本發(fā)明涉及煙草制品的檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種口用型無煙氣煙草制品煙堿的測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

口用型無煙氣煙草制品是無煙氣煙草制品的主要類型，被用來泛指口腔用無煙氣煙草制品，通過口腔、非燃燒途徑進(jìn)行產(chǎn)品消費(fèi)。口用型無煙氣煙草制品在瑞典、美國(guó)、挪威等具有較長(zhǎng)的使用歷史并廣受歡迎，在目前國(guó)內(nèi)外控?zé)熜蝿?shì)較為嚴(yán)峻的情況下，口用型無煙氣煙草制品經(jīng)口腔和消化系統(tǒng)消費(fèi)，不經(jīng)過燃燒且不產(chǎn)生燃燒或高溫分解產(chǎn)物，能使消費(fèi)者有效避免傳統(tǒng)煙草燃燒產(chǎn)物的暴露，對(duì)公眾和環(huán)境幾乎沒有影響，成為世界煙草生產(chǎn)和研發(fā)的重要領(lǐng)域。

口用型無煙氣煙草制品主要包括膠基煙、袋裝(散裝)口含煙和含化煙三類產(chǎn)品。膠基煙是一種在膠基中加入了一定量的煙草粉末、膠基、糖、添加劑、香精以及其他一些食用添加劑制成的一種片狀或粒狀的口含煙煙草制品，放入口腔中咀嚼使用。袋裝(散裝)口含煙一般是由晾煙或明火烤煙經(jīng)過粉碎、熱處理和包裝加工而成的一種潮濕的煙粉或煙絲狀煙草制品，水分含量通常高于40％，通常是含在唇齦之間消費(fèi)，唾液可以咽下，但普遍的是將其吐出，袋裝產(chǎn)品由于使用方便且不會(huì)污染口腔正在日益流行。含化煙是由添加了薄荷以及桉樹油等添加劑的煙粉壓制成的一種口含煙煙草制品，該制品可溶解在口腔中，通常放入口腔中含化使用。

口用型無煙氣煙草制品的煙堿主要通過唾液浸潤(rùn)釋放到口腔中，并通過口腔黏膜吸收到血液中被人體吸收。因此，煙堿的釋放量是無煙氣煙草制品安全的重要指標(biāo)，對(duì)口用型無煙氣煙草制品中的煙堿含量進(jìn)行測(cè)定具有重要作用。近年來，雖然不乏無煙氣煙草制品中煙堿的研究報(bào)道，但多數(shù)為國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)、疾病預(yù)防控制中心(CDC)、食品和藥物管理局(FDA)等一些公共健康團(tuán)體對(duì)無煙氣煙草制品中煙堿含量的普查及生物醫(yī)學(xué)研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明正是基于上述問題而提供的一種口用型無煙氣煙草制品中煙堿的測(cè)定方法。本方法提供的檢測(cè)方法，具有操作簡(jiǎn)單，定量準(zhǔn)確，重復(fù)性好，靈敏度高及回收率好的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

