本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種腫瘤蛋白的檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

癌基因HER-2/neu編碼的一種重要的腫瘤表面標(biāo)記蛋白，在乳腺、卵巢、肺、胃、肝等十余種癌癥患者中均顯示有過量表達(dá)，P185過量表達(dá)的患者腫瘤惡性程度高，術(shù)后易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，并且對化療藥物治療具有抗性，因此檢測腫瘤抗原P185的表達(dá)水平，對多種腫瘤的鑒別診斷、分類預(yù)示療效以及治療方案的選擇均有重要意義，尤其是乳腺癌，P185已是國際公認(rèn)的一個(gè)重要的臨床指標(biāo)。

與檢測腫瘤組織中腫瘤蛋白P185的表達(dá)相比，檢測病人血清中腫瘤蛋白P185的表達(dá)簡便易行，但是目前國內(nèi)尚未建立檢測患者的血清中P185的試劑盒，因此研發(fā)出高靈敏性、高特異性及穩(wěn)定性的P185檢測試劑盒，用于乳腺、卵巢、肺、胃、肝等十余種癌癥血清中P185的檢測，這對上述腫瘤的篩查、診斷與治療具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種腫瘤蛋白檢測試劑盒，該試劑盒精密性高、穩(wěn)定性好。

本發(fā)明的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種腫瘤蛋白的檢測試劑盒，包括腫瘤蛋白P185單克隆抗體、酶標(biāo)板、陽性對照品、陰性對照品、洗滌液、終止液、辣根過氧化物酶-鏈親和素及其顯色底物，所述的腫瘤蛋白P185單克隆抗體包括包被在酶標(biāo)板上的腫瘤蛋白P185單克隆抗體和生物素標(biāo)記的腫瘤蛋白P185單克隆抗體。

優(yōu)選，所述的包被在酶標(biāo)板上的腫瘤蛋白P185單克隆抗體為腫瘤蛋白P185單克隆抗體2D11，所述的生物素標(biāo)記的腫瘤蛋白P185單克隆抗體為腫瘤蛋白P185單克隆抗體3F9，腫瘤蛋白P185單克隆抗體2D11、3F9的制備步驟如下：

a)以NIH/3T3細(xì)胞i.p免疫第一批6～8周的Balb/C雌鼠，得到雌鼠的抗NIH/3T3血清；

b)收集長至匯合的T6-17細(xì)胞，用PBS緩沖液洗三次，將上述制備的抗NIH/3T3抗血清用PBS緩沖液以1:20～100稀釋，然后取2ml加入T6-17細(xì)胞中，在4℃ 條件下溫育過夜，期間晃動盛放T6-17細(xì)胞的試管8-10次，然后再用PBS緩沖液洗三次，得到懸浮于PBS緩沖液中的T6-17細(xì)胞；

c)用上述懸浮于PBS緩沖液中的T6-17細(xì)胞i.p免疫第二批6-8周的BaLb/C雌鼠，然后取雌鼠的脾細(xì)胞制成細(xì)胞懸液；

d)將步驟c得到的細(xì)胞懸液與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合；

e)用ELISA法從上述融合的細(xì)胞中篩選出分泌腫瘤蛋白P185單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，采用有限稀釋法對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化，從而得到兩株具有穩(wěn)定分泌腫瘤蛋白P185單克隆抗體能力的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為雜交瘤細(xì)胞株2D11、雜交瘤細(xì)胞株3F9；

f)將雜交瘤細(xì)胞株2D11、3F9分別注入不同的雌鼠體內(nèi)，收集腹水，將腹水中的抗體純化，即得腫瘤蛋白P185單克隆抗體2D11、3F9。

優(yōu)選，所述的洗滌液是由28.8g的Na2HPO4·12H2O、80g的NaCl、3.9g的NaH2PO4·2H2O和50ml的Tween-20加入純化水溶解定容至100000ml所得。

