本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)，具體涉及一種甲砜霉素檢測酶聯(lián)免疫試劑盒，以及該試劑盒的應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
：甲砜霉素(Thiamphenicol)，別名硫霉素，屬于酰胺醇類，是甲砜霉素的同類物，抗菌譜和抗菌作用與甲砜霉素相仿，具有廣譜抗微生物作用，甲砜霉素和甲砜霉素已在我國畜牧業(yè)中廣泛應(yīng)用，對畜禽疾病控制及治療起到了重要作用。甲砜霉素對抑制紅細胞、白細胞和血小板程度比甲砜霉素輕，但免疫抑制作用比甲砜霉素強，現(xiàn)除我國與日本外，歐共體和美國均禁用于食品動物。到目前為止，甲砜霉素殘留的分析方法最常用的是液相色譜法和氣相色譜法。也有波譜法的報道，但該方法耗時又缺乏靈敏性，現(xiàn)已很少使用。公開號為CN105445390A專利文獻，公開了一種“乳制品中甲砜霉素類殘留的檢測方法”，其中該技術(shù)方案中所稱甲砜霉素類包括甲砜霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，該方法包括：對待測樣品進行前處理，其中包括：稱取m1克待測樣品，加入v1毫升乙酸乙酯提取，以獲得第一提取物，利用v2毫升甲醇溶解第一提取物，加入v3毫升正己烷混勻，離心棄去上層，以獲得第二提取物，利用固相萃取柱凈化第二提取物，以獲得凈化物；利用液相-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析凈化物，以檢測該待測樣品中的甲砜霉素類殘留；其中，m1小于等于5，v1小于20，v2小于1，v3小于8。通過以上技術(shù)方案可知，這是目前較為常用的色譜法檢測方法，能夠同時檢測甲砜霉素類殘留，但是甲砜霉素與甲砜霉素并不相同，其檢測缺乏針對性，因此，對于甲砜霉素的檢測靈敏度不高，準確性較差，而且整個檢測方法較為復雜，耗時耗力，不能一種較為理想的甲砜霉素殘留檢測方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于：現(xiàn)有甲砜霉素檢測方法復雜及檢測結(jié)果靈敏度不高、準確性較差的問題，本發(fā)明提供一種甲砜霉素檢測酶聯(lián)免疫試劑盒及其應(yīng)用。技術(shù)方案：一種甲砜霉素檢測酶聯(lián)免疫試劑盒，包括：酶標板，酶標板上預包被有包被原，所述包被原為抗原、抗體或抗抗體；酶標記物工作液，其中所述酶標記物為酶標記半抗原、酶標記抗體或酶標記抗抗體；甲砜霉素特異性抗體工作液，所述甲砜霉素特異性抗體為甲砜霉素單克隆抗體，可用甲砜霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原制備得到；洗滌工作液，由濃縮洗滌液稀釋而成；復溶工作液，由濃縮復溶液稀釋而成；TMB顯色液，包括TMB底物液A液和TMB底物液B液；其中，本發(fā)明酶標板上的微孔條上預包被甲砜霉素偶聯(lián)抗原，酶標記物工作液中的酶標記物為酶標記抗抗體，即酶標二抗。其中，本發(fā)明所述的預包被偶聯(lián)抗原由甲砜霉素半抗原與載體蛋白OVA偶聯(lián)制備得到，制備工藝為，將甲砜霉素半抗原溶解于DMF溶液中，加入各EDC和NHS水溶液進行活化30分鐘，加入到載體蛋白OVA水溶液中進行偶聯(lián)制備出包被原。其中，本發(fā)明所述的甲砜霉素半抗原由甲砜霉素溶液與丁二酸酐，在吡啶的催化下制備得到，合成路線如下所示：其中，本發(fā)明甲砜霉素特異性抗體由甲砜霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原制備，制備工藝為，將甲砜霉素半抗原溶解于DMF溶液中，加入各EDC和NHS水溶液進行活化30分鐘，加入到載體蛋白BSA水溶液中進行偶聯(lián)制備出免疫原，然后緩沖液透析3天，透析完成后用于動物免疫，制備出甲砜霉素特異性抗體。本發(fā)明的一個具體實施方式，所述試劑盒還包括甲砜霉素標準溶液，濃度分別為0μg/L、0.025μg/L、0.1μg/L、0.4μg/L、1.6μg/L和6.4μg/L。本發(fā)明的一個具體實施方式，所述試劑盒還包括終止液，所述終止液為2mol/L的鹽酸緩沖液。一種應(yīng)用甲砜霉素檢測酶聯(lián)免疫試劑盒檢測甲砜霉素的方法，步驟如下：(1)樣品預處理；(2)將樣品加入到酶標板上之后，再加入酶標記物工作液和甲砜霉素特異性抗體工作液；(3)酶標板洗板處理；(4)顯色處理：在酶標板先加入TMB底物液A液，再加入TMB底物液B液，進行顯色反應(yīng)；(5)測定：加入終止液，放入酶標儀中，采用波長450nm進行測定，讀取OD值。作為優(yōu)選，所述步驟(5)測定階段，酶標儀采用雙波長450/630nm進行檢測。