本發(fā)明涉及檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地，本發(fā)明涉及測定蛋白質(zhì)的唾液酸含量的方法。
背景技術(shù)：
：唾液酸是一類骨架為9個碳原子的，神經(jīng)氨酸的單糖衍生物。最為常見的唾液酸為n-乙酰神經(jīng)氨酸(neu5ac)，廣泛分布于動物組織中，主要以糖蛋白和神經(jīng)節(jié)苷脂的形式存在。唾液酸在生物體內(nèi)發(fā)揮多種功能，包括促進大腦發(fā)育，增強記憶力，促進腸道對維生素和礦物質(zhì)的吸收等。同時，由于唾液酸帶負電，在細胞上形成相對集中的負電區(qū)域，也是流感等病毒的結(jié)合受體。近年來，以單克隆抗體和重組蛋白為代表的生物大分子在醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)展迅速，多種大分子藥物成為重磅炸彈，全球年銷售額超過數(shù)十億美元的規(guī)模。此類生物大分子藥物多由哺乳動物細胞系表達，具有豐富的糖基化修飾，包括唾液酸修飾。由于唾液酸帶有較強的負電，會影響蛋白大分子在體內(nèi)的半衰期，影響大分子藥物在體內(nèi)的藥代動力學。因此，唾液酸程度往往是生物大分子藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一，在生物大分子藥物的開發(fā)和生產(chǎn)過程中占據(jù)非常重要的地位。然而，測定單克隆抗體和重組蛋白類生物大分子藥物中唾液酸含量的方法仍有待進一步開發(fā)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明提出了一種操作簡單，靈敏度高，耗時短，可以用于生物大分子生產(chǎn)的中間質(zhì)量控制或者最終產(chǎn)品的質(zhì)量檢驗的測定唾液酸含量的方法。在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種測定蛋白質(zhì)的唾液酸含量的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：(1)利用唾液酸酶對蛋白質(zhì)樣品進行消化處理，以便獲得含有唾液酸的消化液；(2)對所述消化液進行沉淀處理，并分離含有所述唾液酸的上清液；(3)通過超高效液相色譜-質(zhì)譜法對所述上清進行分析，以便獲得質(zhì)譜圖；以及(4)基于所述質(zhì)譜圖，確定所述蛋白質(zhì)的唾液酸含量?，F(xiàn)有的利用高效液相色譜或氣相色譜法測定蛋白樣品中的唾液酸含量的方法，由于唾液酸本身沒有紫外吸收，故高效液相色譜或氣相色譜法均需要對蛋白樣品進行前處理，只有衍生化后的唾液酸才能被檢測到，所以整個過 程操作復雜，耗時較長；而現(xiàn)有的利用分光光度法測定蛋白樣品中的唾液酸含量的方法，檢測限和定量限較高。本發(fā)明實施例所提出的方法，相比于現(xiàn)有技術(shù)，在無需對唾液酸進行衍生化的條件下，對蛋白樣品中的總唾液酸含量進行快速定量檢測，方法操作簡單，靈敏度高，準確度高，耗時短，可以用于生物大分子生產(chǎn)的中間質(zhì)量控制或者最終產(chǎn)品的質(zhì)量檢驗。根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述測定蛋白質(zhì)的唾液酸含量的方法還可以進一步包括如下附加技術(shù)特征至少之一：根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述質(zhì)譜采用下列條件：負離子掃描模式，離子源溫度為150℃，毛細管電壓為2.5kv，錐孔電壓為12v，脫溶劑溫度為450℃，碰撞能量為18ev，離子采集方式為多反應檢測模式，采集離子為母離子308.7，子離子87.02。