優(yōu)選，所述顯色底物包括顯色液A和顯色液B，所述的顯色液A是用檸檬酸緩沖液將30％過氧化氫稀釋1000倍所得，所述的顯色液B為用含20％二甲基亞砜的檸檬酸緩沖液將四甲基聯(lián)苯胺配制成0.4mg/ml所得。

優(yōu)選，所述終止液是濃度為2mol/L的硫酸溶液。

優(yōu)選，所述陽性對照品、陰性對照品分別為人體的P185陽性血清、P185陰性血清。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

本發(fā)明在常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過生物素與辣根過氧化物酶-鏈親和素之間的高度放大作用，建立了一種高靈敏度生物素-親和素-酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，以測定待測樣中的腫瘤蛋白表達(dá)水平。親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，分子量為68kDa，由4個(gè)亞單位組成，對生物素有非常高的親和力，其結(jié)合常數(shù)高達(dá)1015M-1；所述的生物素很易與抗體等蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵結(jié)合，這樣結(jié)合有酶的辣根過氧化物酶-鏈親和素分子與結(jié)合有特異性抗體的生物素分子產(chǎn)生反應(yīng)，既起到了多級放大作用，又由于酶在遇到相應(yīng)的顯色底物時(shí)發(fā)生催化作用而呈色，從而達(dá)到檢測目標(biāo)抗原或抗體分子的目的，采用本發(fā)明的腫瘤蛋白P185檢測試劑盒可以有效、穩(wěn)定地測定人體血清中的腫瘤蛋白P185水平， 其靈敏度高，測試重復(fù)性好。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，本發(fā)明的示意性實(shí)施方式及其說明僅用于解釋本發(fā)明，并不作為對本發(fā)明的限定。

以下對腫瘤蛋白檢測試劑盒的制備、使用步驟以及使用效果進(jìn)一步說明：

1、腫瘤蛋白P185檢測試劑盒的制備

1)常規(guī)器材及試劑的準(zhǔn)備：

96孔酶標(biāo)板、P185陽性血清、P185陰性血清、洗滌液、終止液、辣根過氧化物酶-鏈親和素以及顯色液A、顯色液B，其中P185陽性血清和P185陰性血清的符合率達(dá)100％。

2)腫瘤蛋白P185單克隆抗體的制備：

a)收集NIH/3T3細(xì)胞i.p免疫第一批6～8周的Balb/C雌鼠，NIH/3T3細(xì)胞的每次使用劑量為107/只，每隔兩周一次，三次后從雌鼠尾部取血，用ELISA法測血清滴度，將滴度最高的雌鼠再用同量的NIH/3T3細(xì)胞進(jìn)行i.p免疫，七天后從該雌鼠的眼窩取血，即得雌鼠的抗NIH/3T3血清；

b)收集長至匯合的T6-17細(xì)胞，采用PBS緩沖液(即磷酸鹽緩沖液)洗三次，所述的T6-17細(xì)胞為轉(zhuǎn)染Her-2/neu癌基因的NIH/3T3細(xì)胞，其膜表面高表達(dá)腫瘤蛋白P185，將上述制備的抗NIH/3T3血清用PBS緩沖液以1:50的比例稀釋，然后取2ml加入T6-17細(xì)胞中，在4℃條件下溫育過夜，期間晃動盛放T6-17細(xì)胞的試管9次以使細(xì)胞懸浮，然后再用PBS緩沖液洗三次，得到懸浮于PBS緩沖液中的T6-17細(xì)胞；

c)用上述懸浮于PBS緩沖液中的T6-17細(xì)胞i.p免疫第二批6-8周的BaLb/C雌鼠，劑量為107/小只，在第1周、第3周和第6周各一次，第7周從雌鼠的尾部取血，用ELISA法測血清滴度，將滴度最高的雌鼠再用同量的T6-17細(xì)胞i.p免疫，三天后取該雌鼠的脾細(xì)胞制成細(xì)胞懸液；d)將步驟c得到的細(xì)胞懸液與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0混合，并在融合劑PEG的作用下進(jìn)行細(xì)胞融合，所述的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供；

