本發(fā)明涉及食品檢驗技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種嬰幼兒配方奶粉中L-肉堿的快速定量檢驗方法。

背景技術(shù)：

L-肉堿（L-Carnitine），化學名為3-羧基-4-N-三甲基-氨基丁酸（3-Hydroxy-4-N-trimethyla minobutyrate）,是一種在人體中廣泛存在的類氨基酸，主要分布在肌肉、心臟中，其主要功能是轉(zhuǎn)運脂肪進入線粒體，促進脂肪酸燃燒，為機體提供能量^[1-3]，人不僅可通過食物獲取L-肉堿，且在體內(nèi)可自行合成^[4]，但嬰幼兒自身合成能力較低，因此必須在嬰幼兒食品中補充。

國標GB10765-2010《食品安全國家標準嬰兒配方食品》規(guī)定：L-肉堿為可選擇性加入成分，規(guī)定最小添加量為0.3mg/100KJ^[5]。目前關(guān)于嬰幼兒配方奶粉中L-肉堿的檢測，國標為GB29989-2013^[6]，分光光度計法，但由于顯色液配置復雜；乙酰輔酶A和乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶不穩(wěn)定，往往使檢測結(jié)果重復性差，且檢出限較高（0.6mg/100g）。文獻報道的L-肉堿檢測方法主要有酶顯色法^[7-9]、離子色譜法^[10-11]、高效液相色譜法^[12-14]等。相關(guān)參考文獻信息如下：

[1] McCarry JD, Brown NF. The mitochondrial carnitine palmitoyl transferase system from concept to molecular analysis[J].Eu J Biochem,1997,244:1-14.

[2] Vaz F M,Wanders R J. Carnitine biosynthesis in mammals[J]. Biochemistry Journal,361,361(1):417-429.

[3] Lahjouji K, Mitchell G A, Qureshi I A. Carnitinetransport by organic cation transporters and systemic carnitinedeficiency[J]. Molecular Genetics and Metabolism,2001,73(4)287-297.

[4] Goudriaan J R,Den Boer M A,Rensen P C,et al.CD 36 deficiencyin mice impairs lipoprotein lipase-mediated triglyceride clearance [J].Journal of Lipid Research,2005,46(6) 2175-2181.

[5] GB10765-2010食品安全國家標準 嬰兒配方食品[S].

[6] GB29989-2013食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中左旋肉堿的測定[S].

[7] Jean Demarquoy，Beatrice Georges，CarolineＲigault ,et al. Radioisotopic determination of L-carnitine content infoods commonly eaten in Western countries[J]．Food Chemistry.2004，86(1):137-142．

[8] Knuttel-GustavsenSeline. The determination of L-carnitine in several food samples[J]．Food Chemistry，2007，105(2):793-804．

[9]王天西，熊文明，林夢勇.分光光度法測定乳粉中左旋肉堿含量[J]．福建分析測試，2012，21(1):52-56．

[10] AikateriniKakou，Nikolaos C.Megoulas，Michael A. Koupparis. Determination of L-carnitine in food supplement formulations using ion-pair chromatography with indirect conductimetric detection［J］．Journal of Chromatography A，2005，1 069(2):209-215．

[11]鄒曉莉，周艷陽，喬蓉，黎源倩，李巖.高效陰離子色譜法快速分析保健食品中的左旋肉堿［J］．衛(wèi)生研究.2011，40(3):358-364．

[12] 祝偉霞，楊冀州，劉亞風，等。保健品中左旋肉堿的反相高效液相色譜法測定[J]。分析測試學報，2008(10):1124-1127．

[13] 趙榕，孫開奇，羅仁才。離子對反相高效液相色譜法測定保健食品中肉堿[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2002,14(4):25-26．

[14] 甘賓賓，黎少豪.HPLC法測定保健食品中左旋肉堿含量的研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010(7):1688-1689。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜快速定量測定嬰幼兒配方奶粉中L-肉堿的方法，不僅操作步驟簡單，避免了復雜步驟造成的目標物的損失，同時具有分析速度快，靈敏度高，重復性好的突出特點。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。

利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜快速定量測定嬰幼兒配方奶粉中L-肉堿的方法，包含如下主要步驟：