有益效果：本發(fā)明的檢測原理：當在微孔條上預包被甲砜霉素偶聯(lián)抗原時，加入樣本溶液或標準品溶液后，樣本中殘留的甲砜霉素和酶標板微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗甲砜霉素的抗體，加入酶標二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含殘留物甲砜霉素的含量成負相關(guān)，與標準曲線比較，再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣本中甲砜霉素的殘留量。本發(fā)明提供的甲砜霉素檢測酶聯(lián)免疫試劑盒，是應(yīng)用ELISA技術(shù)研發(fā)的新一代藥物殘留檢測產(chǎn)品，與傳統(tǒng)儀器分析技術(shù)相比，具有檢測快速、簡便、準確，以及檢測靈敏度高等特點，能最大限度地減少操作誤差和工作強度，是一種十分理想的甲砜霉素殘留檢測試劑盒。附圖說明圖1為甲砜霉素氫譜圖。圖2為甲砜霉素半抗原合成圖。具體實施方式為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明優(yōu)選實施方案進行描述，但是應(yīng)當理解，這些描述只是為進一步說明本發(fā)明的特征和優(yōu)點，而不是對本發(fā)明權(quán)利要求的限制。本發(fā)明甲砜霉素檢測酶聯(lián)免疫試劑盒，包括：(1)洗滌工作液，濃縮洗滌液1：19體積比稀釋而成，所述濃縮洗滌液為pH值為7.1～7.5，含有0.8％～1.2％吐溫-20、0.01‰～0.03‰硫柳汞防腐劑、0.01～0.03mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比；(2)復溶工作液，濃縮復溶液1：1體積比稀釋而成，pH值為7.2～7.7，含有8％～12％卵清蛋白、0.1～0.4mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比；(3)TMB顯色液，包括TMB底物液A液和TMB底物液B液，A液為過氧化氫，B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；(4)終止液，2mol/L的鹽酸緩沖液；(5)96孔酶標板，其中在酶標板制備過程中所用的包被緩沖液為pH值為9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液，所用封閉液為pH值為9.1～9.5，含有3％～10％小牛血清、0.2％吐溫-20、0.1～0.3mol/L的碳酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比；本發(fā)明中酶標板的制備過程為，用包被緩沖液將包被原稀釋成0.1～0.2μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h或4℃過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μl封閉液37℃溫育1～2h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用鋁膜真空；其中，本發(fā)明所述的預包被偶聯(lián)抗原由甲砜霉素半抗原與載體蛋白OVA偶聯(lián)制備得到，其中甲砜霉素半抗原合成的方法為，將甲砜霉素溶于DMF溶液，加入丁二酸酐，以吡啶為催化劑，加熱回流，薄層色譜監(jiān)測反應(yīng)，待反應(yīng)完成后，提取純化，得到半抗原，合成路線如下所示：其中，本發(fā)明所述的預包被偶聯(lián)抗原的制備方法如下：稱取32.5mg半抗原溶解于2mLDMF溶液中，將60mgEDC和60mgNHS溶于2mL水中，加入到半抗原的DMF溶液中，活化30分鐘，加入到100-250mg載體蛋白OVA的3mL水溶液中進行偶聯(lián)制備出包被原。(6)其中，本發(fā)明甲砜霉素特異性抗體的制備流程為：稱取32.5mg半抗原溶解于2mLDMF溶液中，將60mgEDC和60mgNHS溶于2mL水中，加入到半抗原的DMF溶液中，活化30分鐘，加入到100-250mg載體蛋白BSA的3mL水溶液中進行偶聯(lián)制備出免疫原，用0.02mol/LPB3天，每天早晚更換透析液，透析完成后用于動物免疫制備出抗體。所述甲砜霉素特異性抗體為甲砜霉素單克隆抗體；所述單克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體，本實施例為甲砜霉素鼠單克隆抗體；將甲砜霉素鼠單克隆抗體通過現(xiàn)有技術(shù)進行稀釋，制備得到甲砜霉素特異性抗體工作液；(7)酶標二抗工作液，本實施例酶標二抗采用羊抗鼠抗抗體，以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原，對無病原體羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。