e)用ELISA法從上述融合的細(xì)胞中篩選出分泌腫瘤蛋白P185單克隆抗體的雜 交瘤細(xì)胞，采用有限稀釋法對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化，從而得到兩株具有穩(wěn)定分泌腫瘤蛋白P185單克隆抗體能力的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為雜交瘤細(xì)胞株2D11和雜交瘤細(xì)胞株3F9，

f)將雜交瘤細(xì)胞株2D11和3F9分別注入不同的雌鼠體內(nèi)，收集腹水，采用ProteanA親和層析法將腹水中的抗體純化即得腫瘤蛋白P185單克隆抗體2D11和3F9，純化抗體的方法也可以采用聚乙二醇沉淀法等常規(guī)的方法，腫瘤蛋白P185單克隆抗體2D11和3F9純化前后的SDS-PAGE分析結(jié)果，其中第1泳道為腫瘤蛋白P185單克隆抗體純化前的SDS-PAGE分析結(jié)果，第2泳道為腫瘤蛋白P185單克隆抗體純化后的SDS-PAGE分析結(jié)果，可以看出純化后的腫瘤蛋白P185單克隆抗體2D11和3F9僅存一條帶，說明腫瘤蛋白P185單克隆抗體2D11和3F9已被純化。腫瘤蛋白單克隆抗體2D11識別抗原的SDS-PAGE及Westernblot分析結(jié)果，其中第1泳道為T6-17細(xì)胞的培養(yǎng)上清中腫瘤蛋白P185的SDS-PAGE分析結(jié)果，其顯示僅存一條帶，說明T6-17細(xì)胞的膜表面高表達(dá)P185，第2泳道為本發(fā)明制備的腫瘤蛋白P185單克隆抗體2D11與T6-17細(xì)胞的培養(yǎng)上清中腫瘤蛋白P185的WEST-BLOT分析結(jié)果，其顯示也僅有一條帶，說明兩者有明顯的特異性反應(yīng)。

3)包被96孔酶標(biāo)板：采用直接吸附法，用pH為9.6的PBS緩沖液將上述制備的腫瘤蛋白P185單克隆抗體2D11稀釋至20～100μg/ml，按100μl/孔的加入量加于96孔酶標(biāo)板中，在溫度為2～8℃的條件下放置過夜，然后用洗滌液洗滌，甩干，即得包被有腫瘤蛋白P185單克隆抗體2D11的96孔酶標(biāo)板。

4)生物素化腫瘤蛋白P185單克隆抗體3F9：

將上述制備的腫瘤蛋白P185單克隆抗體3F9與活化的生物素混合進(jìn)行標(biāo)記，透析去除未結(jié)合的生物素，即得生物素標(biāo)記的腫瘤蛋白P185單克隆抗體3F9。2、腫瘤蛋白P185檢測試劑盒的使用步驟如下：

1)加樣：

在包被有腫瘤蛋白P185單克隆抗體2D11的96孔酶標(biāo)板上劃分陽性對照孔、陰性對照孔、待測樣品孔和空白孔共四組檢測孔，陽性對照孔中加入P185陽性血清，陰性對照孔中加入P185陰性血清，待測樣品孔中加入待測血清，三種樣品的加入量均為100μl/孔，然后在酶標(biāo)板上加蓋或者覆膜，在37℃條件下放置 2h后棄去液體，用洗滌液洗滌，甩干；

2)加生物素標(biāo)記的腫瘤蛋白P185單克隆抗體3F9：

每個(gè)檢測孔中加入100μl生物素標(biāo)記的腫瘤蛋白P185單克隆抗體3F9，在37℃條件下放置1h后棄去液體，每個(gè)檢測孔中加入350μl洗滌液浸泡1～2min，甩干或輕輕地拍干，洗滌、甩干的動作重復(fù)3次；

