本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種測定血漿中8-表黃獨(dú)素E乙酸酯濃度的方法。

背景技術(shù)：

8-表黃獨(dú)素E乙酸酯(8-epidiosbulbin E acetate)是從薯蕷科薯蕷屬多年生草本植物黃獨(dú)(Dioscorea bulbifera L.)的干燥塊莖中分離得到的呋喃正二萜類新化合物。體外實(shí)驗(yàn)證明8-表黃獨(dú)素E乙酸酯具有顯著的抗腫瘤、抗真菌、抗炎等生物活性，是一種具有良好開發(fā)前景的新藥源化合物。其結(jié)構(gòu)式如下：

目前尚未關(guān)于8-表黃獨(dú)素E乙酸酯體內(nèi)測定方法的文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明建立了8-表黃獨(dú)素E乙酸酯在大鼠體內(nèi)的測定方法，通過該方法對(duì)8-表黃獨(dú)素E乙酸酯的藥物代謝情況進(jìn)行探索性研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是建立一種準(zhǔn)確高效測定血漿中8-表黃獨(dú)素E乙酸酯濃度的方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種測定血漿中8-表黃獨(dú)素E乙酸酯濃度的方法，血漿樣品經(jīng)預(yù)處理后經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)檢測其濃度，具體方法包括如下步驟：

(1)血漿樣品預(yù)處理：取血漿樣品，加入內(nèi)標(biāo)替硝唑甲醇溶液，加入甲醇或乙腈進(jìn)行蛋白沉淀，離心后取上清液；

(2)將步驟(1)預(yù)處理后的血漿樣品進(jìn)行液相色譜分離：色譜條件中色譜柱為Phenomenex Gemini C18柱；流動(dòng)相：體積比為70∶30的甲醇與0.1％甲酸水溶液；流速：0.2-0.5mL·min^-1；柱溫：30-40℃；進(jìn)樣量5μL；洗脫方式為等度洗脫；

(3)質(zhì)譜測定，條件為：離子源：電噴霧離子化電離源ESI；離子檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM；離子極性：正離子；毛細(xì)管電壓：4000V；干燥氣溫度：400℃；脫溶劑氣和錐孔氣均為高純氮?dú)?；檢測對(duì)象的離子通道：8-表黃獨(dú)素E乙酸酯，[M-Na]+，m/z 411.1→351.0，Dwell 100，F(xiàn)ragmentor 150，Collision Energy 25；內(nèi)標(biāo)替硝唑，[M-H]+，m/z 248.2→121.0，Dwell 100，F(xiàn)ragmentor 110，Collision Energy 10；

(4)計(jì)算：采用內(nèi)標(biāo)法，以8-表黃獨(dú)素E乙酸酯和內(nèi)標(biāo)替硝唑的峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算8-表黃獨(dú)素E乙酸酯的濃度。

步驟(1)中，取血漿樣品50μL，加入內(nèi)標(biāo)800ng·mL^-1替硝唑甲醇溶液10μL和190μL甲醇或乙腈，振蕩3min，12000rpm離心10min，離心后取上清液。

步驟(2)中，色譜柱長度為100mm，內(nèi)徑為2.0mm，填料粒徑為3μm。

其中，所述的血漿為給予了含8-表黃獨(dú)素E乙酸酯藥物的血漿。

其中，所述血漿為人或動(dòng)物的血漿。

其中，所述血漿為大鼠血漿。

有益效果：本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)勢：

(1)預(yù)處理方法簡便：一步有機(jī)溶媒蛋白沉淀法，適用于常規(guī)測定。

(2)專屬性強(qiáng)：采用Phenomenex Gemini C18色譜柱作為固定相，甲醇和水的混合液作為流動(dòng)相，等度洗脫，8-表黃獨(dú)素E乙酸酯保留時(shí)間為1.5min左右，內(nèi)標(biāo)替硝唑保留時(shí)間為1.3min左右，2min完成測定，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾二者的測定。

(3)靈敏度高：血漿最低定量限為1ng·mL^-1。

(4)本發(fā)明方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、操作簡便，為8-表黃獨(dú)素E乙酸酯的血藥濃度測定提供依據(jù)，具有新藥開發(fā)的前景。本方法的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為1～1000ng·mL^-1，日內(nèi)和日間精密度RSD均小于8.4％。

附圖說明

圖1為甲醇加入8-表黃獨(dú)素E乙酸酯和內(nèi)標(biāo)對(duì)照品的質(zhì)譜圖。

圖2為大鼠空白血漿的質(zhì)譜圖。

圖3為大鼠空白血漿加入8-表黃獨(dú)素E乙酸酯和內(nèi)標(biāo)對(duì)照品的質(zhì)譜圖。

圖4為大鼠給予8-表黃獨(dú)素E乙酸酯后血漿樣品再加入內(nèi)標(biāo)對(duì)照品的的質(zhì)譜圖。

注：圖1～圖4中離子通道1為8-表黃獨(dú)素E乙酸酯，[M-Na]+，m/z 411.1→351.0，保留時(shí)間為1.5min左右；離子選擇通道2為內(nèi)標(biāo)替硝唑，[M-H]+，m/z 248.2→121.0，保留時(shí)間為1.3min左右。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

實(shí)施例：大鼠血漿中8-表黃獨(dú)素E乙酸酯濃度的測定

一、實(shí)驗(yàn)材料與儀器

8-表黃獨(dú)素E乙酸酯：分離自黃獨(dú)的干燥塊莖；替硝唑(內(nèi)標(biāo))：購于中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100336-200703；試驗(yàn)用水：超純水；甲醇：色譜純(Merck Company)。