根據(jù)本發(fā)明的實施例，在上述質(zhì)譜條件下，所得唾液酸的質(zhì)譜圖峰形好、峰分離度好，檢測靈敏度高、準確度高。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述超高效液相色譜采用下列條件：色譜柱為acquityuplcbehc18，所述色譜柱的粒徑是1.7微米，大小是2.1*50mm，柱溫為30℃，樣品室溫度為10℃，進樣量1微升，流動相的a相為0.1％氨水/水溶液，流動相的b相為乙腈，洗脫程序是0～2min，90％a；2～4min，20％a；4～6min,90％a。根據(jù)本發(fā)明的實施例，在上述液相色譜條件下，上清液中的唾液酸和其它雜質(zhì)高效分離，離子化程度好，進而進一步提高了下一步對唾液酸進行質(zhì)譜分析的準確性和靈敏性。根據(jù)本發(fā)明的實施例，基于4微克的所述蛋白質(zhì)樣品，所述唾液酸酶的用量是50u。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，上述唾液酸酶的用量是過量的，從而可以在酶的用量方面保證對蛋白質(zhì)樣品的充分消化。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述消化處理是在37℃下進行1～12h,優(yōu)選4h。發(fā)明人經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，在唾液酸酶的用量過量時，消化時間長于12h，會造成部分唾液酸降解，消化時間短于1h，又會造成水解消化不充分，優(yōu)選消化時間是4h，蛋白質(zhì)樣品結(jié)合的唾液酸釋放最為完全。根據(jù)本發(fā)明的實施例，步驟(2)包括：所述消化液與乙腈接觸并對所述消化液進行沉淀處理，并通過離心分離含有所述唾液酸的上清液。乙腈可使蛋白質(zhì)的分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生變化而使蛋白(包括蛋白樣品中的蛋白質(zhì)成分和唾液酸酶)凝聚析出，進而通過離心去除蛋白沉淀，收集含有唾液酸的上清液。所得上清液中的蛋白雜質(zhì)去除干凈，排除對質(zhì)譜檢測的干擾，進一步提高了質(zhì)譜檢測結(jié)果的準確度和質(zhì)譜檢測的靈敏度。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述乙腈預先在-20℃的條件下預冷1h。預冷的乙腈可顯著提高乙腈對蛋白的變性和沉淀效率，進而所得上清液中的蛋白雜質(zhì)去除更加徹底，進一步有效提高了質(zhì)譜檢測結(jié)果的準確度和質(zhì)譜檢測的靈敏度。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述接觸是在-20℃的條件下進行的。在-20℃的條件下進行接觸可顯著提高乙腈對蛋白的變性和沉淀效率，進而所得上清液中的蛋白雜質(zhì)去除更加徹底，進一步有效提高質(zhì)譜檢測結(jié)果的準確度和質(zhì)譜檢測的靈敏度。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述沉淀處理在-20℃的條件下進行1h。在本發(fā)明的實施例中，消化液和乙腈接觸后，在-20℃的條件下靜置沉淀1h，經(jīng)檢測，上清液中的蛋白雜質(zhì)沉淀完全，有效排除了蛋白雜質(zhì)對后續(xù)質(zhì)譜檢測的干擾，可進一步有效提高質(zhì)譜檢測結(jié)果的準確度和質(zhì)譜檢測的靈敏度。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述離心是在10000×g,4℃的條件下進行10min。