本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種水溶液中短鏈脂肪酸的分析方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

短鏈脂肪酸屬于揮發(fā)性脂肪酸，為碳原子數(shù)1～6的有機(jī)脂肪酸主要包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸。短鏈脂肪酸包括甲酸，乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸，被后腸迅速吸收后，既儲(chǔ)存了能量又降低了滲透壓，并且短鏈脂肪酸對于維持大腸的正常功能和結(jié)腸上皮細(xì)胞的形態(tài)和功能具有重要作用。短鏈脂肪酸還可促進(jìn)鈉的吸收，丁酸在這方面的作用比乙酸和丙酸更強(qiáng)并且丁酸可增加乳酸桿菌的產(chǎn)量而減少大腸桿菌的數(shù)量。

油脂氧化過程生成短鏈脂肪酸，作為氧化二級產(chǎn)物生成后揮發(fā)構(gòu)成油脂酸敗哈喇味的一部分，以蒸餾水吸收裂解產(chǎn)物作為判定油脂劣化程度的指標(biāo)之一。因此檢測短鏈脂肪酸具有一定的必要性和實(shí)用性。關(guān)于短鏈脂肪酸的檢測，國內(nèi)外一般使用氣相質(zhì)譜聯(lián)用方法，然而設(shè)備昂貴，檢測費(fèi)用高昂。此外也有報(bào)道氣相色譜法檢測短鏈脂肪酸，然而氫焰離子化檢測器對甲酸的響應(yīng)極為有限，無法實(shí)現(xiàn)檢測目的。因此，亟待需要找到一種高效檢測能夠在水溶液中分析多種短鏈脂肪酸的分析方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本部分的目的在于提供一種檢測水溶液中短鏈脂肪酸的反向高效液相色譜分析方法以及簡要介紹一些較佳實(shí)施例。在本部分以及本申請的說明書摘要和發(fā)明名稱中可能會(huì)做些簡化或省略以避免使本部分、說明書摘要和發(fā)明名稱的目的模糊，而這種簡化或省略不能用于限制本發(fā)明的范圍。

鑒于上述和/或現(xiàn)有短鏈脂肪酸檢測中存在的問題，提出了本發(fā)明。

因此，本發(fā)明的其中一個(gè)目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種保留時(shí)間短，色譜圖的質(zhì)量高的水溶液中短鏈脂肪酸的高效液相分析方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：一種水溶液中短鏈脂肪酸的分析方法，包括，制備標(biāo)準(zhǔn)溶液后測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將待測樣品過濾膜，進(jìn)高效液相色譜分析，計(jì)算各組分含量。

作為本發(fā)明所述水溶液中短鏈脂肪酸的分析方法的一種優(yōu)選方案，其中： 所述高效液相色譜分析，其中，流速為1.0～3.0mL/min，柱溫為35～45℃，進(jìn)樣量為10～100μL，流動(dòng)相A包括磷酸二氫鉀緩沖溶液，流動(dòng)相B包括甲醇。

作為本發(fā)明所述水溶液中短鏈脂肪酸的分析方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述高效液相色譜分析，其洗脫方式為梯度洗脫，其是先以磷酸二氫鉀：甲醇＝80～95：5～20為起點(diǎn)，做7min等濃度淋洗，然后線性增大甲醇濃度，10～20min時(shí)達(dá)到磷酸二氫鉀：甲醇＝60～80：20～40，25～35min時(shí)以磷酸二氫鉀：甲醇＝60～80：20～40做等濃度淋洗，以上比例均為體積比。

作為本發(fā)明所述水溶液中短鏈脂肪酸的分析方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述制備標(biāo)準(zhǔn)溶液，其是分別稱取甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸用蒸餾水定容并形成不同濃度梯度，得到短鏈脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

作為本發(fā)明所述水溶液中短鏈脂肪酸的分析方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述高效液相色譜分析，其色譜柱選用C18柱，C18柱規(guī)格為φ4.6mm×150mm，5μm。