一種口用型無煙氣煙草制品中煙堿的測(cè)定方法，包括以下步驟：

(1)將所述口用型無煙氣煙草制品均勻分散于堿性水溶液與含內(nèi)標(biāo)物的低極性有機(jī)溶劑的混合物中；

(2)將步驟(1)得到的分散體系靜置分層；

(3)收集步驟(2)的有機(jī)相；

(4)用GC-FID/GC-MS對(duì)步驟(3)得到的有機(jī)相中煙堿含量進(jìn)行測(cè)定；

優(yōu)選地，所述堿性水溶液為NaOH水溶液或KOH水溶液，濃度為1～8mol/L。

優(yōu)選地，所述內(nèi)標(biāo)物為2-甲基喹啉或正十七烷，濃度為0.1mg/mL～0.5mg/mL。

優(yōu)選地，所述低極性有機(jī)溶劑為正庚烷、正己烷、四氫呋喃、甲基叔丁醚、乙酸乙酯、二氯甲烷中的一種。

優(yōu)選地，所述堿性水溶液與含內(nèi)標(biāo)物的低極性有機(jī)溶劑的質(zhì)量比為1:2～1:10。

優(yōu)選地，所述步驟(1)的均勻分散的方式為超聲、振蕩、磁力攪拌中的一種，時(shí)間為30min～120min。

優(yōu)選地，所述口用型無煙氣煙草制品為口含煙、膠基煙或含化煙中的一種。

優(yōu)選地，步驟(4)對(duì)煙堿含量進(jìn)行測(cè)定之前，還包括對(duì)有機(jī)相在-10℃～-25℃溫度下冷凍0.5～2h步驟。

優(yōu)選地，步驟(4)所述的GC-FID/GC-MS的檢測(cè)條件為：采用中等極性的色譜柱，程序升溫方式為初始溫度100℃，保持1min，以15℃/min速率升至130℃，在以40℃/min速率升至220℃保持10min，總運(yùn)行時(shí)間16min；載氣流速為2.0ml/min，分流比1:50；進(jìn)樣口溫度250℃，進(jìn)樣量1μL。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明首次提供了一種口用型無煙氣煙草制品(包括袋裝或散裝口含煙、膠基煙、含化煙)中煙堿含量的GC-FID/GC-MS方法，實(shí)現(xiàn)了口用型無煙氣煙草制品中煙堿含量的快速測(cè)定。

2、口用型無煙氣煙草制品都具有水溶性，而煙堿既能溶于水，又能溶于有機(jī)相。為了讓樣品充分溶解、釋放，采用水和有機(jī)相混合對(duì)煙堿進(jìn)行萃取。煙堿一般以游離態(tài)、單質(zhì)子態(tài)和雙質(zhì)子態(tài)三種形態(tài)存在。在酸性條件下，煙堿容易發(fā)生質(zhì)子化反應(yīng)；在堿性條件下，煙堿較易生成游離態(tài)的煙堿。添加一定量的酸或堿讓其生成游離態(tài)或者發(fā)生質(zhì)子化反應(yīng)?？紤]到水相中的基質(zhì)比較復(fù)雜，故加入堿性水溶液使煙堿以游離態(tài)的方式存在并分散于有機(jī)相中。

3、含化煙是添加了薄荷以及桉樹油等添加劑的煙粉壓制成，樣品緊實(shí)，粘合劑等輔料不易溶解，對(duì)樣品進(jìn)行粉碎處理能夠讓樣品溶解更充分。

4、膠基煙中膠基的成分比較復(fù)雜，溶解后的膠基高分子聚合物在低極性有機(jī)相中容易發(fā)生聚合，形式絮狀物。試驗(yàn)比較了離心、冷凍兩種方式對(duì)絮狀物的沉淀作用，發(fā)現(xiàn)離心對(duì)絮狀物的沉淀效果不佳，冷凍對(duì)絮狀物的沉淀效果較好，且試驗(yàn)證明冷凍前后煙堿的含量基本不發(fā)生變化。選擇-10℃對(duì)溶解后膠基煙的上層清液進(jìn)行冷凍，比較不同冷凍時(shí)間對(duì)不同樣品量的膠基煙中絮狀物的沉淀的效果，發(fā)現(xiàn)冷凍0.5h后，不同樣品量的膠基煙上層溶解液過濾后放置不再出現(xiàn)絮狀物。

5、在GC-FID/GC-MS分析中，采用的是內(nèi)標(biāo)法定量，相對(duì)于外標(biāo)法能夠有效地消除操作誤差，準(zhǔn)確的測(cè)定煙堿的含量。正十七烷或2-甲基喹啉作為內(nèi)標(biāo)物對(duì)口用型無煙氣煙草制品煙堿的測(cè)定的其他組分無干擾。

6、本發(fā)明所提供的方法，前處理簡(jiǎn)單，不需要凈化富集，操作簡(jiǎn)單、快速，方法的檢出限為0.36μg/mL，定量限為1.20μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)大于0.9999，三個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率在92.7～115.1％之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于5％，這表明方法的靈敏度和回收率高，重復(fù)性較好。

附圖說明

圖1為標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖；1為2-甲基喹啉；2為煙堿。

圖2為膠基煙萃取液色譜圖；1為2-甲基喹啉；2為煙堿。

圖3為袋裝口含煙萃取液色譜圖；1為2-甲基喹啉；2為煙堿。

圖4為含化煙萃取液色譜圖；1為2-甲基喹啉；2為煙堿。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明通過以下具體實(shí)施例作進(jìn)一步描述，但不限于實(shí)施例。