在上述離心條件下，沉淀的蛋白雜質(zhì)被有效去除，進而有效排除了蛋白雜質(zhì)對后續(xù)質(zhì)譜檢測的干擾，可進一步有效提高質(zhì)譜檢測結(jié)果的準確度和質(zhì)譜檢測的靈敏度。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述消化液與所述乙腈的體積比是1:3。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當消化液與乙腈的體積比為1:3時，可進一步提高乙腈沉淀蛋白的效率，進而進一步有效排除蛋白雜質(zhì)對后續(xù)質(zhì)譜檢測的干擾，可進一步有效提高質(zhì)譜檢測結(jié)果的準確度和質(zhì)譜檢測的靈敏度。根據(jù)本發(fā)明的實施例，在步驟(3)之前，預先利用超純水對所述上清液進行稀釋處理。根據(jù)本發(fā)明的實施例，由于在唾液酸消化蛋白質(zhì)樣品階段，所用酶解緩沖液含有不揮發(fā)性鹽(包括氯化鈣和醋酸鈉)，在步驟(3)之前，預先利用超純水對上清液進行稀釋處理，可有效減少進入質(zhì)譜檢測儀的不揮發(fā)性鹽，避免直接進樣對質(zhì)譜儀造成損害，進而進一步有效提高質(zhì)譜檢測儀的靈敏度和質(zhì)譜檢測結(jié)果的準確度。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述稀釋處理是將所述上清液稀釋至所述唾液酸的含量在0.004935～0.0987微克/毫升范圍內(nèi)。發(fā)明經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，稀釋后的上清液中唾液酸的含量在0.004935～0.0987微克/毫升范圍內(nèi)，所得唾液酸的峰面積與唾液酸的濃度具有線性依賴關(guān)系，其峰面積y和唾液酸的濃度x的線性關(guān)系是y＝40002.4613x-24.5366，r2＝0.9991，即稀釋后的上清液中唾液酸的含量在0.004935～0.0987微克/毫升，可通過峰面積與濃度的依賴關(guān)系，計算得出稀釋后上清中的唾液酸含量，得出的唾液酸的含量值可信度和準確度高。根據(jù)本發(fā)明的實施例，在步驟(4)中，基于下列公式確定所述蛋白質(zhì)的唾液酸含量：其中，y表示所述蛋白質(zhì)的唾液酸含量,x表示與唾液酸對應的峰面積，n表示上清液的稀釋倍數(shù)，m表示上清液的體積，a表示蛋白質(zhì)樣品的總重量。根據(jù)本發(fā)明的實施例，當稀釋處理后上清液中唾液酸的濃度在0.004935～0.0987微克/毫升范圍內(nèi)時，待測蛋白質(zhì)樣品中的唾液酸占待測蛋白質(zhì)樣品的百分含量可通過上述公式計算得出，得出的唾液酸占 待測蛋白質(zhì)樣品的百分含量值可信度和準確度高。在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種測定蛋白質(zhì)的唾液酸含量的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：1)準備樣品a)取4微克待測蛋白質(zhì)樣品，加入50u的唾液酸酶，加入酶切緩沖液和超純水，配成25微升的反應體系，在37℃孵育4h，將結(jié)合在待測蛋白質(zhì)樣品上的唾液酸水解下來，形成的游離總唾液酸存在于溶液中；b)向唾液酸酶水解后反應體系中加入75微升的預冷乙腈，所述乙腈在-20℃預冷1h，渦旋振蕩1min后，靜置于-20℃下1h，隨后在10000×g，4℃的條件下離心10min，棄沉淀，游離總唾液酸存在于上清中，并放置于-20℃供隨后的檢測。