本發(fā)明涉及一種農(nóng)業(yè)發(fā)酵技術(shù)，尤其涉及的是一種基于NIR光譜技術(shù)的靈芝多糖定量方法。

背景技術(shù)：

靈芝(Ganoderma Lucidum)為擔(dān)子菌亞門、層菌綱、多孔菌目、非褶菌科、靈芝屬的子實(shí)體，為比較名貴的傳統(tǒng)中草藥。其中，靈芝多糖對(duì)腫瘤、免疫性疾病、高血糖、細(xì)胞衰老有治療能力。靈芝中分離出來(lái)的靈芝三萜類物質(zhì)及其衍生物有80多種，現(xiàn)代藥理研究表明，靈芝三萜類化合物具有保肝、抗腫瘤、抗氧化、抑制血管緊張素、抗HIV病毒活性等作用。靈芝多糖具有抗腫瘤，調(diào)節(jié)免疫，保肝，調(diào)節(jié)血糖等作用。

靈芝多糖因其具有的藥用功能，一直受到廣泛關(guān)注。其中常用的靈芝多糖生產(chǎn)方法為發(fā)酵法。通過(guò)發(fā)酵獲得大量的靈芝菌絲體，從中提取獲得靈芝多糖。對(duì)靈芝多糖測(cè)定的常用方法為分光光度法，如硫酸蒽酮法和硫酸苯酚法。但無(wú)論上述哪種方法都涉及大量化學(xué)試劑的使用，易造成環(huán)境污染；實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)復(fù)雜；只能對(duì)單一成分進(jìn)行檢測(cè)。無(wú)法實(shí)現(xiàn)快速、多成分、無(wú)污染的實(shí)時(shí)檢測(cè)。相比之下，NIR光譜法檢測(cè)具有多方面的優(yōu)勢(shì)，適于靈芝多糖的快速定量分析。

近紅外光是指波長(zhǎng)在780～2526nm的電磁波。應(yīng)用近紅外(Near Infrared，NIR)光譜可以反映生物分子中C-H、O-H、N-H和S-H等基團(tuán)的信息。因而在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、食品產(chǎn)業(yè)和制藥工業(yè)等方面都有相關(guān)的應(yīng)用研究。例如，在農(nóng)業(yè)方面，NIR光譜技術(shù)應(yīng)用范圍比較廣泛，如稻谷、玉米、大豆等谷物的蛋白質(zhì)含量、水分含量等都已在中國(guó)、德國(guó)、英國(guó)、法國(guó)建立了相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，動(dòng)物飼料中的水分、粗蛋白、粗纖維、賴氨酸、蛋氨酸等也在中國(guó)和德國(guó)建立了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)；食品行業(yè)中，英國(guó)也建立了乳制品的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；中國(guó)木材加工業(yè)也建立了基于NIR光譜技術(shù)的定性分析國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；輕工業(yè)方面也建立了紙張的定量標(biāo)準(zhǔn)?？梢?jiàn)，隨著近紅外光譜儀的技術(shù)進(jìn)步、化學(xué)計(jì)量學(xué)方法的完善和計(jì)算機(jī)計(jì)算能力的提高，基于NIR光譜技術(shù)的定性和定量分析方法日趨成熟。且由于NIR光譜技術(shù)具有重復(fù)性好、檢測(cè)速度快、無(wú)污染、可對(duì)多組分同時(shí)分析、可實(shí)時(shí)在線檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種基于NIR光譜技術(shù)的靈芝多糖定量方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)液體發(fā)酵的靈芝菌絲體多糖的定量分析。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括以下步驟：

(1)利用發(fā)酵方式獲得靈芝菌絲體，并制備靈芝菌絲體干粉；

(2)對(duì)于靈芝菌絲體干粉，利用硫酸蒽酮法進(jìn)行多糖測(cè)定；

(3)并對(duì)靈芝菌絲體干粉進(jìn)行NIR檢測(cè)，波數(shù)范圍為12500～4000cm^-1，并收集光譜數(shù)據(jù)；

(4)將測(cè)量光譜在12500～9000cm^-1范圍內(nèi)截除，保留9000～4000cm^-1光譜范圍，進(jìn)行矢量歸一化后，選定一階導(dǎo)數(shù)作為建模預(yù)處理方式；