實(shí)施例1：

儀器、試劑及儀器工作條件：

(1)儀器

Trace 1300&1310氣相色譜儀，配FID檢測(cè)器(賽默飛世爾科技有限公司)，XP504型分析天平(感量0.0001g，瑞士梅特勒-托利多)；3017型振蕩(北京金恒祥儀器有限公司)；8510E-MTH超聲波發(fā)生器(型號(hào)：美國(guó)BRANSONIC)；RCT basic型磁力攪拌器(德國(guó)IKA)；Milli-Q50超純水儀(美國(guó)Millipore公司)；BT224S電子天平(感量0.0001g，德國(guó)Sartorius公司)。

色譜柱：安捷倫DB-ALC1色譜柱(30m×0.32mm×1.8μm)；玻璃器皿：各種規(guī)格移液管、容量瓶和具塞錐形瓶。

(2)試劑

除特別要求外，均使用色譜純?cè)噭畱?yīng)符合GB/T 6682中一級(jí)水的要求。試劑標(biāo)準(zhǔn)品包括：2-甲基喹啉，純度不低于98％；煙堿，純度不低于99％，均為加拿大TRC標(biāo)準(zhǔn)品。

(3)樣品前處理

膠基煙：稱取2粒膠基煙樣品，準(zhǔn)確量取20mL濃度為3mol/L的NaOH溶液，40mL含內(nèi)標(biāo)的萃取液，置于100mL三角瓶中，使用振蕩器振蕩90min，靜置5min，使水相與有機(jī)相分層，取有機(jī)相-20℃冷凍1h，然后取上層清液過濾，得到待測(cè)試樣液，用GC-FID進(jìn)行測(cè)定。

袋裝口含煙：稱取2袋袋裝口含煙樣品(需剪開無紡布層)，準(zhǔn)確量取20mL濃度為3mol/L的NaOH溶液，40mL含內(nèi)標(biāo)的萃取液，置于100mL三角瓶中，使用振蕩器振蕩90min，靜置5min，使水相與有機(jī)相分層，取上層清液過濾，得到待測(cè)試樣液，用GC-FID進(jìn)行測(cè)定。

含化煙：稱取2粒含化煙樣品(樣品需研磨打粉)，準(zhǔn)確量取20mL濃度為3mol/L的NaOH溶液，40mL含內(nèi)標(biāo)的萃取液，置于100mL三角瓶中，使用振蕩器振蕩90min，靜置5min，使水相與有機(jī)相分層，取上層清液過濾，得到待測(cè)試樣液，用GC-FID進(jìn)行測(cè)定。

(4)氣相色譜條件

按制造商操作手冊(cè)進(jìn)行操作。以下分析條件可供參考，采用其他條件應(yīng)驗(yàn)證其適用性。

色譜柱：安捷倫DB-ALC1色譜柱(30m×0.32mm×1.8μm)。

程序升溫方式：初始溫度100℃，保持1min，以15℃/min速率升至130℃，以40℃/min速率升至220℃，保持10min；總運(yùn)行時(shí)間15min。以氦氣為載氣，流速為2.0mL/min，進(jìn)樣口溫度250℃，進(jìn)樣量1μL，分流進(jìn)樣，分流比50:1，采用FID檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度：275℃。

(5)口含煙中煙堿的定量測(cè)定

將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液依次進(jìn)樣分析，得到每個(gè)目標(biāo)化合物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比及濃度比，根據(jù)峰面積之比和濃度之比繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，相關(guān)系數(shù)R²大于等于0.99。

定量分析：口含煙中煙堿的含量由式(1)計(jì)算得出：

式中：

X—樣品中煙堿的含量，單位為毫克/克(mg/g)；

C—從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上得到甾醇濃度，單位為微克/毫升(μg/mL)；

v—樣品萃取液定容體積，單位為毫升(mL)；

m—試樣質(zhì)量，單位為克(g)；

根據(jù)上述氣相色譜測(cè)定方法，對(duì)國(guó)內(nèi)外28種袋裝口含煙、20種膠基煙、2種含化煙樣品中煙堿含量進(jìn)行了檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果表1。

表1國(guó)內(nèi)外樣品煙堿含量的測(cè)定