本發(fā)明涉及免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種定量檢測結(jié)核分枝桿菌r干擾素的化學發(fā)光試劑盒及其制備方法、檢測方法、評價方法。

背景技術(shù)：

結(jié)核病在全世界仍為危害人類健康和生命的主要傳染病之一。目前全世界結(jié)核病患者約有2000萬人，每年新增結(jié)核病患者800萬人左右，每年因結(jié)核病死亡人數(shù)約300萬人。我國僅次于印度，位居世界第二。通過近幾年的流行病學抽樣調(diào)查初步結(jié)果表明，我國約5億人口感染結(jié)核分枝桿菌，現(xiàn)有結(jié)核病人約500萬人，每年約10萬人死亡于結(jié)核病，在我國傳染病中位居第一。面對如此嚴峻的形勢，結(jié)核病的預(yù)防和控制已經(jīng)引起國內(nèi)外政府和學者的高度重視。因此結(jié)核病的早期診斷和治療對結(jié)核病控制尤為重要。

機體對結(jié)核分枝桿菌的免疫應(yīng)答主要體現(xiàn)為細胞免疫。因此對于結(jié)核分枝桿菌的檢測只有通過對細胞免疫應(yīng)答進行，近年來，一種用于診斷結(jié)核分枝桿菌的新方法進入人們視線，其利用特異性刺激蛋白對已感染結(jié)核桿菌的細胞進行刺激培養(yǎng)，機體細胞會分泌大量的r干擾素，利用免疫手段對分泌的特異性的r干擾素進行檢測，間接的體現(xiàn)機體細胞的結(jié)核分枝桿菌的受感染情況，該檢測原理被稱為r干擾素釋放試驗(IGRA)技術(shù)。

在該檢測原理基礎(chǔ)上衍生出了多種檢測方法學，目前市場上所擁有的包括酶聯(lián)免疫斑點(ELISPOT)法、酶聯(lián)免疫(ELISA)法。ELISPOT檢測的檢測靈敏度較高，但因該檢測方法在抽取病人血樣后需要做淋巴細胞分離計數(shù)后再進行后期的刺激培養(yǎng)過夜及免疫檢測程序，操作復(fù)雜，專業(yè)門檻較高，大大限制了檢測通量，另外因其涉及的配套設(shè)備和試劑較多，也大大增加了檢測成本及操作過程中的錯誤率發(fā)生。ELISA檢測因使用全血培養(yǎng)，節(jié)省了較多操作時間，在檢測通量上也彌補了ELISPOT的缺陷，但因為檢測方法學的限制，其檢測靈敏度較低，對于低免疫力或淋巴細胞數(shù)量偏低的人群，其檢測結(jié)果的不確定性較高，無法做到精確的診斷，且因其檢測低靈敏度的原因，所需檢測血樣量也較高，需要不低于每個培養(yǎng)管1ml的血量。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述不足的缺陷，本發(fā)明提供了一種定量檢測結(jié)核分枝桿菌r干擾素的化學發(fā)光試劑盒及其制備方法、檢測方法、評價方法，可以實現(xiàn)檢測靈敏度高、特異性好、操作簡便，檢測通量高，檢測成本低，檢測樣本量少且不需要太多復(fù)雜的輔助設(shè)備。

本發(fā)明提供了一種定量檢測結(jié)核分枝桿菌r干擾素的試劑盒，包括血樣刺激系統(tǒng)和免疫檢測系統(tǒng)，所述血樣刺激系統(tǒng)包括培養(yǎng)管、血樣刺激用對照品、結(jié)核特異性刺激蛋白；所述免疫檢測系統(tǒng)包括包被有r干擾素克隆抗體的化學發(fā)光板、生物素標記的r干擾素克隆抗體、鏈霉親和素標記的酶底物和酶促發(fā)光底物。

上述的試劑盒，其中，所述血樣刺激用對照品包括血樣刺激用陰性對照品和血樣刺激用陽性對照品；所述包被有r干擾素克隆抗體的化學發(fā)光板包括包被有r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體的化學發(fā)光板；所述生物素標記的r干擾素克隆抗體包括生物素標記的r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體；所述鏈霉親和素標記的酶底物包括辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。