A、液相色譜-質(zhì)譜分析前處理操作：取待測樣品首先溶解在濃鹽酸中，然后進行超聲提取，堿中和后過濾取濾液備用，與此同時利用L-肉堿標準品配制標準液；

B、液相色譜-質(zhì)譜分析上機測定：步驟A所得的樣品溶液及標準液分別上機進行液相色譜-質(zhì)譜分析測定，分析比對得出嬰幼兒配方奶粉中L-肉堿的定量含量。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，該方法包含如下主要步驟：

A、液相色譜-質(zhì)譜分析前處理操作：對待測樣品進行系列處理制備待測溶液，同時利用標準品配制標準液：

A-1、樣品前處理：準確稱取1.00g混合均勻的待測嬰幼兒配方奶粉樣品置入三角瓶中，加入含有0.5-2mmol鹽酸的溶液，超聲提取10-30min，然后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至4-5，定容后過濾，濾液備用；

A-2、標準液的配制：稱取L-肉堿純品逐級稀釋得到濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL 的標準工作液；

B、液相色譜-質(zhì)譜分析上機測定：將步驟A所得的樣品溶液及標準工作液分別上機進行液相色譜-質(zhì)譜分析測定，制作標準曲線并對樣品溶液的測定數(shù)據(jù)進行比對，得出嬰幼兒配方奶粉中L-肉堿的定量含量；其中：

B-1、色譜條件設(shè)定為：色譜柱為CORTECS HILIC，規(guī)格3.0mm×100mm，2.7μm，柱溫20-30℃，進樣量1.5-2.5μL，流速0.2-0.4ml/min，采用甲醇-0.1%（v/v）甲酸為流動相；

B-2、質(zhì)譜條件設(shè)定為：離子源為電噴霧ESI離子源，正離子掃描模式，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測MRM，毛細管電壓為3-5KV，霧化氣和碰撞氣為高純氮，干燥氣流速為5-20L/min，干燥氣溫度為200℃以上。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，該方法包含如下主要步驟：

A、液相色譜-質(zhì)譜分析前處理操作：對待測樣品進行系列處理制備待測溶液，同時利用標準品配制標準液：

A-1、樣品前處理：準確稱取1.00g（精確到0.1mg）混合均勻的待測嬰幼兒配方奶粉樣品于100mL三角瓶中，加入10mL 0.1mol/L鹽酸和30mL水，超聲提取15min，然后用4%氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至4.5，定容至100mL，過濾，濾液過0.22μm濾膜，備用；

A-2、標準儲備液的配制：稱取L-肉堿1.00000g于100mL容量瓶中，超純水溶解定容、混勻，得到濃度為10mg/mL的標準儲備液；

A-3、標準工作液的配制：取奶粉空白試樣，按照步驟A-1的方法進行前處理，以得到的濾液作為溶劑配置系列標準工作液，將L-肉堿標準儲備液逐級稀釋得到濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL 的標準工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配；

B、液相色譜-質(zhì)譜分析上機測定：將步驟A所得的樣品溶液及標準工作液分別上機進行液相色譜-質(zhì)譜分析測定，制作標準曲線并對樣品溶液的測定數(shù)據(jù)進行比對，得出嬰幼兒配方奶粉中L-肉堿的定量含量；其中：

B-1、色譜條件設(shè)定為：色譜柱為CORTECS HILIC，規(guī)格3.0mm×100mm，2.7μm，柱溫25℃，進樣量2μL，流速0.3ml/min，以甲醇-0.1%（v/v）甲酸、體積比20:80為流動相；

B-2、質(zhì)譜條件設(shè)定為：離子源為電噴霧ESI離子源，正離子掃描模式，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測MRM，毛細管電壓為4KV，霧化氣和碰撞氣為高純氮，干燥氣流速為10L/min，干燥氣溫度為350℃。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步A-1中超聲提取作業(yè)的具體參數(shù)為：工作頻率40KHz，功率250W。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟B-2中，質(zhì)譜分析的參數(shù)如下表所示：

*為定量離子。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，待測樣品采用嬰幼兒配方奶粉質(zhì)控樣品，左旋肉堿標準品采用純度>98%的產(chǎn)品，濃鹽酸為分析純，氫氧化鈉為分析純，冰乙酸為優(yōu)級純，甲酸為色譜純，乙腈和甲醇均為色譜純，超純水為實驗用超純水。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，測定設(shè)備采用配有電噴霧離子源的Agilent 1290 LC/6420 MS 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，采用KQ3200 DB型數(shù)控超聲波清洗器，酸堿測定采用PB-10 pH計，稱量操作采用AL 204-IC電子天平和XS 2050U電子分析天平。