作為本發(fā)明所述水溶液中短鏈脂肪酸的分析方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述濾膜規(guī)格為0.3～0.6μm。

作為本發(fā)明所述水溶液中短鏈脂肪酸的分析方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述磷酸二氫鉀緩沖溶液濃度為0.04～0.10mol/L，并用磷酸調(diào)節(jié)pH為2～3。

作為本發(fā)明所述水溶液中短鏈脂肪酸的分析方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述甲醇為色譜純甲醇。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種水溶液中短鏈脂肪酸的分析方法在油脂氧化產(chǎn)物樣品檢測方面的應(yīng)用。

本發(fā)明所具有的有益效果：

(1)本發(fā)明所提供的分析方法，保留時(shí)間短，色譜圖的質(zhì)量高，分離效率高。

(2)本發(fā)明所提供的分析方法，相對標(biāo)準(zhǔn)差為2.30％，平均回收率96.88％，保留時(shí)間精密度為0.079～0.615％，峰面積精密度為1.12～3.50％。

(3)本發(fā)明所提供的分析方法，設(shè)備負(fù)荷小，方法簡便高效。

(4)本發(fā)明所提供的分析方法可應(yīng)用于油脂氧化產(chǎn)物檢測領(lǐng)域，適用于樣品分離純化所得到的單一短鏈脂肪酸或若干短鏈脂肪酸的復(fù)合物。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖。其中：

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的混合樣品的HPLC曲線。

圖2為實(shí)施例4中油脂氧化過程中的短鏈脂肪酸變化圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的具體實(shí)施方式做詳細(xì)的說明。

在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明，但是本發(fā)明還可以采用其他不同于在此描述的其它方式來實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似推廣，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施例的限制。

其次，此處所稱的“一個(gè)實(shí)施例”或“實(shí)施例”是指可包含于本發(fā)明至少一個(gè)實(shí)現(xiàn)方式中的特定特征、結(jié)構(gòu)或特性。在本說明書中不同地方出現(xiàn)的“在一個(gè)實(shí)施例中”并非均指同一個(gè)實(shí)施例，也不是單獨(dú)的或選擇性的與其他實(shí)施例互相排斥的實(shí)施例。

試驗(yàn)儀器和色譜條件

1525型高效液相色譜儀(Waters公司，美國)，SunFire^TM C18色譜柱(φ4.6mm×150mm，5μm)(Waters公司，美國)，實(shí)驗(yàn)用臺(tái)式pH計(jì)(梅特勒-托利多公司，瑞士)。

用紫外分光光度儀在200nm～400nm波長內(nèi)對制備的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行洗脫及連續(xù)掃描，通過圖像峰型、出峰情況判斷每種物質(zhì)的最大吸收波長，選擇平均最大吸收波長215nm為本發(fā)明檢測波長。

實(shí)施例1

標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

分別稱取甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸2g用蒸餾水定容50mL，分別量取0.5mL、1mL、2mL、4mL、8mL、16mL定容50ml，制得短鏈脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。用所確定的色譜分析方法依次對標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以液相色譜出峰的絕對面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)作圖，得到測定水槽中各 種短鏈脂肪酸的線性范圍和檢測限。所得數(shù)據(jù)如下表：

實(shí)施例2

油脂氧化產(chǎn)物樣品測定

采集四種油脂Rancimat氧化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)所得水溶液，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后，調(diào)整液相色譜條件如下，

色譜柱為C18柱，規(guī)格為φ4.6mm×150mm，5μm，

流速為1.0mL/min，

柱溫為40℃，

檢測波長為215nm，

進(jìn)樣量為10μL，

流動(dòng)相A包括磷酸二氫鉀緩沖溶液濃度為0.05mol/L，并用磷酸調(diào)節(jié)pH為2.8，流動(dòng)相B包括色譜純甲醇，

洗脫方式為梯度洗脫，其是先以磷酸二氫鉀：甲醇＝95：5為起點(diǎn)，做7min等濃度淋洗，然后線性增大甲醇濃度，16min時(shí)達(dá)到磷酸二氫鉀：甲醇＝60：40，然后以磷酸二氫鉀：甲醇＝60：40做等濃度淋洗，以上比例均為體積比。