上述的試劑盒，其中，所述血樣刺激用陰性對照品中包括AIM-V培養(yǎng)液。

上述的試劑盒，其中，所述結(jié)核特異性刺激蛋白包括AIM-V培養(yǎng)液和結(jié)核分枝桿菌特異性刺激蛋白ESAT6和CFP10的獨立蛋白混合或ESAT6和CFP10融合蛋白。

上述的試劑盒，其中，所述血樣刺激用陽性對照品中包括AIM-V培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液、植物血凝素或CD3細胞因子。

上述的試劑盒，其中，所述生物素標記的r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體的緩沖液為磷酸鹽緩沖液和蛋白保護劑。

上述的試劑盒，其中，所述鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的緩沖液為磷酸鹽緩沖液和蛋白保護劑。

同時在另一種實施例中，本發(fā)明還提供了一種定量檢測結(jié)核分枝桿菌r干擾素的試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

r干擾素單克隆抗體或多克隆抗體包被化學發(fā)光板的制備；

生物素標記的r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體及工作夜的制備；

鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶及工作液的制備；

校準品的制備；

洗滌液的制備。

本發(fā)明的另一面，本發(fā)明還提供了一種定量檢測結(jié)核分枝桿菌r干擾素的試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：

血樣培養(yǎng)；

r干擾素檢測。

本發(fā)明的再一面，本發(fā)明還提供了一種定量檢測結(jié)核分枝桿菌r干擾素的試劑盒的評價方法，包括以下步驟：

根據(jù)試劑盒的檢測結(jié)果繪制標準曲線；

根據(jù)上述的標準曲線計算最低檢出限和精密性值；

根據(jù)上述最低檢出限和精密性值來判定檢測樣本的陰陽性。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：采用酶促化學發(fā)光法，將r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體包被于化學發(fā)光板中，利用酶促催化發(fā)光底物，并利用生物素放大系統(tǒng)，提高了試劑盒的靈敏度和準確性；同時對于樣本使用量為3.0ml以下；實驗證明，化學發(fā)光法配合生物素放大系統(tǒng)是一種檢測r干擾素的有效方法，且進一步證明了對3.0ml以下的血樣量的檢測結(jié)果也有效的符合于臨床評判。

具體優(yōu)點包括：

1、化學發(fā)光法配合生物素放大系統(tǒng)檢測系統(tǒng)，對于T淋巴細胞偏少的樣本的檢測結(jié)果與市面上ELISA試劑盒做了比對，本發(fā)明試劑盒的檢測靈敏度明顯高于ELISA試劑盒，能夠?qū)LISA檢測結(jié)果不確定的樣本，做出很好的結(jié)果判斷；

2、本發(fā)明試劑盒在血樣處理上，沒有T淋巴細胞分離過程，為全血直接培養(yǎng)，在此操作上與市面上的ELISPOT試劑盒比較，減少了操作程序，避免了更多的操作失誤，也節(jié)省了更多的操作時間，降低了操作所需試劑耗材的成本損耗；且因本發(fā)明試劑盒無需做太多血樣處理，操作簡便，對于所需設(shè)備也無很高要求，可實現(xiàn)大通量檢測，免疫診斷部分可實現(xiàn)半自動化或全自動化批量操作。

3、目前市場上的ELISA試劑盒所需樣本量為3ml以上；ELISPOT試劑盒所需樣本量為5ml以上，對于低免疫人群的樣本量需求更高，甚至達到8-10ml，本發(fā)明試劑盒對于血樣樣本量的最高要求僅為3.0ml，大大減少了病人的血樣抽取量。

附圖說明

通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明及其特征、外形和優(yōu)點將會變得更明顯。在全部附圖中相同的標記指示相同的部分。并未刻意按照比例繪制附圖，重點在于示出本發(fā)明的主旨。

圖1為本發(fā)明提供的化學發(fā)光檢測試劑盒的標準曲線。

具體實施方式

在下文的描述中，給出了大量具體的細節(jié)以便提供對本發(fā)明更為徹底的理解。然而，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是，本發(fā)明可以無需一個或多個這些細節(jié)而得以實施。在其他的例子中，為了避免與本發(fā)明發(fā)生混淆，對于本領(lǐng)域公知的一些技術(shù)特征未進行描述。

為了徹底理解本發(fā)明，將在下列的描述中提出詳細的步驟以及詳細的結(jié)構(gòu)，以便闡釋本發(fā)明的技術(shù)方案。本發(fā)明的較佳實施例詳細描述如下，然而除了這些詳細描述外，本發(fā)明還可以具有其他實施方式。