2)通過超高效液相色譜-質(zhì)譜法對上清進行分析，確定所述上清中唾液酸的含量a)含有游離總唾液酸的上清用超純水經(jīng)倍比稀釋后，置于1.5ml的超高效液相色譜的上樣瓶中，經(jīng)watersuplc-msxevotq-s系統(tǒng)中acquityuplcbehc181.7微米，2.1*50mm分離，柱溫控制在30℃，樣品室溫度控制為10℃，進樣量1微升，流動相的a相為0.1％氨水/水溶液，流動相的b相為乙腈，洗脫程序：0～2min，90％a；2～4min，20％a；4～6min,90％a，1min后，流路切換到廢液。b)質(zhì)譜設置為負離子掃描模式，離子源溫度150℃，毛細管電壓2.5kv，錐孔電壓12v，脫溶劑溫度450℃，碰撞能量18ev，離子采集方式采用多反應檢測模式，采集離子是母離子308.7，子離子87.02，采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)由軟件masslynxv4.1分析。c)在稀釋后的上清中，唾液酸的濃度在0.004935～0.0987微克/毫升范圍內(nèi)，所述蛋白質(zhì)的唾液酸含量是基于下列方程確定的：其中，y表示所述蛋白質(zhì)的唾液酸含量,x表示與唾液酸對應的峰面積，n表示上清液的稀釋倍數(shù)，m表示上清液的體積，a表示蛋白質(zhì)樣品的總重量。本發(fā)明實施例所提出的方法，在無需對唾液酸進行衍生化的條件下，可對蛋白樣品中的總唾液酸含量進行快速定量檢測，方法操作簡單，靈敏度高，準確度高，耗時短，可以用于生物大分子生產(chǎn)的中間質(zhì)量控制或者最終產(chǎn)品的質(zhì)量檢驗。附圖說明圖1是根據(jù)本發(fā)明實施例的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)唾液酸酶水解后的蛋白沉淀的sds-page檢測圖；圖2是根據(jù)本發(fā)明實施例的超高效液相色譜-質(zhì)譜(uplc-ms)定量檢測所得典型唾液酸質(zhì)譜圖；圖3是根據(jù)本發(fā)明實施例的uplc-ms定量檢測唾液酸含量的定量曲線圖；圖4是根據(jù)本發(fā)明實施例的uplc-ms定量檢測唾液酸含量方法的檢出限和定量限考察圖；圖5是根據(jù)本發(fā)明實施例的測量樣品稀釋200倍后所測得的質(zhì)譜圖和定量結(jié)果；以及圖6是根據(jù)本發(fā)明實施例的測量樣品稀釋1000倍后所測得的質(zhì)譜圖和定量結(jié)果。具體實施方式下面詳細描述本發(fā)明的實施例，這些實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。需要說明的是，除非明確指出，在下面實施例中未詳細描述的材料和方法均為本領(lǐng)域中常規(guī)使用的。在以下實施例中所使用的唾液酸酶為newenglandbiolabinc公司的α2-3,6,8唾液酸酶(貨號為p0720s)；唾液酸標準品(a187000，批號：4-scc-101-1)購自trc(加拿大)；待測蛋白質(zhì)為申請人自制的重組融合蛋白；所使用的超高效液相色譜-質(zhì)譜(uplc-ms)系統(tǒng)為waters公司的uplc-msxevotq-s系統(tǒng)；分離所用分析柱為waters公司的acquityuplcbehc181.7微米，2.1*50mm分離柱；數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為masslynxv4.1。實施例1測定蛋白質(zhì)的唾液酸含量的方法及相應條件篩選1)準備樣品唾液酸酶消化水解過程中，水解時間對水解效率起決定性因素(唾液酸酶過量時)。發(fā)明人共比較了3種不同的水解時間，分別是37℃1h(01號樣品)，37℃4h(02號樣品)和37℃過夜水解(12h)(03號樣品)。為了便于進行后續(xù)蛋白質(zhì)的沉淀過程，水解體積調(diào)整到25微升。同時，發(fā)明人平行進行了僅含蛋白質(zhì)樣品，不添加唾液酸酶的對照(04號樣品)和不含蛋白質(zhì)樣品的唾液酸酶對照(05號樣品)。