本實施例為酶標記的鼠抗抗體，本實施例的標記酶為辣根過氧化物酶，標記酶酶標記的羊抗鼠抗抗體是采用戊二醛法將標記酶與抗抗體進行偶聯(lián)得到；酶標二抗通過稀釋，酶標二抗得到工作液，稀釋處理同現(xiàn)有技術(shù)；(8)甲砜霉素標準溶液，濃度分別為0μg/L、0.025μg/L、0.1μg/L、0.4μg/L、1.6μg/L和6.4μg/L。一種應(yīng)用甲砜霉素檢測酶聯(lián)免疫試劑盒檢測甲砜霉素的方法，步驟如下：(1)樣品預處理；牛奶樣本前處理方法a.量取1ml牛奶至2ml聚苯乙烯離心管中，加入30μl牛奶提取液，用渦旋儀渦動20s，3000g室溫(20-25℃/68-77℉)離心5min；b.避開上層懸浮物，移取50μl上清液至2ml聚苯乙烯離心管中，加入450μl復溶工作液；c.取50μl用于分析。(如果需要檢測含量大于40μg/L的樣本，可在最后一步將樣本進行20倍稀釋，即25μl上清液加入475μl復溶工作液。)在使用各種試劑前，需回溫至室溫，另外酶標板做遮光處理，蓋板膜封住微孔酶標板。(2)將樣品加入到酶標板上之后，再加入酶標記物工作液和甲砜霉素特異性抗體工作液；加入標準品和樣本50μl到對應(yīng)的微孔中，然后加入酶標二抗50μl/孔，再加入甲砜霉素特異性抗體工作液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃(98.6℉)避光環(huán)境中反應(yīng)30min；(3)酶標板洗板處理；揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加入洗滌工作液250μl/孔，充分洗滌4－5次，每次間隔10s，潑掉板孔內(nèi)洗滌液，用吸水紙拍干；(4)顯色處理：在酶標板先加入TMB底物液A液，再加入TMB底物液B液，進行顯色反應(yīng)；加入TMB底物液A液50μl/孔，再加入TMB底物液B液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃(98.6℉)避光環(huán)境中反應(yīng)15min；(5)測定：加入終止液，放入酶標儀中，采用波長450nm進行測定，讀取OD值。加入終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，采用波長450nm進行測定，測定每孔OD值；最后，是結(jié)果判定，采用定量分析法，即百分吸光率的計算。1、標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的平均吸光度值(雙孔)除以第一個標準品(0標準)的平均吸光度值，再乘以100％，即B—標準品或樣本溶液的平均吸光度值B0—0μg/L標準溶液的平均吸光度值2、標準曲線的繪制與計算以標準品百分吸光率為縱坐標，以甲砜霉素標準品濃度(μg/L)的對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中甲砜霉素的實際濃度。本發(fā)明甲砜霉素檢測酶聯(lián)免疫試劑盒對甲砜霉素的檢測靈敏度高達0.025μg/L。對甲砜霉素檢測酶聯(lián)免疫試劑盒進行測試：(1)應(yīng)用甲砜霉素檢測酶聯(lián)免疫試劑盒對0.35μg/L濃度的甲砜霉素牛奶樣品進行含量測定，精密度以變異系數(shù)表示，分別取三個不同批次的試劑盒，每個濃度重復5次，分別計算變異系數(shù)，結(jié)果見表1。表1牛奶樣品變異系數(shù)測定由上表所示，牛奶中樣品的變異系數(shù)為4.54-7.41％。(2)樣品精確度測試：取濃度為0.1μg/L的甲砜霉素標準品溶液，分別對5個牛奶樣品進行添加回收試驗，每個濃度做3個平行，分別計算回收率，準確度以回收率表示，計算結(jié)果如表2所示。表2添加回收率測定由上表可知，本實施例中牛奶樣品添加回收率在93.0％-105.83％之間，表明本發(fā)明酶聯(lián)免疫檢測試劑盒測定牛奶的準確率較高。(3)交叉反應(yīng)率試驗：選擇與甲砜霉素有類似結(jié)構(gòu)和類似功能2種藥物測定交叉反應(yīng)率，通過各種藥物的標準曲線分別得到其50％抑制濃度(即IC50)，交叉反應(yīng)率(％)＝(甲砜霉素IC50/甲砜霉素類似物IC50)×100％，結(jié)果見表3。表3交叉反應(yīng)率測定藥物名稱交叉反應(yīng)率(％)甲砜霉素100％氟甲砜霉素130％(4)試劑盒保存性試驗：試劑盒保存條件為2～8℃，經(jīng)過12個月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零標準)、50％抑制濃度、甲砜霉素添加實際測定值均在正常范圍之內(nèi)。對所公開的實施例的上述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。當前第1頁1 2 3