本發(fā)明涉及一種四季三黃片的含量測定方法，屬于中藥制劑含量測定技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

口舌生瘡是口腔和舌頭潰爛、出現(xiàn)局部疼痛的口腔病，常反復(fù)發(fā)作，潰瘍久不愈合。古代文獻(xiàn)中，口舌生瘡又稱為口破、口疳、口瘍，發(fā)生在舌的稱舌瘍。口舌生瘡多由心脾積熱、外感熱邪，或脾胃濕熱、陰虛陽亢所致。瘡瘍皆屬于火，但有實(shí)火與虛火的區(qū)別，如因煙酒不節(jié)，或多食肥甘厚味、留滯生熱，或外感風(fēng)熱、濕熱之邪、入里化火，或情志郁結(jié)、久而化火、多屬實(shí)火；素體陰虛，熱病傷陰，或睡眠不足，長期疲勞而致人身體衰弱。

人上火之后臨床癥狀表現(xiàn)為：目赤腫痛，口鼻生瘡，咽喉腫痛，急性胃腸炎，痢疾等，容易在體內(nèi)積累毒素，服用抗菌藥后癥狀減輕，但副作用較大，且易復(fù)發(fā)。本病的主要癥狀是口腔粘膜反復(fù)出現(xiàn)圓形或橢圓形小潰瘍，可單發(fā)或多發(fā)在口腔粘膜的任何部分，有劇烈的自發(fā)痛，一般在10天左右可自愈。發(fā)現(xiàn)本病時(shí)多在潰瘍期，潰瘍直徑2-3毫米，底淺，邊緣整齊，周圍有紅暈，潰瘍面黃白色纖維素性滲出物覆蓋，有劇烈的燒灼樣痛，遇冷、熱、酸、咸等刺激都使疼痛加重，語言、飲食均感困難，持續(xù)4-5天后轉(zhuǎn)入愈合期，愈合不留任何疤痕，但可以反復(fù)發(fā)作。

四季三黃片是中新藥業(yè)天津樂仁堂制藥廠生產(chǎn)的藥品，具有消炎退熱，通便利水的作用。用于口鼻生瘡，咽疼齒痛，口干舌燥，目眩頭暈，大便秘結(jié)，小便赤黃。

四季三黃片由大黃、黃芩、梔子及黃柏四味中藥組成，現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第二十冊，標(biāo)準(zhǔn)編號：WS3-B-3795-98。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)起草時(shí)間較早，無含量測定及鑒別等控制指標(biāo)。因此參照《中國藥典》2010年版一部以及“四季三黃軟膠囊”、“四季三黃膠囊”等同類品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對四季三黃片進(jìn)行薄層鑒別及含量測定方法研究，并對分析方法進(jìn)行驗(yàn)證。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了一種四季三黃片的含量測定方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行：

（1）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-0.1%（w/w）磷酸的體積比79：21為流動相；檢測波長為254nm，理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于12000；

（2）對照品溶液的制備：精密稱取大黃素對照品、大黃酚對照品適量，加甲醇制成每1ml含大黃素16μg、大黃酚16μg的混合溶液，即得；

（3）供試品溶液的制備：取本品適量，研細(xì)，取0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱定重量，加熱回流1小時(shí)，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5ml，置燒瓶中，揮去溶劑，加12%鹽酸溶液10ml，超聲處理2分鐘，再加入三氯甲烷10ml，加熱回流1小時(shí)，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

（4）測定法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，確定四季三黃片中每片含大黃以大黃素（C₁₅H₁₀O₅）和大黃酚（C₁₅H₁₀O₄）總量計(jì)，不得少于0.70mg。

本發(fā)明更加詳細(xì)的方法如下：

前處理方法的確定

1、提取條件的考察

參考《中國藥典》2010年版一部中“大黃”含量測定項(xiàng)下大黃素和大黃酚的提取方法，采用甲醇提取，酸解，再用三氯甲烷提取等步驟進(jìn)行。本試驗(yàn)采用相同的提取方法進(jìn)行。對提取方法、提取時(shí)間、水解酸濃度及酸水解時(shí)間的進(jìn)行了考察，結(jié)果如下：

1.1提取方法的考察

取本品（批號為ZL02）適量，研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱定重量，采用加熱回流與超聲處理兩種提取方式，時(shí)間均為1小時(shí)，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5ml，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10ml，超聲處理2分鐘,再加入三氯甲烷10ml，加熱回流1小時(shí)，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓D(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，測定大黃素、大黃酚總量，結(jié)果見表1。

表1 四季三黃片提取方法考察試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明：甲醇回流處理的提取率較超聲高，故選擇甲醇回流提取方法。