采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于：本發(fā)明的檢驗方法不僅操作步驟簡單，避免了復雜步驟造成的目標物的損失，同時具有分析速度快，靈敏度高，重復性好的突出特點。本發(fā)明中待測樣品在5min內(nèi)完成分析，L-肉堿在10～1000.0ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9993），方法的低、中、高三個水平的加標回收率為82.43%～96.91%，相對標準偏差在1.46%～5.65%，檢出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分別為0.1μg/kg，1.0μg/kg。本發(fā)明的技術(shù)方案不僅適用于實驗室檢測、企業(yè)大批量質(zhì)控檢測，由于其快速準確的特點，極有可能發(fā)展為嬰配奶粉相關(guān)檢測的行業(yè)標準乃至國家標準，具有重要的意義和價值。本發(fā)明有益效果的具體試驗數(shù)據(jù)參見下文的實施例。

附圖說明

圖1顯示實施例1中不同超聲提取時間所得到L-肉堿含量。

圖2是實施例4中HILIC柱對L-肉堿的多反應(yīng)檢測色譜圖。

圖3是實施例5中L-肉堿的ESI/MS/MS質(zhì)譜圖。

具體實施方式

以下實施例詳細說明了本發(fā)明。本發(fā)明所使用的各種原料及各項設(shè)備均為常規(guī)市售產(chǎn)品，均能夠通過市場購買直接獲得。

本發(fā)明采用的材料、試劑及儀器設(shè)備介紹如下。材料：嬰配奶粉，質(zhì)控樣品。試劑：左旋肉堿標準品：CAS 541-15-1，純度>98%（sigma公司）；濃鹽酸為分析純（利安隆博華天津醫(yī)藥化學有限公司）；氫氧化鈉為分析純（天津市德恩化學試劑有限公司）；冰乙酸為優(yōu)級純（天津市光復科技發(fā)展有限公司）；甲酸為色譜純（Dikma公司）；乙腈和甲醇均為色譜純（Fisher chemical公司）；實驗用超純水（由Millipore Milli-Q系統(tǒng)凈化蒸餾水獲得）。儀器設(shè)備：Agilent 1290 LC/6420 MS 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源，美國安捷倫公司）；KQ3200 DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；PB-10 pH計（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；AL 204-IC電子天平、XS 2050U電子分析天平（特勒-托利多儀器上海有限公司）。

實施例1、樣品前處理操作中對超聲時間的優(yōu)化探究

對于奶粉中L-肉堿的檢測，既要保證樣品的均一性，又要減少樣品基質(zhì)中常量目標化合物對儀器的污染。本發(fā)明的研究從原始固體樣品中取出部分代表性樣品，充分混合，用四分法縮分，再準確稱取樣品，加入鹽酸溶液進行超聲提取。其中對超聲時間的優(yōu)化探究如下。

分別稱取同一份樣品五份，加入鹽酸溶液后，分別超聲5min、10min、15min、20min、25min，然后檢測，最終提取結(jié)果參見附圖1，可見超聲提取時間不同提取效果不同，但15min左右達到綜合最優(yōu)化，因此本發(fā)明組最終選擇超聲提取15min。

實施例2、樣品前處理操作中對最終pH優(yōu)化探究

用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH梯度，3.5，3.8，4.0，4.5，5.0，7.0，并分別上機檢測L-肉堿含量，只有在pH為4.5時，蛋白沉淀完全，濾液澄清，且在LC/MS/MS中色譜峰形最佳，因此樣品前處理操作中對將最終pH確定為4.5。

實施例3、樣品前處理操作中對樣品稀釋倍數(shù)的優(yōu)化探究

由于LC/MS/MS儀器靈敏度高，必須使樣品進行一定倍數(shù)的稀釋才能使處理液中L-肉堿含量在儀器的最佳線性范圍內(nèi)。且稀釋還可以使樣品基質(zhì)的抑制減小，使儀器的信噪比降低，提高靈敏度。經(jīng)過試驗最終選擇在處理液定容100ml之后，此時還必須過0.22μm濾膜才能達到較好的測定效果；所得濾液再用超純水稀釋5倍為最優(yōu)。

