu)選實(shí)施例中，用戶可以使用網(wǎng)絡(luò)瀏覽器和網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器提供的HTML接口直接訪問駐留在因特網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)上的數(shù)據(jù)(比如通過超鏈接)。

所述比較模塊通常提供計(jì)算機(jī)可讀的比較結(jié)果，該比較結(jié)果能夠利用預(yù)定義標(biāo)準(zhǔn)或者用戶定義的標(biāo)準(zhǔn)被處理成計(jì)算機(jī)可讀形式，以提供部分基于比較結(jié)果的內(nèi)容，該內(nèi)容可以存儲(chǔ)并在使用顯示系統(tǒng)的用戶要求時(shí)輸出。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，基于比較結(jié)果的內(nèi)容顯示在計(jì)算機(jī)的顯示器上。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，基于比較結(jié)果的內(nèi)容通過可印刷介質(zhì)顯示。所述顯示模塊可以是任何合適的配置于從計(jì)算機(jī)接收并將計(jì)算機(jī)可讀信息顯示給用戶的裝置。例如，不受限制的例子包括：通用型計(jì)算機(jī)，比如基于Intel PENTIUM型處理器、Motorola PowerPC、Sun UltraSPARC、Hewlett-Packard PA-RISC處理器、可從Sunnyvale(加利福尼亞)的Advanced Micro Devices(AMD)公司獲得的各種處理器中的任意種或任何其它類型的處理器的那些計(jì)算機(jī)；視覺顯示裝置，比如平板顯示器、陰極射線管等，以及各種類型的計(jì)算機(jī)打印機(jī)。

在一個(gè)實(shí)施例中，萬維網(wǎng)瀏覽器用于提供用戶界面，用來顯示基于比較結(jié)果的內(nèi)容。應(yīng)該理解本發(fā)明的其它模塊能適于具有網(wǎng)絡(luò)瀏覽器界面。用戶可以通過所述網(wǎng)絡(luò)瀏覽器構(gòu)建從比較模塊中檢索數(shù)據(jù)的請(qǐng)求。因此，用戶通常指向并點(diǎn)擊用戶界面元素，比如在圖形的用戶界面常規(guī)使用的按鈕、下拉式菜單、滾動(dòng)條等。

附圖說明

圖1：來自一克隆的化學(xué)生長(zhǎng)指紋的實(shí)例。細(xì)胞在96孔板中在目標(biāo)化學(xué)物存在或者不存時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)72小時(shí)。細(xì)胞生長(zhǎng)的相對(duì)水平使用上文描述的“Presto-Blue”法檢測(cè)。

圖2：早期世代和后期世代培養(yǎng)物之間生長(zhǎng)響應(yīng)顯著改變的比例。誤差條形圖表示比例的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖3：早期世代和中期世代培養(yǎng)物之間生長(zhǎng)響應(yīng)顯著改變的比例。誤差條形圖表示比例的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

具體實(shí)施例

實(shí)驗(yàn)

小規(guī)模測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)：

在96孔板中檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)：“Presto Blue”(Invitrogen,Paisley,UK)和CD-CHO培養(yǎng)基以1:1混合，將20ul該混合物加入到每個(gè)孔中。該板機(jī)械搖動(dòng)后接著在靜態(tài)加濕孵育箱中在37℃孵育30分鐘。孵育之后，使用fluoroskan ascent(Thermo-Fisher，Loughborough，UK)的孔板讀取器測(cè)定(激發(fā)535nm，發(fā)射620nm)各孔的熒光。先前已經(jīng)證實(shí)熒光和孔中的活細(xì)胞的密度是線性相關(guān)的。

化學(xué)測(cè)試板的制備：

方法：使用的多種細(xì)胞應(yīng)激分子是：

2-氨基雙環(huán)-(2,2,1)庚烷-羧酸(BCH)

D-苯丙氨酸(D-Phe)

α-(甲氨基)異丁酸(MeAIB)

正丁酸鈉(NaBu)

環(huán)己酰亞胺

氯化銨

醋酸鎘六水合物

氯化鈷(CoCl₂)

氯化鈉(NaCl)

乳酸鈉(Na Lac)

氨基三唑(AMT)

甲萘醌亞硫酸氫鈉(MSB)

丁硫氨酸亞砜胺(BSO)

巰基丁二酸(MS)

2,4-二硝基苯酚(24DNP)

草氨酸鈉

2-脫氧葡萄糖(2dg)

3-溴丙酮酸(3-BrPA)

二氯乙酸鹽(DCA)

6-重氮-5-氧-l-正亮氨酸(l-don)

丙戊酸(Val)

原釩酸鈉Sodium Orthovandate(NaV)

檸檬酸

FK866

乳酸

使用“自身”親本細(xì)胞系，上述化學(xué)物質(zhì)的抑制劑量50(IC50)濃度經(jīng)過生長(zhǎng)研究進(jìn)行鑒定。這里討論到的IC50值定義為該化學(xué)物質(zhì)在3天期間內(nèi)抑制正常細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到50％的濃度。一旦IC50值被確定，96孔板設(shè)置為包含在IC50濃度的以上選擇的化學(xué)物質(zhì)以及包含只含有細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基的對(duì)照孔。