1、加辣根過氧化物酶-鏈親和素：

每個(gè)檢測孔中加入100μl的辣根過氧化物酶-鏈親和素，在37℃條件下放置1h后棄去液體，每個(gè)檢測孔中加入350μl洗滌液浸泡1～2min，甩干或輕輕地拍干，洗滌、甩干的動作重復(fù)5次；

3)加顯色底物：

在每個(gè)檢測孔中依次加入顯色液A、顯色液B各一滴，在37℃條件下避光，顯色；

2、加終止液：按照上述顯色底物的加入順序依次在每個(gè)檢測孔中加入50μl終止液，終止反應(yīng)，終止反應(yīng)的表現(xiàn)為檢測孔中的液體由藍(lán)色快速轉(zhuǎn)變成黃色；

3、結(jié)果檢測：

在加入終止液后15min內(nèi)，用酶聯(lián)儀在450nm的波長條件下檢測每個(gè)檢測孔的光密度OD值，檢測試劑盒的檢測標(biāo)準(zhǔn)為：待測血清的OD值是P185陰性血清的OD值的2.1倍以上時(shí)，檢測樣判為陽性，否則檢測樣判為陰性。經(jīng)檢測，本發(fā)明制備的包被96孔酶標(biāo)板的變異系數(shù)CV值小于10％，對同一批次及不同批次的檢測試劑盒進(jìn)行試驗(yàn)測試，測試結(jié)果顯示批內(nèi)及批間的試劑盒的CV值均小于15％，說明本發(fā)明的腫瘤蛋白P185檢測試劑盒具有高精密性。

3、本發(fā)明制備的雜交瘤細(xì)胞株2D11、3F9的特性的檢定結(jié)果：

1)分泌抗體的穩(wěn)定性：經(jīng)檢測，制備得到的雜交瘤細(xì)胞株連續(xù)克隆后分泌的單克隆抗體陽性率達(dá)100％，在體外傳代3個(gè)月以上得到的雜交瘤細(xì)胞株仍能保持穩(wěn)定的分泌抗體。

2)細(xì)胞核學(xué)特征：經(jīng)檢測，上述制備的雜交瘤細(xì)胞的核型符合人體的腫瘤細(xì)胞分裂中期的染色體核型。

3)支原體檢測：采用常規(guī)的DNA熒光染色法對雜交瘤細(xì)胞株2D11、3F9的 支原體進(jìn)行檢測，具體將vero細(xì)胞接種到置于小培養(yǎng)皿中的蓋玻片上，在37℃的培養(yǎng)箱中靜置24h，采集貼壁或半貼壁的雜交瘤細(xì)胞，用無抗生素的培養(yǎng)液傳代，3～4天后，雜交瘤細(xì)胞呈連續(xù)單層生長，長至60％左右匯合，取100μl培養(yǎng)液滴入上述vero細(xì)胞的小培養(yǎng)皿中，在37℃條件下培養(yǎng)，3～4天后，用D-hanks平衡鹽溶液洗滌小培養(yǎng)皿中的蓋玻片，再用固定液固定兩次，兩次固定時(shí)間分別為5min、10min，之后將蓋玻片置于小染色缸中，用Hoechst33258染液染色30min，干燥，用封片液封片，最后在熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞核外無細(xì)小熒光亮點(diǎn)，表明本發(fā)明制備的雜交瘤細(xì)胞株2D11、3F9均為支原體陰性。4、使用本發(fā)明的腫瘤蛋白P185檢測試劑盒的臨床實(shí)驗(yàn)報(bào)告：對122例乳腺癌、120例胃癌腫瘤患者及110例正常獻(xiàn)血員的腫瘤蛋白P185進(jìn)行檢測，同時(shí)，將陽性腫瘤患者的腫瘤組織進(jìn)行石蠟包埋，免疫組化，然后對陽性腫瘤患者免疫組化的腫瘤組織中的腫瘤蛋白P185進(jìn)行檢測，經(jīng)t檢驗(yàn)，乳腺癌患者組和胃癌患者組的血清中的腫瘤蛋白P185水平均與正常對照組(即獻(xiàn)血員組)的血清中的腫瘤蛋白P185水平有顯著差異(P<0.05)；