(5)建立校正集和驗(yàn)證集，利用校正集的硫酸蒽酮法測(cè)量結(jié)果和測(cè)量光譜構(gòu)建定量模型，對(duì)靈芝多糖進(jìn)行提取和純化，并對(duì)靈芝浸提沉淀、靈芝浸提后上清液、靈芝上清液濃縮后粗多糖、醇沉復(fù)溶后的靈芝多糖粗提液、除蛋白后的靈芝多糖粗提液和透析后的靈芝多糖粗提液六種凍干樣品分別進(jìn)行NIR測(cè)定，根據(jù)光譜譜線收斂情況選擇波數(shù)范圍為4900～4667cm^-1和4553～4000cm^-1，建立基于偏最小二乘的多糖分析模型；

(6)將驗(yàn)證集的測(cè)量的光譜導(dǎo)入上述多糖分析模型，對(duì)照利用硫酸蒽酮法測(cè)定的結(jié)果，利用所構(gòu)建的模型進(jìn)行結(jié)果預(yù)測(cè)。

利用校正集的硫酸蒽酮法測(cè)量結(jié)果和測(cè)量光譜構(gòu)建定量模型，構(gòu)建模型基于兩方面考慮：一是根據(jù)實(shí)驗(yàn)中得出的結(jié)論，即通過(guò)對(duì)靈芝樣品進(jìn)行一定的處理，使得不同的靈芝樣品中含有不同含量的蛋白質(zhì)、脂類、糖類等成分，對(duì)這些樣品進(jìn)行NIR檢測(cè)，測(cè)量和分析其NIR光譜圖，從中可以找到與靈芝多糖組分密切相關(guān)的光譜譜段，使得所選譜段既包含靈芝多糖區(qū)域又不宜太寬而引入其它成分的影響；二是定量模型本身，通過(guò)調(diào)整選取的光譜譜段，使得PLS定量計(jì)算中R²值和RPD值盡可能大，RMSEC盡可能小，以使該定量模型比較準(zhǔn)確。在此基礎(chǔ)上，選擇波數(shù)范圍為4900～4667cm^-1和4553～4000cm^-1，建立基于偏最小二乘的多糖分析模型。

所述步驟(1)中，制備靈芝菌絲體干粉的具體過(guò)程如下：將靈芝菌種取0.5cm²小塊，接種于滅菌的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28℃，180rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng)，至菌絲體長(zhǎng)滿培養(yǎng)液，將菌絲體取出，4000rpm離心5min，棄上清，保留沉淀，即菌絲體，用無(wú)菌ddH₂O清洗菌絲體，并離心2次，將菌絲體置于60℃下干燥，干燥后用研缽研磨成均勻干粉末，備用。

利用發(fā)酵方式獲得靈芝菌絲體提取靈芝多糖的具體過(guò)程如下：取樣品粉末2g，置于燒瓶中，加水60ml，80℃水浴加熱1h，加熱提取3h，5000rpm離心8min，保留上清，沉淀攪開(kāi)，加水60ml，80℃水浴加熱2小時(shí)，5000rpm離心8min，合并上清，置于水浴上蒸干，殘?jiān)?ml ddH₂O溶解，邊攪拌邊緩慢滴加無(wú)水乙醇75ml，搖勻，4℃放置12h，離心，棄去上清，沉淀加熱水溶解后定容于50ml，待測(cè)。

所述步驟(2)中，利用硫酸蒽酮法測(cè)定靈芝發(fā)酵菌絲中多糖含量具體過(guò)程如下：

首先繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線；然后進(jìn)行樣品測(cè)定，取待測(cè)樣品2ml，置于10ml具塞試管中，迅速加入0.25％的硫酸蒽酮溶液6ml，搖勻后放置15分鐘，冰浴冷卻15分鐘，取出，以相應(yīng)的試劑為空白，依照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在625nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，按照上述繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中以葡萄糖計(jì)的所含多糖含量。

所述葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：對(duì)葡萄糖在625nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的多糖含量。

所述步驟(3)中，采集樣品的近紅外漫反射光譜，波數(shù)范圍為12500～400cm^-1，分辨率16cm^-1，掃描次數(shù)32次，利用積分球聚集光信號(hào)，InGaAs檢測(cè)器檢測(cè)，每份樣品采集至少2次光譜，取其平均光譜作為樣品原始光譜。