Agilent G6430LC-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Agilent公司，所配高效液相儀為Agilent 1290)；MassHunter數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(version B.05.00)；WH-2微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)；AE240電子天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；Millipore Drict-Q5純水機(jī)(法國Millipore公司)；Biofuge PrimoR冷凍高速離心機(jī)(德國Heraeus公司)。

二、液質(zhì)條件

1.液相色譜條件

色譜柱：Phenomenex Gemini C18柱(dp 3μm，100mm ID×2.0mm)；流動(dòng)相：甲醇-0.1％甲酸水溶液(70∶30，v/v)；流速：0.2mL·min^-1；柱溫：35℃。

2.質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子化電離源ESI；離子檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM；離子極性：正離子；毛細(xì)管電壓：4000V；干燥氣溫度：400℃；脫溶劑氣和錐孔氣均為高純氮?dú)猓粰z測對(duì)象的離子通道：8-表黃獨(dú)素E乙酸酯，[M-Na]+，m/z 411.1→351.0，Dwell 100，F(xiàn)ragmentor 150，Collision Energy 25；內(nèi)標(biāo)替硝唑，[M-H]+，m/z 248.2→121.0，Dwell 100，F(xiàn)ragmentor 110，Collision Energy 10。

三、實(shí)驗(yàn)過程：

1.8-表黃獨(dú)素E乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：

精密稱取8-表黃獨(dú)素E乙酸酯10.14mg，置于10mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得1.014mg·mL^-18-表黃獨(dú)素E乙酸酯的儲(chǔ)備液。精密量取適量儲(chǔ)備液以甲醇依次稀釋，配成濃度分別為5、25、50、100、250、500、1000、2500、5000ng·mL^-1的8-表黃獨(dú)素E乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.大鼠血漿樣品的采集與處理：

大鼠尾靜脈注射8-表黃獨(dú)素E乙酸酯溶液，給藥量為1mg·kg^-1，于注射前及注射后5、10、20、30、45min、1、2、2.5、3、4h眼眶采血200μL，注入肝素管內(nèi)，3000rpm離心10min，制備血漿。取大鼠血漿50μL，加入800ng·mL^-1內(nèi)標(biāo)替硝唑甲醇溶液10μL，甲醇190μL，振蕩3min進(jìn)行蛋白沉淀，12000rpm離心10min，上清液5μL進(jìn)樣分析。

3.專屬性：

取沒有給予過8-表黃獨(dú)素E乙酸酯的大鼠空白血漿50μL，加入200μL甲醇，振蕩3min進(jìn)行蛋白沉淀，12000rpm離心10min，上清液5μL進(jìn)樣分析。

取1.5mL塑料離心管數(shù)支，加入8-表黃獨(dú)素E乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)溶液10μL，40℃氮?dú)獯蹈桑尤霙]有給予過8-表黃獨(dú)素E乙酸酯的大鼠空白血漿50μL，旋渦30s混勻，加入替硝唑甲醇溶液(內(nèi)標(biāo)，800ng·mL^-1)10μL，甲醇190μL，振蕩3min進(jìn)行蛋白沉淀，12000rpm離心10min，上清液5μL進(jìn)樣分析。

結(jié)果顯示，在本實(shí)驗(yàn)所采用的LC-MS/MS條件下，血漿樣品無雜峰對(duì)檢測組分造成干擾，8-表黃獨(dú)素E乙酸酯保留時(shí)間在1.5min左右，內(nèi)標(biāo)替硝唑保留時(shí)間在1.3min左右。8-表黃獨(dú)素E乙酸酯和內(nèi)標(biāo)互不干擾，峰形良好，基線平穩(wěn)。

4.線性試驗(yàn)

大鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線：取1.5mL塑料離心管數(shù)支，分別精密加入不同濃度的8-表黃獨(dú)素E乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)溶液10μL，40℃氮?dú)獯蹈?，加入沒有給予過8-表黃獨(dú)素E乙酸酯的大鼠空白血漿50μL旋渦30s混勻，配成含8-表黃獨(dú)素E乙酸酯的濃度分別為1、5、10、20、50、100、200、500、1000ng·mL^-1的含藥血漿。加入替硝唑甲醇溶液(內(nèi)標(biāo)，800ng·mL^-1)10μL，甲醇190μL，振蕩3min進(jìn)行蛋白沉淀，12000rpm離心10min，上清液5μL進(jìn)樣分析。計(jì)算8-表黃獨(dú)素E乙酸酯和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值f，以峰面積比值f對(duì)血藥濃度C作回歸計(jì)算，得回歸方程：f＝0.0025×C-0.0012(r＝0.997)，W＝1/cc，8-表黃獨(dú)素E乙酸酯血漿濃度在1～1000ng·mL^-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。最低定量限為1ng·mL^-1。

5.準(zhǔn)確度和精密度

按照大鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線方法配制含8-表黃獨(dú)素E乙酸酯濃度為2、50、500ng·mL^-1的低、中、高的含8-表黃獨(dú)素E乙酸酯血漿樣品，按“大鼠血漿樣品的處理”處理方法分別處理。連續(xù)做3天，每天每個(gè)濃度各做5份樣品，計(jì)算8-表黃獨(dú)素E乙酸酯峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f，代入當(dāng)天的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得8-表黃獨(dú)素E乙酸酯實(shí)測濃度，由實(shí)測濃度計(jì)算日內(nèi)、日間精密度和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，實(shí)測濃度與加入濃度的比值即為準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，日內(nèi)和日間精密度RSD均小于8.4％，準(zhǔn)確度符合要求。

6.測定結(jié)果

上述6只給予過8-表黃獨(dú)素E乙酸酯的大鼠血漿中8-表黃獨(dú)素E乙酸酯含量(給藥后30min)分別為35.58、40.27、78.37、48.19、43.38、50.33ng·mL^-1。