1.2提取時(shí)間的考察：

取本品（批號為ZL02）適量，研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱定重量，分別加熱回流40、60、80分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5ml，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10ml，超聲處理2分鐘,再加入三氯甲烷10ml，加熱回流1小時(shí)，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，測定大黃素、大黃酚總量，結(jié)果見表2。

表2 四季三黃片提取時(shí)間考察試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明：甲醇回流60分鐘即可提取完全，且隨時(shí)間延長，含量反而降低，故選擇甲醇回流60分鐘的提取時(shí)間。

1.3水解酸濃度的考察：

取本品（批號為ZL02）適量，研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱定重量，加熱回流1小時(shí)，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5ml，置燒瓶中，揮去溶劑，分別加4%鹽酸溶液、8%鹽酸溶液、12%鹽酸溶液、16%鹽酸溶液各10ml，超聲處理2分鐘,再加入三氯甲烷10ml，加熱回流1小時(shí)，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，測定大黃素、大黃酚總量，結(jié)果見表3。

表3 四季三黃片水解酸濃度考察試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明：以12%鹽酸溶液水解，大黃素、大黃酚總量較高，故選擇12%鹽酸溶液。

1.4酸水解時(shí)間的考察：

取本品（批號為ZL02）適量，研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱定重量，加熱回流1小時(shí)，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5ml，置燒瓶中，揮去溶劑，加12%鹽酸溶液10ml，超聲處理2分鐘,再加入三氯甲烷10ml，分別加熱回流30、60、90分鐘，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。測定大黃素、大黃酚總量，結(jié)果見表4。

表4 四季三黃片酸水解時(shí)間考察結(jié)果

結(jié)果表明：12%鹽酸溶液水解60分鐘為宜，故選擇60分鐘的酸解時(shí)間。

2、專屬性試驗(yàn)：

取對照品溶液10μl，注入液相色譜儀，照上述色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。

取供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，照上述色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖2。

取陰性樣品溶液10μl，注入液相色譜儀，照上述色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖3。

結(jié)果表明，供試品色譜中與對照品色譜上相同保留時(shí)間有對應(yīng)的色譜峰，峰形良好。以大黃素色譜峰按照公式n=5.54(t_R/W_h/2)²計(jì)算，理論塔板數(shù)為17381。按照公式R=2(t_R2- t_R1)/( W₁+ W₂)計(jì)算，大黃素分離度為6.58，大黃酚的分離度為4.71。陰性樣品色譜中，在相同的保留時(shí)間無色譜峰，說明本方法專屬性良好，陰性無干擾。

3線性試驗(yàn)：

精密稱取大黃素照品適量，精密稱定，配制成3.270μg/ml、8.176μg/ml、16.35μg/ml、40.88μg/ml、81.76μg/ml、204.4μg/ml的對照品溶液。按照擬訂的色譜條件將對照品溶液分別進(jìn)樣10μl，測定峰面積，結(jié)果見表5。

表5 大黃素線性考察結(jié)果

對大黃素峰面積與進(jìn)樣量進(jìn)行線性回歸處理，得回歸方程：

Y=3703.68X+1.645 r=0.9999

以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4.

精密稱取大黃酚對照品適量，精密稱定，配制成3.219μg/ml、8.048μg/ml、16.10μg/ml、40.24μg/ml、80.48μg/ml、201.2μg/ml的對照品溶液。按照擬訂的色譜條件將對照品溶液分別進(jìn)樣10μl，測定峰面積，結(jié)果見表6。

表6 大黃酚線性考察結(jié)果

對大黃酚峰面積與進(jìn)樣量進(jìn)行線性回歸處理，得回歸方程：

Y= 5303.42X+4.308 r=0.9999

以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5。

結(jié)果表明，大黃素在進(jìn)樣量0.03270μg~20.44μg 之間呈良好的線性關(guān)系。大黃酚在進(jìn)樣量0.03219μg~2.012μg之間呈良好的線性關(guān)系。

4、進(jìn)樣重復(fù)性試驗(yàn)：

取本品（批號為ZL02）適量，研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，按供試品溶液制備項(xiàng)下制備。按擬定的測定條件重復(fù)進(jìn)樣6次測定，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表7。

表7 四季三黃片含量測定進(jìn)樣重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，大黃素和大黃酚的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.20%和0.26%，符合要求。

5、重復(fù)性試驗(yàn)：

取本品（批號為ZL02），研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，按供試品溶液制備項(xiàng)下制備，平行6份。按擬定的測定條件進(jìn)樣10μl測定，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表8。

表8 四季三黃片含量測定重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，供試品中大黃素、大黃酚總量的平均含量為4.35mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.17%，符合要求。

6、準(zhǔn)確度試驗(yàn)：

取本品（批號為ZL02，大黃素平均含量2.066mg/g，大黃酚平均含量2.280mg/g），研細(xì)，取約0.25g，精密稱定，分別精密加入大黃素對照品0.511mg，大黃酚對照品0.503mg，平行6份，按供試品溶液制備項(xiàng)下制備，按擬定的測定條件進(jìn)行測定，計(jì)算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表9、10。

