本發(fā)明屬于食品檢測技術領域，特別涉及一種用半粒測定水稻直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的方法。

背景技術：

食用稻米胚乳中的最主要成分是淀粉，約為80％。稻米淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，直鏈淀粉長1，030個葡萄殘基，為直鏈狀分子，很少分枝；支鏈淀粉則是高度分枝的葡萄糖苷鏈，支鏈平均長度約為20個葡萄糖殘基。20世紀60年代中期始，胚乳中的直鏈淀粉含量(AC)是評價稻米蒸煮食用品質(zhì)優(yōu)劣的最重要指標之一(Juliano等，1965)，直鏈淀粉含量高，米飯硬而蓬松；反之則軟而粘(Radhika等1993，Ong等，1995)。但隨育成品種遺傳組成的多樣化，直鏈淀粉含量相似(尤其是中高直鏈淀粉含量)而米飯質(zhì)地相去甚遠的現(xiàn)象日益普遍。80年代中期，Takeda等與Juham合作，對用比色法測定具相似AC品種的米飯質(zhì)地差異的原因進行了系列研究。他們首先發(fā)現(xiàn)，高AC和低AC二類品種，其支鏈淀粉對碘的親和性存在差異：低AC品種的支鏈淀粉與碘的親和性都很??；而高AC的品種之問，支鏈淀粉與碘的親和性存在較大差異。這一結果表明，用碘比色法測得的AC實際上是由二部分組成，即真正的AC以及總分支鏈淀粉的含量。為了與直鏈淀粉的真實含量相區(qū)別，Takeda等于1987年提出“表觀直鏈淀粉含量(Apparent anrylose content，AAC)”這一新概念，從而 將用碘比色法測得的AC與稻米淀粉中實際的AC區(qū)別開來。從化學組成看，AAC實際上由兩部分組成，即真正的直鏈淀粉和部分支鏈淀粉的長鏈B。已有研究表明，秈米中的直鏈、支鏈淀粉含量和比例對其出飯率、食用品質(zhì)及貯藏與加工的方式有著決定性的影響。因此，尋求一種能同時測定秈米中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的方法，來作為評定大米蒸煮品質(zhì)的檢測指標具有重要意義。

現(xiàn)我國推薦的測定稻米AC值的標準方法有3種，即國際標準ISO 6647-2007《稻米直鏈淀粉含量測定第2部分常規(guī)方法》、國家標準GB/T 15683-2008《大米直鏈淀粉含量的測定》及農(nóng)業(yè)部標準NY/T 2639-2014《稻米直鏈淀粉的測定-分光光度法》，這些標準其實測定的還是表觀直鏈淀粉含量。蔡一霞等2006年(中國農(nóng)業(yè)科學，2006，39(6)：1122-1129)用Sephadex G75層析柱分析了稻米中支鏈淀粉分支鏈的鏈長分配，此方法用堿無機試劑純化淀粉，且是手工過柱洗脫，易造成直支成分的損失以及各收集成分的不穩(wěn)定性和成分之間的完全分離清晰性。且通常的測定方法均要求樣品有一定的量，如，100g糙米經(jīng)碾精磨粉而成；而在實際田間中間試驗小樣往往只收了幾十粒，甚至幾粒，還要留種，且這么少量很難碾精，這很難對樣品理化性狀進行測試。且直鏈淀粉和支鏈淀粉含量之比的獲得，通常是用的如旋光法和水解總糖測定法來測定總淀粉含量，然后用總淀粉含量減去直鏈淀粉含量得到支鏈淀粉含量，后得到直/支鏈淀粉含量之比。這些方法不僅要求有一定量(僅總淀粉測定需要的量是2.0g-2.5g,重復兩次則需要4.0g-5.0g)，且步驟繁鎖，水解法還涉及加熱滴定，這些 因素易導致測定不易操作，數(shù)據(jù)重復性差等。蔣卉等2013(糧食與飼料工業(yè)，2013，2：22-25)報道采用雙波長測直鏈淀粉和支鏈淀粉，一則是沒有脫脂，而脂肪對淀粉碘藍比色有干擾；二是需要在四個波長對樣品進行比色，步驟法多，操作繁鎖，且也需要一定的樣品量?；谌绱耍虼吮景l(fā)明采用半粒法，即保留下來的具有胚芽部分的半?？梢岳^續(xù)發(fā)芽種植；且簡化淀粉提取過程，以防止無機(堿)或有機二甲基二砜對淀粉的破壞，用異淀粉酶分離直、支淀粉，用凝膠色譜分離。此凝膠色譜分離中采用了磷酸體系緩沖液和TSK Gel 3000PWxl和4000PWxl串聯(lián)柱子，而在多糖聚合物的測定中均采用單柱子，串聯(lián)柱子不僅擴大了多糖聚合物的分子量，從3000PWxl的范圍是6萬，擴到4000PWxl的70萬，且分離效果好。在cereal chemistry 2009((86(5):492-498))中報道用的單柱子Ultrahydrogel 250(waters)，其中直鏈淀粉和支鏈淀粉的出峰雖能分開，但直鏈淀粉出峰還沒有走平時出現(xiàn)支鏈峰，因此出峰面積的積分比較難積準，影響數(shù)據(jù)重復性。而我們此研究中采用TSK Gel 3000PWxl和4000PWxl串聯(lián)柱子，結果表明直、支分離和支鏈淀粉的長、中短鏈之間效果好，數(shù)據(jù)重復好，易操作；且測定的是真正的直鏈淀粉和支鏈淀粉含量，并非比色法中所測定的表觀直鏈淀粉。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種用半粒測定水稻直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的方法，該方法樣品用量少，簡化了淀粉純化步驟，且可以用有胚的半粒米留種，數(shù)據(jù)穩(wěn)定，重復性好。