實施例4、色譜條件的優(yōu)化探究

L-肉堿是一種小分子強極性化合物，沒有特殊的紫外吸收，先前的研究都是通過衍生化反正來減少L-肉堿的極性，使其帶有生色團的同時更適合于在反相條件的保留，本實驗不需衍生，分別對比了C18柱、C4柱和HILIC柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)C18柱、C4柱基本在死時間出峰，且拖尾現(xiàn)象嚴重，而HILIC柱保留時間適中，峰形很好，見附圖2，適合定量分析。

實施例5、質(zhì)譜條件的優(yōu)化探究

L-肉堿分子結(jié)構(gòu)中含有季銨堿性集團，適合用電噴霧離子源，正離子檢測方式，L-肉堿的準分子離子[M+H]⁺質(zhì)核比m/z為162.2，選擇其作為母離子并進行下一步碰撞誘導解離，對碰撞能量、碎裂電壓、干燥氣流速、溫度進行優(yōu)化。二級質(zhì)譜顯示信號最強烈的碎片離子質(zhì)核比m/z為103.1,85.2和60.3。由附圖3可知，信號最高為m/z103.1碎片離子可作為定量離子，其次是m/z60.3作為定性離子，最終質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。在檢測過程中，采用切換法，將L-肉堿出峰前和出峰后的色譜柱流出液導入廢液通道，避免因離子源污染而導致信號抑制，信噪比減小，提高了儀器的準確度和靈敏度。

實施例6、對本發(fā)明測定方法的方法學驗證

1、線性范圍和檢出限

用超純水配置L-肉堿濃度系列標準溶液進行LC/MS/MS測定，以各組分響應(yīng)值（Y）和相對應(yīng)的質(zhì)量濃度（X）作標準曲線。實驗表明，L-肉堿在10～1000ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.9993。可以滿足定量分析的需要，結(jié)果計算采用外標法定量。

取儲備液逐級稀釋，進樣量2μL。以信噪比S/N=3計算L-肉堿的檢出限（LOD）和S/N=10計算定量限（LOQ）分別為0.1μg/kg，1μg/kg，能夠滿足實際樣品分析對檢測限的要求。

2、回收率和精密度

分別取嬰配基質(zhì)奶粉樣品兩個和購買的質(zhì)控樣品兩個，按本方法測定其中的L-肉堿本底含量。另向奶粉樣品中分別加入8.0、16.0、32.0mg/100g的標準品，質(zhì)控樣品中分別加入5.0、10.0、20.0mg/100g的標準品，每個樣品平行測定5次，計算其加標回收率和相對標準偏差，結(jié)果見表2。由表2可知，質(zhì)控樣品檢測結(jié)果，與真值9.9mg/100g滿足誤差范圍。L-肉堿的加標回收率為82.43%～96.91%，相對標準偏差在1.46%～5.65%。方法顯示了較好的回收率及重復性，能夠滿足實際樣品的分析要求。

表2 L-肉堿的回收率和精密度（n=5）

Tab.2 Recovery and precision of L-carnitine（n=5）

3、方法重現(xiàn)性

通過同一儀器、同一實驗員、同一天對同一質(zhì)控樣品按本方法進行連續(xù)檢測3d，每天重復測定（n=5），考察方法的重現(xiàn)性，結(jié)果方法的日內(nèi)精密度為2.6%，日間精密度為5.7%，表明方法重現(xiàn)性良好。

綜上所述，本發(fā)明的方法基于酸水解超聲提取的高效快速，高效液相色譜-質(zhì)譜法的高分離能力和高靈敏度，通過對樣品前處理和液相色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化，建立了一種適用于嬰幼兒奶粉復雜基質(zhì)的L-肉堿的快速檢測技術(shù)。本方法采用CORTECS HILIC色譜柱進行分離，以甲醇-0.1%甲酸為流動相，流速0.3ml/min，在優(yōu)化條件下，樣品在5min內(nèi)完成分析，分析速度快，L-肉堿在10～1000.0ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限低。該方法操作簡便、靈敏度高、重復性好，可用于大量嬰幼兒配方奶粉樣品中的L-肉堿的快速測定。

上述描述僅作為本發(fā)明可實施的技術(shù)方案提出，不作為對其技術(shù)方案本身的單一限制條件。