本發(fā)明提供了一種定量檢測結(jié)核分枝桿菌r干擾素的試劑盒，包括血樣刺激系統(tǒng)和免疫檢測系統(tǒng)，所述血樣刺激系統(tǒng)包括培養(yǎng)管、血樣刺激用對照品、結(jié)核特異性刺激蛋白；所述免疫檢測系統(tǒng)包括包被有r干擾素克隆抗體的化學發(fā)光板、生物素標記的r干擾素克隆抗體、鏈霉親和素標記的酶底物和酶促發(fā)光底物。其中培養(yǎng)管中血樣需求量在1.0ml及以下，也即每個檢測樣本量所需樣本量在3ml以下，目前市場上的ELISA試劑盒所需樣本量為3ml以上；ELISPOT試劑盒所需樣本量為5ml以上，對于低免疫人群的樣本量需求更高，甚至達到8-10ml，本發(fā)明試劑盒對于血樣樣本量的最高要求僅為3.0ml，大大減少了病人的血樣抽取量。

在本發(fā)明一優(yōu)選但非限制的實施例中，血樣刺激用對照品包括血樣刺激用陰性對照品和血樣刺激用陽性對照品；包被有r干擾素克隆抗體的化學發(fā)光板包括包被有r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體的化學發(fā)光板，進一步，包被于化學發(fā)光板中的r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體的濃度在于1～3ug/ml；生物素標記的r干擾素克隆抗體包括生物素標記的r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體；鏈霉親和素標記的酶底物包括辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。其中鏈霉親和素標記的酶底物并不限于辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶，進一步，辣根過氧化物酶為辣根過氧化氫酶。

在本發(fā)明一優(yōu)選但非限制的實施例中，血樣刺激用陰性對照品中包括AIM-V培養(yǎng)液。

在本發(fā)明一優(yōu)選但非限制的實施例中，結(jié)核特異性刺激蛋白包括AIM-V培養(yǎng)液和結(jié)核分枝桿菌特異性刺激蛋白ESAT6和CFP10的獨立蛋白混合或ESAT6和CFP10融合蛋白。

在本發(fā)明一優(yōu)選但非限制的實施例中，血樣刺激用陽性對照品中包括AIM-V培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液、植物血凝素或CD3細胞因子。

在本發(fā)明一優(yōu)選但非限制的實施例中，生物素標記的r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體的緩沖液為磷酸鹽緩沖液和蛋白保護劑。

在本發(fā)明一優(yōu)選但非限制的實施例中，鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的緩沖液為磷酸鹽緩沖液和蛋白保護劑，其中保護蛋白劑可以為酪蛋白、牛血清白蛋白、明膠、動物血清或人血清。

在本發(fā)明一優(yōu)選但非限制的實施例中，酶促發(fā)光底物為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶的酶促發(fā)光底物。

在本發(fā)明一優(yōu)選但非限制的實施例中，試劑盒中還包含r干擾素校準品。本發(fā)明的另一面，一種定量檢測結(jié)核分枝桿菌r干擾素的試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

步驟S1：r干擾素單克隆抗體或多克隆抗體包被化學發(fā)光板的制備，具體包括，利用磷酸鹽緩沖液或碳酸鹽緩沖液將r干擾素單克隆抗體或多克隆抗體稀釋至1～3ug/ml，按照100ul/孔加入化學發(fā)光板中，并于4℃放置16～20小時后，取出化學發(fā)光板，甩干殘液，利用如牛血清白蛋白、酪蛋白、明膠、動物或人血清等進行封閉處理，按照120ul～200ul/孔加樣，37℃放置2小時或4℃放置16～20小時，甩干殘液，干燥保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

步驟S2：生物素標記的r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體及工作夜的制備，具體包括步驟S2a：生物素標記的r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體制備，具體為利用0.1M PBS pH7.2配制10mM NHS-DPEG4-Biotin工作溶液。將r干擾素單克隆抗體或多克隆抗體加入適量的10mM NHS-DPEG4-Biotin工作溶液中，于室溫反應(yīng)1小時，利用葡聚糖凝膠分離純化，去除游離生物素，加入0.1％BSA，放置4℃?zhèn)溆?；步驟S2b：生物素標記的r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體工作液的制備，具體包括：稀釋液的制備：0.01M PB緩沖液(pH7.4)，1％酪蛋白或1％BSA，0.1％proclin300；工作液的制備：用稀釋液稀釋生物素標記好的r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體后得到生物素標記的r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體工作液，其稀釋比例在1:500～1:5000，優(yōu)選比例比例為1:1000。