本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種用半粒測定水稻直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的方法，該方法包括如下步驟：

步驟1：稻米粉制備：取單粒稻谷手工脫殼后用刀片刮去種皮和糊粉層，得到精米，然后將其橫切成兩個半粒，取沒有胚芽部分的半粒用碾磨棒碾磨成精米粉；

步驟2：精米粉脫除脂肪和可溶性糖

稱取步驟1得到精米粉與100％色譜純甲醇混勻并于100℃加熱10分鐘后于10,000g離心5分鐘后收集沉淀物，此步驟重復2-3次，并合并沉淀物；精米粉與甲醇的用量比為0.6mg/1.0ml；

步驟3:糊化淀粉和直、支鏈分離

步驟4:凝膠滲透色譜儀器參數(shù)

采用TSK gel pwxl 3000和pwxl 4000串聯(lián)雙柱，采用0.1mol/L磷酸氫二鈉和0.05mol/L磷酸二氫鈉為緩沖液，流速為1.0ml/min,柱溫箱為40℃和采用示差檢測器；

步驟5：根據(jù)直鏈淀粉和支鏈淀粉的兩成分出峰面積之比而直接得到直鏈淀粉/支鏈淀粉含量之比。

上述方法包括樣品制備，淀粉純化，淀粉糊化和直、支鏈酶解分離，凝膠滲透儀分離柱子、流動相和流速、溫度的建立及含量的定量積計算。本發(fā)明所提出的方法具有樣品量少，簡便，快速，準確和高效，且能用保留胚芽的半粒留種發(fā)芽，能對水稻中間試驗小材料的篩選或是遺傳研究等 應用均有很好的應用價值。

現(xiàn)有的檢測方法中，精米粉脫除脂肪和可溶性糖時采用的試劑是乙醇或水飽和正丁醇溶液，而本發(fā)明采用100％色譜純甲醇，目的是減低損傷淀粉比率，提高脫脂效果；對于樣品的前處理，發(fā)明人并沒有像常規(guī)方法那樣對樣品用NaOH或二甲基亞砜脫蛋白，這樣可以避免對淀粉的預糊化或損傷，盡量保持原淀粉特性，從而提高數(shù)據(jù)重復性。本發(fā)明步驟4中選用的色譜柱是TSK gel G3000pwxl和pwxl 4000串聯(lián)雙柱，和磷酸緩沖液為流動相，與其報道的Ultrahydrogel單柱子相比，具有柱效高，直鏈淀粉和支鏈淀粉的分離度好，出峰穩(wěn)定和數(shù)據(jù)重復性好。