所述步驟(3)中，還包括對(duì)數(shù)據(jù)的分析：將測(cè)量結(jié)果進(jìn)行聚類分析。采用聚類分析，以便評(píng)價(jià)樣本FTIR光譜的相似性、樣品特征性的光譜子集。

比較多種預(yù)處理方法對(duì)建模結(jié)果的影響。包括多元散射校正(MSC)、一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)等。最終選定一階導(dǎo)數(shù)作為建模預(yù)處理方式。一階導(dǎo)數(shù)法可有效的消除基線和其他背景的干擾，分辨重疊峰，提高分辨率和靈敏度，有利于在復(fù)雜的峰形中更好的確定譜峰的準(zhǔn)確位置，從而達(dá)到鑒別光譜的目的。

所述步驟(5)中，按照1：1的數(shù)量比劃分校正集和驗(yàn)證集。

所述步驟(5)中，所述多糖分析模型中R²值為0.9793，RMSECV為0.0751，RPD為6.95，維數(shù)為8。

所述步驟(6)中，所述模型進(jìn)行預(yù)測(cè)時(shí)，具體參數(shù)為：RMSEP為0.918，RPD為2.66，Bias為0.853，相關(guān)因子為0.942。

利用校正集的硫酸蒽酮法測(cè)量結(jié)果和測(cè)量光譜構(gòu)建定量模型，所構(gòu)建模型基于兩方面考慮：一是根據(jù)實(shí)驗(yàn)中得出的結(jié)論，即通過(guò)對(duì)靈芝樣品通過(guò)一定的步驟進(jìn)行處理，使得不同樣品中所含有不同含量的蛋白質(zhì)、脂類、糖類等成分，對(duì)這些樣品進(jìn)行NIR檢測(cè)，測(cè)量和分析其NIR光譜圖，從中可以找到與靈芝多糖組分密切相關(guān)的光譜譜段，使得所選譜段既包含靈芝多糖區(qū)域又不宜太寬而引入其它成分的影響；二是定量模型本身，通過(guò)調(diào)整選取的光譜譜段，使得PLS定量計(jì)算中R²值和RPD值盡可能大，RMSEC盡可能小，以使該定量模型比較準(zhǔn)確。在此基礎(chǔ)上，選擇波數(shù)范圍為4900～4667cm^-1和4553～4000cm^-1，建立基于偏最小二乘的多糖分析模型。

不同生物樣本所含有的成分不同，含量差異大，樣品處理方式不一樣，都會(huì)影響測(cè)量結(jié)果和方法選擇，從而導(dǎo)致樣品處理、光譜預(yù)處理方式、選取光譜譜段等方面均存在差異，因此不能簡(jiǎn)單套用現(xiàn)有的一些測(cè)量生物樣本的方法來(lái)對(duì)靈芝多糖進(jìn)行定量。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明利用NIR光譜技術(shù)，結(jié)合硫酸蒽酮法測(cè)定的結(jié)果，對(duì)液體發(fā)酵的靈芝菌絲體多糖含量構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，以便建立基于NIR光譜技術(shù)的靈芝菌絲體發(fā)酵多糖定量方法。這種方法將對(duì)靈芝品種選育和靈芝多糖的工業(yè)生產(chǎn)有重要意義。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例1靈芝干燥菌絲體NIR光譜檢測(cè)結(jié)果；

圖2是實(shí)施例1原光譜經(jīng)一階導(dǎo)數(shù)處理后選取的波段范圍；

圖3是實(shí)施例1優(yōu)化得到的靈芝菌絲體多糖NIR光譜定量模型；

圖4是實(shí)施例2的凍干樣品NIR光譜檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

本實(shí)施例獲得和收集不同多種靈芝菌絲體，在本實(shí)施例中，采用低溫等離子體誘變技術(shù)得到大量靈芝菌絲體。在等離子體處理中，可能造成后者細(xì)胞內(nèi)代謝過(guò)程發(fā)生改變，引起其多糖含量變化。