步驟S3：鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶及工作液的制備，具體包括步驟S3a：鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的制備，其中包括采用戊二醇法，將辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶配置成50IU/ml，取適量，加入含1.25％戊二醛的pH6.8的PBS溶液中，混勻至室溫下反應(yīng)過夜。收集反應(yīng)液，利用PBS(pH7.2)透析4次，取適量SA溶于1mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.5)中，與透析后的反應(yīng)液混勻，于4℃反應(yīng)，并加入適量0.2mol/L賴氨酸溶液?；靹?，室溫反應(yīng)2小時，利用0.05mol/L PBS(pH7.2)透析4次。離心取上清液，至4℃?zhèn)溆?。步驟S3b：鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶工作液的制備，其中包括，稀釋液的制備：0.1M TB緩沖液(pH7.4)，1％酪蛋白或1％BSA，0.1％proclin300；工作液的制備：用稀釋液稀釋鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶后得到鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶工作液或鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶工作液，其稀釋比例在1:500～1:5000，優(yōu)選稀釋比例為1:1000。

步驟S4：校準品的制備，具體包括：r干擾素校準品抗原為基因重組的濃度≥95％的人r干擾素蛋白或國際(WHO/NIBSC)和國家中檢院提供的人r干擾素標準品物質(zhì)，本發(fā)明試劑盒中涉及的r干擾素校準品的稀釋液為AIM-V或含1％BSA的PB緩沖液，內(nèi)含0.1％proclin300。稀釋濃度梯度為：0IU/ml、0.25IU/ml、1.0IU/ml、4.0IU/ml、16.0IU/ml、64.0IU/ml，用于制作檢測標準曲線，制作的標注曲線如圖1所示的其中一種實施例。

步驟S5：洗滌液的制備，具體包括：洗滌液為0.01M PBST溶液，配制1L的洗滌液：二水磷酸二氫鈉9.75g、十二水磷酸氫二鈉51g、氯化鈉155g、Tween20 10ml，內(nèi)含0.1％proclin300，使用時利用超純水20倍稀釋。

本發(fā)明的還提供了一種定量檢測結(jié)核分枝桿菌r干擾素的試劑盒的檢測方法，具體包括以下步驟：

步驟a：血樣培養(yǎng)，具體包括，肝素抗凝血樣管抽取血樣3.0ml量；在血樣離體6-8小時內(nèi)，按照1.0ml/管血樣分別加入陰性對照培養(yǎng)管、特異性刺激培養(yǎng)管、陽性對照培養(yǎng)管；血樣管上下顛倒8-10次或5秒時間，使血樣與培養(yǎng)管中的物質(zhì)充分混勻，此階段若產(chǎn)生氣泡對后續(xù)檢測無影響；將血樣培養(yǎng)管豎直放置37℃培養(yǎng)箱中，孵育20～24小時。

步驟b：r干擾素檢測階段，具體包括20倍稀釋濃縮洗滌液至工作濃度；按照稀釋梯度進行標準品濃度稀釋，并加入化學發(fā)光板中，50ul/孔，做好標示；取出培養(yǎng)管，抽取上清液作為檢測樣本；也可離心機離心獲取上清液；按照50ul/孔加入對應(yīng)板孔，做好標示；取生物素標記的r干擾素抗體工作液，按照50ul/孔加入對應(yīng)板孔；37℃孵育2h，取出，每孔200ul洗滌液，洗滌4次，拍干；取鏈霉親和素標記的過氧化物酶工作液或鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶工作液，按照50ul/孔加入對應(yīng)反應(yīng)孔；50ul/孔，放置37℃反應(yīng)30min取出發(fā)光板，每孔200ul洗滌液，洗滌4次，拍干；每孔加入50ul酶發(fā)光底物，讀取發(fā)光值；分別取校準品梯度的濃度值和發(fā)光值的對數(shù)值，制作標準曲線，獲得曲線方程；將待測樣本的發(fā)光值取對數(shù)值代入，計算出待測樣本濃度值的對數(shù)值，取指數(shù)，即為待測樣本的濃度值。