作為優(yōu)選，糊化的方法是沸水浴5-10分鐘或50℃烘箱2-3小時或室溫過夜至溶液清澈。

作為優(yōu)選，醋酸鈉溶液的加入量為糊化后得到產(chǎn)物重量的120-130倍。

作為優(yōu)選，步驟3的具體過程為：取沉淀物加入0.25mol/L NaOH溶液中，沉淀物與NaOH溶液的比例為50mg：1.0ml，糊化完全，混勻后加入適量pH＝4.0的0.5mol/L醋酸鈉溶液，再入適量異淀粉酶(酶活大于250U)于40℃反應2hr以上，直至反應完全；然后，沸水加熱5分鐘，10,000g離心5-10分鐘，取上清液；加入適量離子交換樹脂AG501-X8，于50℃水浴搖床30min,后16000g離心10分鐘，過0.45μm PVDF小柱，保持40℃后進行凝膠滲透色譜進樣測定。

本發(fā)明采用半粒法，即保留下來的具有胚芽部分的半?？梢岳^續(xù)發(fā)芽種植；簡化淀粉提取過程，以防止無機(堿)或有機二甲基二砜對淀粉的 破壞，用異淀粉酶分離直支淀粉，結果表明直、支分離效果好，數(shù)據(jù)重復好。

本發(fā)明利用凝膠滲透色譜儀，快速微量簡化法測定水稻米粉直鏈淀粉/支鏈淀粉含量的比率,克服以往需要的較大量的樣品量和手工過分析柱收集或淀粉與非淀粉成分分離純化過程中預糊化對淀粉的損失，或雙波長法測定的非真正的直鏈淀粉含量，或單柱無法完全分離直鏈淀粉和支鏈淀粉。本發(fā)明提供了半粒法，且簡化淀粉純化步驟，用異淀粉酶分離直、支淀粉，采用了磷酸緩沖液和TSK Gel PWxl串聯(lián)雙柱。該方法快速高效，數(shù)據(jù)重復性好,且可以用保留的帶有胚芽的半粒發(fā)芽種植，對水稻的試驗小材料的篩選選育或是水稻品質(zhì)改良或是水稻品質(zhì)遺傳研究均有很好的應用前景。

附圖說明

圖1是水稻樣本9311的直鏈和支鏈淀粉圖；

圖2是水稻品種泰國香米的直鏈和支鏈淀粉圖。

具體實施方式

下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術方案作進一步的具體說明。應當理解，本發(fā)明的實施并不局限于下面的實施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護范圍。

在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所采用的設備和原料等均可從市場購得或是本領域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規(guī)方法。

實施例1

一種用半粒測定水稻直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的方法，具體步驟為：

步驟1:稻米粉的前處理：取單粒稻谷(水稻樣本9311)用手工脫殼，糙米用刀片刮去種皮、糊粉層，然后精米橫切成兩個半粒；取沒有胚芽部分的半粒用碾磨棒碾磨成精米粉。

步驟2：精米粉脫除脂肪和可溶性糖

精米粉稱樣量為100mg入10ml離心管，加入60ml 100％色譜純甲醇，于沸水浴10分鐘，12,000g離心5分鐘，倒去懸浮液。沉淀物重復此步驟3次。

步驟3：糊化淀粉和直、支鏈分離

稱20mg沉淀物于2ml離心管后加入0.4ml 0.25mol/L NaOH溶液,50℃烘箱2小時?；靹蚝蠹尤?0μl 1.0mol/L醋酸鈉溶液(pH＝4.0)，再加入20μl異淀粉酶(酶活大于250U)于40℃恒溫水浴搖床反應2hr。然后，沸水加熱5分鐘，去異淀粉酶活，10,000g離心5分鐘，取上清液；加入0.3g左右離子交換樹脂AG501-X8，于50℃水浴搖床30min,后16000g離心10分鐘，過0.45μm PVDF小柱，保持40℃后進行步驟4的凝膠滲透色譜進樣測定。

步驟4:凝膠滲透色譜儀器參數(shù)