在確定的以上液相色譜條件下測定其短鏈脂肪酸組成，見圖1，處理結(jié)果后得到各組分的含量。

測定結(jié)果如下表：

注：ND表示為未檢出。

采集樣品經(jīng)濾膜過濾后進(jìn)樣分析，在穩(wěn)定操作條件下重復(fù)6次，方法的保留時(shí)間和峰面積精密度結(jié)果見表1?？刂萍訕?biāo)物體積不超過試樣溶液體積的1％，加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。結(jié)果表明，該法有較好的精密度和準(zhǔn)確度。

表1方法精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由此可見，本發(fā)明所提供的分析方法，相對標(biāo)準(zhǔn)差為2.30％，平均回收率96.88％，保留時(shí)間精密度為0.079～0.615％，峰面積精密度為1.12～3.50％。

實(shí)施例3(對比實(shí)施例)

油脂氧化產(chǎn)物樣品測定

采集四種油脂Rancimat氧化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)所得水溶液，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后，調(diào)整液相色譜條件如下，

色譜柱為C18柱，規(guī)格為φ4.6mm×150mm，5μm，

流速為2.0mL/min，

柱溫為22℃，

檢測波長為217nm，

進(jìn)樣量為10ml，

流動(dòng)相A包括磷酸二氫鉀緩沖溶液濃度為0.05mol/L，并用磷酸調(diào)節(jié)pH為2.8，流動(dòng)相B包括色譜純甲醇，

洗脫方式為梯度洗脫，其是先以磷酸二氫鉀：甲醇＝90：10為起點(diǎn)，做15min等濃度淋洗，15min時(shí)線性調(diào)整為磷酸二氫鉀：甲醇＝70：30，25min時(shí)，25min時(shí)以磷酸二氫鉀：甲醇＝50：50做等濃度淋洗，以上比例均為體積比。

在確定的以上液相色譜條件下測定其短鏈脂肪酸組成，得到的譜圖出現(xiàn)基線漂移現(xiàn)象，并且峰形質(zhì)量差，色譜峰存在前沿與拖尾的問題。結(jié)果重復(fù)性不良，相對標(biāo)準(zhǔn)差為8.30％，精密度和準(zhǔn)確度處于較低水平，平均回收率為89.58％。并且6次重復(fù)試驗(yàn)中，出現(xiàn)兩次緩沖鹽堵塞系統(tǒng)。設(shè)定的條件也使得機(jī)器負(fù)荷較大，色譜峰質(zhì)量差與設(shè)定的條件有一定程度的關(guān)聯(lián)。

發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)，梯度洗脫開始的時(shí)間點(diǎn)和前后的流動(dòng)相組成，也是有選擇的，盡管加大甲醇濃度縮短總體分析時(shí)間，但是又不能過快，造成AB相混合不均勻或者儀器產(chǎn)生氣泡。甲醇含量過高，緩沖鹽析出會(huì)堵塞系統(tǒng)，但是甲醇少了又會(huì)加長出峰時(shí)間。并且流速過快柱壓太高導(dǎo)致儀器難以承受，隨著脂肪酸碳原子數(shù)的增加，保留時(shí)間顯著增加，選擇合適的洗脫流速和梯度參數(shù)，對兼具分離效果與分析效率至關(guān)重要。

并且樣品濃度直接影響液相出峰，濃度太小容易影響所測物質(zhì)出峰，太大會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)平峰影響絕對面積積分。發(fā)明人進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，對于在水溶液中檢測分析短鏈脂肪酸，采用梯度洗脫能夠有效地縮短液相分析時(shí)間，但梯度洗脫曲線易出現(xiàn)基線漂移，從圖1可見，本發(fā)明提供的分析方法，色譜圖質(zhì)量很高。