表9 四季三黃片含量測定準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果（大黃素）

表10 四季三黃片含量測定準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果（大黃酚）

試驗(yàn)結(jié)果表明，大黃素的平均回收率為100.20%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.98%；大黃酚的平均回收率為101.70%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.51%，證明該方法準(zhǔn)確度良好。

7、日內(nèi)穩(wěn)定性試驗(yàn)：

取本品（批號為ZL02），研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，按供試品溶液制備項(xiàng)下制備，按擬定的測定條件分別在第0、2、4、6、8、10、12、14小時(shí)進(jìn)樣10μl測定大黃素、大黃酚峰面積，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表11。

表11 四季三黃片含量測定日內(nèi)穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，供試品溶液在14小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

8、耐用性試驗(yàn)

使用不同的十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱進(jìn)行測定，結(jié)果見表12。

表12 四季三黃片含量測定耐用性試驗(yàn)結(jié)果

由試驗(yàn)結(jié)果可見，使用不同的十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，不同的液相色譜進(jìn)行測定。色譜峰峰型和分離度良好，測定結(jié)果基本不受影響，本方法耐用性良好，見圖6-8。

8、確定含量測定方法

（1）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-0.1%磷酸（79：21）為流動相；檢測波長為254nm。理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于12000。

對照品溶液的制備 精密稱取大黃素對照品、大黃酚對照品適量，加甲醇制成每1ml含大黃素16μg、大黃酚16μg的混合溶液，即得。

供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱定重量，加熱回流1小時(shí)，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5ml，置燒瓶中，揮去溶劑，加12%鹽酸溶液10ml，超聲處理2分鐘，再加入三氯甲烷10ml，加熱回流1小時(shí)，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓D(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。

（2）樣品測定：

取該品5個(gè)批號的樣品，按照供試品溶液制備及色譜條件測定樣品中大黃素和大黃酚的總量。結(jié)果見表13。

表13五批樣品含量測定結(jié)果

根據(jù)以上五批的檢測結(jié)果，確定四季三黃片中每片含大黃以大黃素（C₁₅H₁₀O₅）和大黃酚（C₁₅H₁₀O₄）總量計(jì)，不得少于0.70mg。

本發(fā)明公開的四季三黃片含量測定方法所具有的積極效果在于：

（1）發(fā)明了四季三黃片中大黃素和大黃酚總量的測定方法。

（2）增加了含量測定項(xiàng)目，提高了控制藥品質(zhì)量的手段。

附圖說明：

圖1大黃素、大黃酚對照品色譜圖；

圖2四季三黃片（批號為ZL02）供試品色譜圖；

圖3四季三黃片大黃陰性樣品色譜圖；

圖4大黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖5大黃酚標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖6四季三黃片含量測定耐用性試驗(yàn)——四季三黃片（批號ZL02）供試品色譜圖（DIKMA Diamonsil（2）5um 250×4.6mm）；

圖7四季三黃片含量測定耐用性試驗(yàn)——四季三黃片（批號ZL02）供試品色譜圖

（Agela BonChrom C18 5um 100A 250×4.6mm）；

圖8四季三黃片含量測定耐用性試驗(yàn)——四季三黃片（批號ZL02）供試品色譜圖

（YMC-Pack ODS-A 5u 12nm 250×4.6mm）。

具體實(shí)施方式

下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所用藥材均有市售。

實(shí)施例1

【處方】大黃 240g 黃芩 240g 梔子75g 黃柏240g

【制法】以上四味，大黃粉碎成細(xì)粉；黃芩、梔子加水煎煮二次，每次2小時(shí)，合并煎液，濃縮成相對密度為1.3（80℃測）的稠膏；黃柏用60%乙醇滲漉，收集滲漉液，回收乙醇，濃縮成相對密度為1.3（80℃測）的稠膏；將水、醇濃縮膏合并，加入大黃粉末混勻，制成顆粒，干燥，壓制成1390片，包薄膜衣，即得。

【性狀】本品為薄膜衣片，除去包衣后顯棕色；味苦。

實(shí)施例2

供試品溶液的制備取本品適量，研細(xì)，取0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱定重量，加熱回流1小時(shí)，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5ml，置燒瓶中，揮去溶劑，加12%鹽酸溶液10ml，超聲處理2分鐘，再加入三氯甲烷10ml，加熱回流1小時(shí)，放冷，置分液漏斗中，用1 ml三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。確定四季三黃片中每片含大黃以大黃素（C₁₅H₁₀O₅）和大黃酚（C₁₅H₁₀O₄）總量計(jì)為0.723mg。