采用TSK gel3000PWxl和4000PWxl柱子，采用0.1mol/L磷酸氫二鈉和0.05mol/L磷酸二氫鈉為緩沖液和0.02％疊氮化鈉，流速為1.0ml/min,柱溫箱為40℃和示差檢測器。

步驟5：根據(jù)直鏈淀粉(第一出峰)面積與支鏈淀粉的長鏈(第二出峰) 和支鏈淀粉的中短鏈(第三峰)總出峰面積之比，即為直鏈淀粉含量/支鏈淀粉含量之比。

圖1是水稻樣本9311的直鏈和支鏈淀粉圖，其中第一峰，保留時間在14.65min為直鏈淀粉；第二和第三峰均為支鏈淀粉部分，保留時間分別為18.20min和19.8min,分別為支鏈淀粉的長鏈和中短鏈部分。其中重復1的直鏈淀粉面積為8350，支鏈淀粉長鏈峰面積為9600，支鏈淀粉中短鏈峰面積為44031，8350/(9600+44031)＝15.6％。重復二中的直鏈淀粉峰面積為8758，支鏈淀粉長鏈和中短鏈的峰面積分別為9561和42316，8758/(9561+42316)＝16.8％，直/支比率絕對差為1.2％，重復性好。具體見表1。

表1樣品9311的直鏈淀粉及支鏈淀粉的比例

實施例2：

一種用半粒測定水稻直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的方法，包括如下步驟：

步驟1:稻米粉的前處理：取單粒稻谷用手工脫殼，糙米用刀片刮去種皮、糊粉層，然后精米橫切成兩個半粒；取沒有胚芽部分的半粒用碾磨棒碾磨成精米粉。

步驟2：精米粉脫除脂肪和可溶性糖

精米粉稱樣量為50mg入10ml離心管，加入30ml 100％色譜純甲醇，于沸水浴10分鐘，12,000g離心5分鐘，倒去懸浮液。沉淀物重復此步驟3次。

步驟3：稱10mg沉淀物于2ml離心管后加入0.2ml 0.25mol/L NaOH,50℃烘箱2小時?；靹蚝蠹尤?0μl 0.5mol/L醋酸鈉(pH＝4.0)，再加入20μl異淀粉酶(酶活大于250U)于40℃恒溫水浴搖床反應2hr。后，沸水加熱5分鐘，去異淀粉酶活，10,000g離心5分鐘，取上清液；加入0.2g左右離子交換樹脂AG501-X8，于50℃水浴搖床30min,后16000g離心10分鐘，過0.45μm PVDF小柱，保持40℃后直接進樣測定。

步驟4:凝膠滲透色譜儀器參數(shù)

采用TSK gel3000PWxl和4000PWxl串聯(lián)柱子，采用0.1mol/L磷酸氫二鈉和0.05mol/L磷酸二氫鈉為緩沖液和0.02％疊氮化鈉，流速為1.0ml/min,柱溫箱為40℃和示差檢測器。

步驟5：根據(jù)直鏈淀粉(第一出峰)面積與支鏈淀粉的長鏈(第二出峰)和支鏈淀粉的中短鏈(第三峰)總出峰面積之比，即為直鏈淀粉含量/支鏈淀粉含量之比。

圖2是水稻品種泰國香米的直鏈和支鏈淀粉圖，其中第一峰，保留時間在14.00min為直鏈淀粉；第二和第三峰均為支鏈淀粉部分，保留時間分別為19.00min和20.8min,分別為支鏈淀粉的長鏈和中短鏈部分。其中重復1的直鏈淀粉面積為6968，支鏈淀粉長鏈峰面積為10872，支鏈淀粉中短鏈峰面積為47884，6968/(10872+47884)＝11.9％。重復二中的直鏈淀 粉峰面積為8054，支鏈淀粉長鏈和中短鏈的峰面積分別為11683和64746，8054/(11683+64746)＝10.5％，直/支比率絕對差為1.4％，重復性好。具體見表2。

表2泰國米的直鏈淀粉及支鏈淀粉的比例

最后應該說明的是：以上實施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術方案，盡管參照了上述事例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應該理解：依然可以對本發(fā)明進行修改或局部替代，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要去范圍中。