經(jīng)χ2檢驗(yàn)，乳腺癌患者組的血清中腫瘤蛋白P185水平與其腫瘤組織中腫瘤蛋白p185水平高度相關(guān)，胃癌患者組的血清中腫瘤蛋白P185水平與與其腫瘤組織中腫瘤蛋白p185水平高度相關(guān)(P<0.01)。

為進(jìn)一步驗(yàn)證患者血清中腫瘤蛋白P185水平與與其腫瘤組織中腫瘤蛋白p185水平高度相關(guān)，本發(fā)明對四個(gè)患者的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)法染色分析，采用的是0-3+評分系統(tǒng)，評分標(biāo)準(zhǔn)是0分，1+分，2+分，3+分，其中0分結(jié)果顯示為陰性，1+、2+和3+分結(jié)果顯示為陽性，將這四個(gè)患者的血清用本發(fā)明的檢測試劑盒進(jìn)行腫瘤蛋白P185檢測，結(jié)果顯示，0分腫瘤標(biāo)本來源的血清OD450為0.296ng/ml(即測波長為450nm條件下樣本顯色的OD值)，1+分腫瘤標(biāo)本來源的血清OD450為0.71ng/ml，2+分腫瘤標(biāo)本來源的血清OD450為1.0ng/m，3+分腫瘤標(biāo)本來源的血清OD450為2.0ng/ml，說明患者血清中的腫瘤蛋白p185水平與其免疫組化組織中的腫瘤蛋白p185水平高度相關(guān)。5、本發(fā)明的腫瘤蛋白P185檢測試劑盒的穩(wěn)定性性檢測：

1)將各試劑在37℃條件下放置3天；

2)在96孔酶標(biāo)板上劃分10個(gè)陽性對照孔和10個(gè)陰性對照孔，陽性對照孔中 加入P185陽性血清，陰性對照孔中加入P185陰性血清，樣品的加入量均為100μl/孔，然后在酶標(biāo)板上加蓋，在37℃條件下放置1h后棄去液體，用洗滌液洗滌3次，甩干；

3)向每個(gè)對照孔加入100μl生物素標(biāo)記的腫瘤蛋白P185單克隆抗體3F9，在37℃條件下放置1h后棄去液體，每個(gè)檢測孔中加入350μl洗滌液浸泡1～2min，甩干或輕輕地拍干，洗滌、甩干的動作重復(fù)3次，每次3分鐘；

4)每個(gè)對照孔中加入100μl的辣根過氧化物酶-鏈親和素，在37℃條件下放置1h后棄去液體，每個(gè)檢測孔中加入350μl洗滌液浸泡1～2min，甩干或輕輕地拍干，洗滌、甩干的動作重復(fù)3次，每次3分鐘；

5)在每個(gè)對照孔中依次加入顯色液A、顯色液B各一滴，在37℃條件下避光，顯色；

6)按照上述顯色液的加入順序依次在每個(gè)對照孔中加入50μl終止液，終止反應(yīng)；

7)在加入終止液后15min內(nèi)，用酶聯(lián)儀在450nm的波長條件下檢測每個(gè)對照孔的光密度OD值，經(jīng)檢測，P185陽性血清的OD值是P185陰性血清的2.1以上，10個(gè)陽性對照孔中的P185陽性血清以及10個(gè)陽性對照孔中的P185陽性血清的符合率均達(dá)100％，說明本發(fā)明的腫瘤蛋白P185檢測試劑盒具備高穩(wěn)定性。

以上所述的具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式而已，并不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。