發(fā)明人進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，短鏈脂肪酸在95：5的流動(dòng)相中分離效果佳，然而己酸的保留時(shí)間過長，達(dá)2h。進(jìn)一步驗(yàn)證得流動(dòng)相比例60：40可顯著縮短戊酸和己酸的保留時(shí)間，且此比例可保證緩沖鹽不會(huì)析出堵塞通道。選擇丙酸出峰后開始梯度增加甲醇相，合適的梯度增加速率避免鬼峰，且最大程度縮 短了整體分析時(shí)間。

實(shí)施例4

油脂劣化評價(jià)指標(biāo)方法

Rancimat氧化穩(wěn)定測試儀是利用油脂氧化過程中產(chǎn)生的具有揮發(fā)性的二級產(chǎn)物改變蒸餾水電導(dǎo)率來測定油脂氧化酸敗誘導(dǎo)期，并據(jù)此判斷油脂氧化穩(wěn)定性的分析儀器。在特定溫度下向定量油脂中通入空氣，油脂在熱、氧環(huán)境下加速氧化產(chǎn)生揮發(fā)性小分子如醛、酮、揮發(fā)性酸等，小分子物質(zhì)隨氣流進(jìn)入測量池，多數(shù)酸溶解在水中，儀器依據(jù)水電導(dǎo)率變化判定油脂氧化程度。Rancimat氧化穩(wěn)定評價(jià)實(shí)驗(yàn)因其操作簡便、測量快速、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。

然而近年來，市場上不斷出現(xiàn)富含不飽和脂肪酸、特殊營養(yǎng)成分的新型特種油品，氧化穩(wěn)定性能評價(jià)過程中常常出現(xiàn)電導(dǎo)曲線異常、特定油脂測量結(jié)果重復(fù)性差等問題，而發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)，測量池水的電導(dǎo)率根本上是由溶解其中的短鏈脂肪酸決定。根據(jù)油脂自動(dòng)氧化理論，從脂肪酸自由基反應(yīng)開始，生成一級氧化產(chǎn)物氫過氧化物，后期氫過氧化物降解成中段碳鏈醛，由醛和氧氣循環(huán)反應(yīng)不斷生成短鏈脂肪酸。短鏈脂肪酸為油脂自動(dòng)氧化的二級產(chǎn)物，在儀器測量池中被蒸餾水吸收，導(dǎo)致蒸餾水電導(dǎo)率的改變。

大多數(shù)在Rancimat測試下產(chǎn)生的揮發(fā)性酸成分是甲酸和少量的乙酸、丙酸和其他酸。實(shí)驗(yàn)表明，甲酸的生成曲線和Rancimat電導(dǎo)率誘導(dǎo)曲線相當(dāng)一致。Rancimat誘導(dǎo)曲線斜率跟甲酸生成速率成正比(如附圖2)。油脂氫過氧化物分解遵循一級反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。因此，基于油脂分解揮發(fā)脂肪酸的水溶液組成分析，可作為評價(jià)評價(jià)油脂氧化階段的有效手段。

綜上所述，本發(fā)明所提供的分析方法，保留時(shí)間短，色譜圖的質(zhì)量高，分離效率高；本發(fā)明所提供的分析方法，相對標(biāo)準(zhǔn)差為2.30％，平均回收率96.88％，保留時(shí)間精密度為0.079～0.615％，峰面積精密度為1.12～3.50％；本發(fā)明所提供的分析方法，設(shè)備負(fù)荷小，方法簡便高效；本發(fā)明所提供的分析方法可應(yīng)用于油脂氧化產(chǎn)物檢測領(lǐng)域，適用于樣品分離純化所得到的單一短鏈脂肪酸或若干短鏈脂肪酸的復(fù)合物。

應(yīng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精 神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。