本實(shí)施例的具體定量過(guò)程如下：

(1)利用發(fā)酵方式獲得靈芝菌絲體，并制備靈芝菌絲體干粉

將靈芝菌種取0.5cm²小塊，接種于滅菌的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28℃，180rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng)，至菌絲體長(zhǎng)滿培養(yǎng)液，將菌絲體取出，4000rpm離心5min，棄上清，保留沉淀，即菌絲體，用無(wú)菌ddH₂O清洗菌絲體，并離心2次。將菌絲體置于60℃下干燥，干燥后用研缽研磨成均勻干粉末，備用。

(2)對(duì)于靈芝菌絲體干粉，利用硫酸蒽酮法進(jìn)行多糖測(cè)定

取樣品粉末2g，置于燒瓶中，加水60ml，80℃水浴加熱1h，加熱提取3h，5000rpm離心8min，保留上清，沉淀攪開(kāi)，加水60ml，80℃水浴加熱2小時(shí)，5000rpm離心8min，合并上清，置于水浴上蒸干，殘?jiān)?ml ddH₂O溶解，邊攪拌邊緩慢滴加無(wú)水乙醇75ml，搖勻，4℃放置12h，離心，棄去上清，沉淀加熱水溶解后定容于50ml，待測(cè)。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每1ml含0.12mg的溶液，制得標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液；取其中0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml以及樣品溶液2ml，分別置于10ml的具塞試管中，各加水至2.0ml，迅速加入0.25％的硫酸蒽酮溶液6ml，搖勻后放置15分鐘，冰浴冷卻15分鐘，取出，以相應(yīng)的試劑為空白，依照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在625nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的多糖含量。

樣品測(cè)定：取待測(cè)樣品2ml，置于10ml具塞試管中，迅速加入0.25％的硫酸蒽酮溶液6ml，搖勻后放置15分鐘，冰浴冷卻15分鐘，取出，以相應(yīng)的試劑為空白，依照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在625nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，按照上述繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中以葡萄糖計(jì)的所含多糖含量。

(3)對(duì)靈芝菌絲體干粉進(jìn)行NIR檢測(cè)

使用德國(guó)布魯克公司MPA型近紅外光譜儀直接采集近紅外漫反射光譜，波數(shù)范圍為12500～4000cm^-1，分辨率16cm^-1，掃描次數(shù)32次。利用積分球聚集光信號(hào)，InGaAs檢測(cè)器檢測(cè)，每份樣品采集2次光譜，取其平均光譜作為樣品原始光譜，如圖1所示。

測(cè)量結(jié)果測(cè)量后，經(jīng)OPUS 7.0軟件收集并進(jìn)行軟件分析，并導(dǎo)出利用SPSS16.0軟件進(jìn)行聚類分析，以便評(píng)價(jià)樣本FTIR光譜的相似性、樣品特征性的光譜子集。

(4)光譜預(yù)處理

將測(cè)量光譜在12500～9000cm^-1范圍內(nèi)截除，保留9000～4000cm^-1光譜范圍，進(jìn)行矢量歸一化后，比較多種預(yù)處理方法對(duì)建模結(jié)果的影響。選用多元散射校正(MSC)、一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)等。最終選定一階導(dǎo)數(shù)作為建模預(yù)處理方式。該方法可有效的消除基線和其他背景的干擾，分辨重疊峰，提高分辨率和靈敏度，有利于在復(fù)雜的峰形中更好的確定譜峰的準(zhǔn)確位置，從而達(dá)到鑒別光譜的目的。

對(duì)12500～4000cm^-1光譜范圍內(nèi)的波段進(jìn)行優(yōu)化，以優(yōu)化獲得理想的建模光譜范圍。

(5)利用校正集的測(cè)量結(jié)果和測(cè)量光譜構(gòu)建定量模型

按照數(shù)量比1:1對(duì)靈芝菌絲體干粉建立校正集和驗(yàn)證集，將校正集60個(gè)樣本硫酸蒽酮法測(cè)定結(jié)果和測(cè)量獲得光譜導(dǎo)入OPUS軟件，構(gòu)建定量模型。經(jīng)過(guò)優(yōu)化，波數(shù)范圍為4900-4667cm^-1和4553～4000cm^-1，預(yù)處理方式為一階導(dǎo)數(shù)的定量方法結(jié)果最優(yōu)，一階導(dǎo)數(shù)選取范圍如圖2所示。其R²值為0.9793，RMSECV為0.0751，RPD為6.95，維數(shù)為8。結(jié)果如圖3所示。