具體樣品處理方案如表1所示。表1樣品01020304050.25毫克/毫升vegf-trap(微升)161616160唾液酸酶(微升)1(50u)1(50u)1(50u)01(50u)10*反應緩沖液(微升)2.52.52.52.52.5去離子水(微升)5.55.55.56.521.5孵育時間(小時)14過夜過夜過夜唾液酸酶水解后，待測蛋白質(zhì)上結(jié)合的唾液酸以游離的形式存在于溶液之中。為避免 對后續(xù)質(zhì)譜分析的干擾，發(fā)明人將蛋白質(zhì)和不揮發(fā)性鹽通過有機試劑沉淀去除。具體操作如下所述：向水解體系中加入3倍體積的冰預冷乙腈，渦旋振蕩1min混勻，并放置在-20℃1h，提高蛋白質(zhì)沉淀效率和除鹽效率。沉淀1h后，樣品放入冷凍離心機，在4℃的條件下，以10000×g的速度離心10min。離心結(jié)束后，小心吸取上清，放置在4℃作為后續(xù)uplc-ms定量檢測的樣品。收集蛋白質(zhì)沉淀后，將其重溶于sds-page上樣緩沖液，進行sds-page檢測，進而初步判定唾液酸酶水解是否完全，具體sds-page檢測結(jié)果如圖1所示，圖1結(jié)果顯示，所有加入唾液酸酶水解的蛋白質(zhì)樣品的分子量，相對于未添加唾液酸酶的蛋白質(zhì)樣品，均有明顯的分子量變小的現(xiàn)象，表明在上述水解條件下，待測蛋白質(zhì)樣品均能被唾液酸酶高效地水解，進而初步判定上清可以用于下一步精確的對唾液酸的uplc-ms定量分析。更進一步地，唾液酸水解步驟中，由于酶解緩沖液中含有不揮發(fā)性鹽(氯化鈣和醋酸鈉)，為避免直接進樣上清會給儀器造成危害，發(fā)明人在水解階段使用了較多的蛋白樣品，從而提供足夠多的游離總唾液酸；在蛋白質(zhì)沉淀之后，進一步進行倍比稀釋，進而減少進入質(zhì)譜檢測儀的不揮發(fā)性鹽。在本實施例中，蛋白沉淀后的上清樣品(01、02、03、04、05號樣品)，經(jīng)milliq水(超純水)分別稀釋到10倍，100倍，200倍和1000倍。由于在蛋白質(zhì)沉淀過程中已經(jīng)除去大部分的不揮發(fā)性鹽，倍比稀釋后的樣品鹽濃度已經(jīng)能夠被質(zhì)譜耐受。2)通過超高效液相色譜-質(zhì)譜法對上清進行分析，確定上清中唾液酸的含量游離總唾液酸樣品用milliq水經(jīng)適當倍比稀釋后，置于1.5ml的uplc上樣瓶中，經(jīng)watersuplc-msxevotq-s系統(tǒng)中acquityuplcbehc181.7微米，2.1*50mm分離，柱溫控制在30℃，樣品室溫度控制為10℃，進樣量1微升。由于唾液酸并不和c18的分析柱相結(jié)合，唾液酸在該柱上保留時間極短(<1min)，基于此，發(fā)明人調(diào)整色譜條件如下：流動相：a相：0.1％氨水/水溶液，b相：乙腈，洗脫程序為：0～2min，90％a；2～4min，20％a；4～6min,90％a。1min后，流路切換到廢液，盡可能減少帶入質(zhì)譜的雜質(zhì)和不揮發(fā)性鹽成份。更進一步地，發(fā)明人采用milliq超純水溶解唾液酸標準品(a187000，批號：4-scc-101-1)，配成濃度為1mg/ml的儲備液，并經(jīng)稀釋得到濃度為0.1微克/ml的對照品溶液用以探索質(zhì)譜條件。在masslynxv4.1操作界面下，選擇masstune子菜單，設置電離模式為esi(-)。首先在msmode模式下進行母離子掃描，通過調(diào)整毛細管電壓，錐孔電壓等參數(shù)的調(diào)整掃描得到強度值為106-7的母離子m/z＝308.07。然后在msmode下進行子離子掃描，通過設置碰撞能量，掃描得到強度值為106-7的子離子m/z＝87.02。