本發(fā)明還提供了一種定量檢測結(jié)核分枝桿菌r干擾素的試劑盒的評價方法，具體包括步驟(1)：根據(jù)試劑盒的檢測結(jié)果繪制標準曲線，具體為本發(fā)明試劑盒用校準品濃度(0IU/ml剔除，該值作為反應(yīng)板本底考慮，不計入標準曲線范圍內(nèi))的ln值作為X值，對應(yīng)濃度檢測的發(fā)光值RLU分別取對數(shù)做Y值，以此做一元一次方程。如圖1所示，所繪制的標準曲線回歸方程為y＝0.8882x+7.2012，R2＝0.9994。

步驟(2)：根據(jù)上述的標準曲線計算最低檢出限和精密性值，具體包括本發(fā)明試劑盒在檢測標準曲線的同時檢測最低檢出限參考品(0.1IU/ml)10次，并通過標準曲線計算最低檢出限參考品的平均濃度值(x)和標準差(SD)。根據(jù)公式：檢出限＝X+2SD，計算樣品的最低檢出限，結(jié)果如表1，本發(fā)明試劑盒對血樣檢測IFN-r的最低檢出限為0.139IU/ml＜0.15IU/ml，如表1所示為IFN-r化學發(fā)光檢測試劑盒的最低檢出限。同上述最低檢出限的檢測結(jié)果，本發(fā)明試劑盒利用標準差(SD)/平均濃度值(x)所獲得的比值即為精密性值，即：標準差0.010IU/ml除以平均濃度值0.092IU/ml，乘以100％，為11.11％＜15％。

表1 IFN-r化學發(fā)光檢測試劑盒的最低檢出限

步驟(3)：根據(jù)上述最低檢出限和精密性值來判定檢測樣本的陰陽性，具體包括，篩選20例新鮮血樣，10例明確結(jié)核感染陽性患者，10例明確結(jié)核感染陰性樣本。利用本發(fā)明試劑盒進行血樣培養(yǎng)及免疫反應(yīng)檢測。對血樣進行編號：10例陰性樣本N1～N10；10例陽性樣本P1～P10對標準曲線濃度值及發(fā)光值分別取對數(shù)，擬合標準曲線，同時將樣本檢測發(fā)光值取對數(shù)值，帶入方程式中Y值，計算出X值，并取X值的指數(shù)值，即為對應(yīng)樣本發(fā)光值的濃度值。對該些濃度值進行數(shù)據(jù)分析，判定該檢測樣本的陰陽性。其中陰陽性結(jié)果判定依據(jù)如下所示：

1.當陰性培養(yǎng)管濃度≤8IU/ml：

1.1.T-N＜0.35IU/ml，P-N≥0.5IU/ml，結(jié)果為陰性；

1.2.T-N≥0.35IU/ml且＜N/4，P-N≥0.5IU/ml，結(jié)果為陰性；

1.3.T-N≥0.35IU/ml且≥N/4，結(jié)果為陽性；

1.4.T-N＜0.35IU/ml且P-N＜0.5IU/ml，結(jié)果為不確定；

1.5.T-N≥0.35IU/ml且＜N/4，P-N＜0.5IU/ml，結(jié)果為不確定；

2.當陰性培養(yǎng)管濃度＞8IU/ml：

任何檢測值都判為不確定性。

使用本發(fā)明的試劑盒檢測的結(jié)果如表2所示：

表2 IFN-r化學發(fā)光試劑盒檢測10例陰性血樣、10例陽性血樣的結(jié)果

從表2可以看出，采用本發(fā)明試劑盒檢測r干擾素與目前市面上所擁有的ELISPOT方法學檢測試劑盒以及ELISA檢測試劑盒相比較，具有操作簡便、操作靈敏度高、特異性好、檢測成本低、樣本使用量少，對于設(shè)備的要求低等的優(yōu)點。

以上對本發(fā)明的較佳實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，其中未盡詳細描述的設(shè)備和結(jié)構(gòu)應(yīng)該理解為用本領(lǐng)域中的普通方式予以實施；任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍情況下，都可利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動和修飾，或修改為等同變化的等效實施例，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所做的任何簡單修改、等同變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護的范圍內(nèi)。