波數(shù)范圍的優(yōu)化方法為：

對(duì)靈芝多糖進(jìn)行提取純化，用以分析判斷定量模型中所選取的譜段。

本實(shí)施例的具體過(guò)程如下：

(51)多糖提取和純化具體步驟

取140g靈芝淺層發(fā)酵干燥菌絲體粉末，加ddH₂O 7000ml，70℃水浴浸提2h。浸提液分置于離心管中，5000rpm離心15min，將菌渣和上清液分開(kāi)。棄去菌渣，其中含有的脂類物質(zhì)也隨之被棄去。上清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)燒瓶中，70℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到濃縮液850ml。濃縮液加入3400ml乙醇，低溫放置過(guò)夜沉淀，將醇沉后的溶液置于離心機(jī)中，5000rpm離心15min，棄上清，沉淀放入烘箱60℃加熱揮干，加水800ml復(fù)溶，為粗多糖提取液。取多糖提取液，將三氯甲烷按濃縮液體積的1/5加入，隨之再加入三氯甲烷體積1/5的正丁醇，混合物劇烈振蕩30min，3500r/min離心，分出水層和有機(jī)層交界處的變性蛋白質(zhì)。重復(fù)上述操作，直至無(wú)變性蛋白質(zhì)出現(xiàn)。通過(guò)此步驟除去樣品中的蛋白質(zhì)和殘余脂類。取上述粗多糖液中按照體積，添加活性炭1.5％，調(diào)整pH為6，在60℃恒溫水浴鍋中脫色40min。之后利用透析袋，注入粗多糖，兩端扎緊，懸掛置于ddH2O中，攪拌透析，每隔4h換水一次，直至透析液顏色不再變化為止。通過(guò)活性炭吸附和透析可以除去樣品中所含有的非結(jié)合性色素和小分子無(wú)機(jī)離子及有機(jī)物。通過(guò)以上步驟，雜質(zhì)被盡可能去除，靈芝多糖得以保存。

(52)對(duì)靈芝多糖粗提液凍干樣品制備

對(duì)每一步取樣品50ml，置于凍干機(jī)中，-60℃，凍干48h，得到干燥疏松的各步靈芝粗多糖樣本6份。分別為①靈芝浸提沉淀(菌渣)、②靈芝浸提后上清液(GL提取多糖原液)、③靈芝上清液濃縮后粗多糖(濃縮GLPS未醇沉)、④醇沉復(fù)溶后的靈芝多糖粗提液(醇沉復(fù)溶)、⑤除蛋白后的靈芝多糖粗提液(sevag后GLPS)、⑥透析后的靈芝多糖粗提液(透析后GLPS)。

對(duì)上述凍干樣品進(jìn)行NIR測(cè)定，結(jié)果如圖4所示。

通過(guò)對(duì)比分析圖4中各樣品，可以看到樣品①和樣品②因與后面各樣品所含有物質(zhì)差異明顯，光譜譜線的差異同樣明顯；樣品③④⑤⑥光譜譜線存在差異，但隨著處理的進(jìn)行，所含雜質(zhì)種類和含量越來(lái)越少，靈芝多糖得以保存，譜線越來(lái)越趨近收斂，特別是在所選定的光譜譜段4900～4667cm^-1和4553～4000cm^-1這種收斂情況更趨明顯。從而說(shuō)明靈芝多糖在NIR譜圖中對(duì)應(yīng)的位置在此范圍內(nèi)。

因此，光譜譜段4900～4667cm^-1和4553～4000cm^-1為備選的靈芝多糖定量模型的NIR光譜范圍。

(7)靈芝干燥菌絲體的NIR光譜定量驗(yàn)證集模型構(gòu)建

將驗(yàn)證集60個(gè)樣本測(cè)量的光譜導(dǎo)入構(gòu)建模型，對(duì)照利用硫酸蒽酮法測(cè)定的結(jié)果，利用所構(gòu)建的模型進(jìn)行結(jié)果預(yù)測(cè)，結(jié)果RMSEP為0.918，RPD為2.66，Bias為0.853，相關(guān)因子為0.942。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。