一種預(yù)測(cè)穩(wěn)定性的方法：

從早期傳代開始，在任何不穩(wěn)定變得明顯之前，采集若干代的指紋。采集的第一個(gè)指紋以下稱為“參考指紋”。這里目標(biāo)度量指標(biāo)不是在微環(huán)境中的生長(zhǎng)響應(yīng)而是相對(duì)于參考指紋在生長(zhǎng)響應(yīng)上的改變。

因此，對(duì)于在參考指紋之后采集的每個(gè)指紋，計(jì)算每個(gè)微環(huán)境的“化學(xué)特異性生長(zhǎng)響應(yīng)改變”(ΔCE)。這很有可能是關(guān)于穩(wěn)定性最詳實(shí)的指標(biāo)。每個(gè)微環(huán)境的ΔCE被用作預(yù)測(cè)模型的參數(shù)來得出穩(wěn)定或不穩(wěn)定的二次輸出。

用來預(yù)測(cè)穩(wěn)定性的這種模型選自各種模型。一個(gè)合適的例子是“線性判別模型”(LDA)，ΔCE的線性組合被用來從不穩(wěn)定細(xì)胞系中最大程度地分離穩(wěn)定細(xì)胞系?；蛘?，該模型是邏輯回歸模型或者是基于簡(jiǎn)單的歐幾里得距離或另一種“空間”(比如PCA或者LDA空間)距離。能夠使用另外的技術(shù)，比如“支持向量機(jī)”。

為了評(píng)估感興趣的新細(xì)胞系，參考指紋和若干后續(xù)指紋被用來產(chǎn)生ΔCE指紋。這些ΔCE后續(xù)指紋被用在建模方法中預(yù)測(cè)“穩(wěn)定或不穩(wěn)定”或可以一些其它穩(wěn)定性的連續(xù)指標(biāo)，比如“不穩(wěn)定度”。在一個(gè)實(shí)施例中，在“參考指紋”之后的第一代立即預(yù)測(cè)了穩(wěn)定性。

在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞系“校準(zhǔn)組”不是必需的并且穩(wěn)定性是通過觀察參考指紋隨著時(shí)間的改變(例如通過與參考指紋的簡(jiǎn)單距離或任何建模、圖案識(shí)別或者“用肉眼”的方法)的一致性預(yù)測(cè)。

實(shí)施例

獲取五種穩(wěn)定的和四種不穩(wěn)定的產(chǎn)品中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系。這些獲得的細(xì)胞冷凍在早期、中期和后期培養(yǎng)階段。這里不穩(wěn)定定義為到后期世代期下降大于30％最大產(chǎn)品滴定度。

在上文提及的多種化學(xué)物質(zhì)存在時(shí)測(cè)量生長(zhǎng)和滴定度前，通過在化學(xué)篩選板生長(zhǎng)3天獲得在每個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的每種細(xì)胞系的化學(xué)指紋。這里測(cè)試的目標(biāo)參數(shù)是化學(xué)響應(yīng)隨著時(shí)間(即早期、中期和后期)的改變。

觀察到化學(xué)生長(zhǎng)響應(yīng)“顯著”改變的頻次在早期和后期階段培養(yǎng)中的不穩(wěn)定克隆明顯高于穩(wěn)定克隆(圖2)。因此穩(wěn)定的可能性可以通過測(cè)試化學(xué)響應(yīng)隨著合適的時(shí)間進(jìn)程顯著改變的頻次獲得。這里生長(zhǎng)響應(yīng)的顯著改變定義為對(duì)于特異性化學(xué)生長(zhǎng)響應(yīng)改變超過兩倍估算板對(duì)板標(biāo)準(zhǔn)偏差的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖2示出了不穩(wěn)定克隆的化學(xué)改變比例是0.41，然而穩(wěn)定克隆改變的比例是0.26。

盡管程度較輕，但這種影響在早期世代和中期世代培養(yǎng)物中也被觀察到(圖3)。再次，這證實(shí)了化學(xué)生長(zhǎng)響應(yīng)隨著時(shí)間如何改變可以用來作為不穩(wěn)定的標(biāo)志物以及幫助篩選克隆用于長(zhǎng)期生長(zhǎng)研究，即從該研究克隆可能認(rèn)為具有不穩(wěn)定的可能性。比如，給定許多具有等同屬性的克隆，本發(fā)明能夠篩選這些克隆以確定采用哪些進(jìn)行下一階段穩(wěn)定性的研究，節(jié)省時(shí)間和資源。

相反地，本發(fā)明也能在早期階段鑒定克隆，早期階段的標(biāo)準(zhǔn)屬性很少讓人滿意，比如滴定度，但是從觀察到的化學(xué)指紋較低的改變可以被鑒定為很有可能是穩(wěn)定的。這些能被選用并可能用于克隆，其在早期階段表現(xiàn)良好但是在長(zhǎng)期研究中滴定度出現(xiàn)下降。

本發(fā)明并不限于以上描述的實(shí)施例，在結(jié)構(gòu)和細(xì)節(jié)上可以進(jìn)行變化而并不偏離本發(fā)明的精神。