進而保存上述參數(shù)文件，在子菜 單massconsole中進行自動調(diào)諧，進一步確認以此優(yōu)化上述質(zhì)譜條件。最終得到的質(zhì)譜條件如下所示：母離子308.07，子離子87.02，錐孔電壓12v，碰撞能量18ev，毛細管電壓2.5kv，脫溶劑溫度450℃，離子源溫度150℃，所得典型唾液酸質(zhì)譜圖如圖2所示。實施例2建立定量曲線對待測蛋白質(zhì)樣品進行質(zhì)譜定量分析前，用唾液酸國際標準品建立定量曲線。唾液酸標準品：貨號a187000，批號：4-scc-101-1，分子量309.27，購自trc(加拿大)。唾液酸標準品用milliq超純水溶解配成1mg/ml的儲備液之后，凍存于-80℃。將1毫克/毫升唾液酸標準品溶液用超純水系列稀釋至0.1毫克/毫升，0.01毫克/毫升，1微克/毫升，0.1微克/毫升，0.08微克/毫升，0.04微克/毫升，0.02微克/毫升，0.01微克/毫升，0.005微克/毫升，空白零點為超純水。建立的定量曲線如圖3所示，圖3結(jié)果表明：該方法專屬性好，空白無干擾(如用以檢測樣品04，05號)；唾液酸在濃度為0.004935-0.0987微克/毫升范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y＝40002.4613x-24.5366，r2＝0.9991(其中，x表示進樣樣品中唾液酸的濃度，y表示唾液酸對應的峰面積,r2表示擬合度)，滿足唾液酸準確定量分析的要求；采用該方法測定唾液酸，測定完濃度為0.0987微克/毫升的對照品溶液后，空白樣品中唾液酸未檢出，表明采用該方法檢測時，樣品無殘留。實施例3檢出限和定量限的測定由圖4結(jié)果可以看出，濃度為0.04微克/毫升的標準品溶液測得的信噪比(s/n)為104.6991(進樣量為1微升)，由此得出該方法的檢出限(lod＝s/n＝3)約為1.0pg；定量限(lqd＝s/n＝10)約為3.5pg。因而，該方法滿足蛋白質(zhì)生物大分子藥物總唾液酸的定量檢測要求。實施例4樣品檢測樣品(01，02，03，04，05號)經(jīng)milliq水分別稀釋到10倍，100倍，200倍和1000倍，其中200倍和1000倍稀釋樣品經(jīng)實施例1所述的方法進行定量檢測。稀釋200倍樣品的定量檢測譜圖和結(jié)果如圖5所示，稀釋1000倍樣品的定量檢測譜圖和結(jié)果如圖6所示。圖5和圖6結(jié)果顯示，樣品04、05無信號，方法的專屬性良好，01、02、03號樣品稀釋200倍的峰面積均在實施例2得出的線性范圍內(nèi)，可用于樣品唾液酸含量的測定，進而可根據(jù)公式(其中，y表示待測蛋白質(zhì)的唾液酸含量,x表示與唾液酸對應的峰面積，n表示上清液的稀釋倍數(shù)，m表示上清液的體積，a表示待測蛋白質(zhì)樣品的總重量)確定待測蛋白質(zhì)中唾 液酸的含量。稀釋1000倍的樣品中唾液酸的峰面積較小，濃度在0.0022～0.0087微克/毫升之間。因此本發(fā)明實施例樣品的最終稀釋倍數(shù)確定為200倍。另外，對不同唾液酸酶水解條件下所得樣品的定量檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水解4小時的樣品(02樣品)，蛋白質(zhì)樣品結(jié)合的唾液酸釋放最為完全，上清中唾液酸定量達7.2微克/毫升，相對應的水解1小時樣品(01樣品)和水解過夜樣品(03樣品)上清中定量測得的唾液酸含量分別為1.8微克/毫升和3.0微克/毫升，因此本發(fā)明實施例的待測蛋白質(zhì)樣品，應選取4小時水解作為唾液酸酶水解時間。在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結(jié)合和組合。盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。當前第1頁12