本發(fā)明涉及第二類體外診斷試劑，具體涉及一種精漿超氧化物歧化酶檢測試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：精液中氧自由基和抗氧化劑的平衡是保持正常生育能力的基礎(chǔ)，這種平衡的打破可能是造成男性不育和精子質(zhì)量下降的重要原因。精漿中抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化酶(glutathioneperoxidase，GPX)等?？寡趸傅闹饕砉δ苁欠乐寡踝杂苫?reactiveoxygenspecies，ROS)對細(xì)胞的損害，在正常情況下對細(xì)胞的生存也是必不可少的。ROS包括超氧化物陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)和羥基(OH-)，O2-是需氧代謝的副產(chǎn)物，它可以自動歧化或被SOD轉(zhuǎn)化為H2O2，CAT或GPX則將H2O2轉(zhuǎn)為H2O和O2，從而清除ROS。在這三種主要的抗氧化酶中，SOD不僅自身能將O2-轉(zhuǎn)化為H2O2，而且對CAT或GPX將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2的反應(yīng)具有催化作用，因而在清除ROS的過程中具有關(guān)鍵的作用。當(dāng)精漿中SOD活性降低時，過多的氧自由基可使精子線粒體膜、精子質(zhì)膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，從而影響精子活動力，同時，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的降解產(chǎn)物如丙二醛等，可抑制精子線粒體功能和包括腺苷酸環(huán)化酶在內(nèi)的多種酶的活性，從而影響精子的運(yùn)動功能，導(dǎo)致男性不育。目前臨床上尚缺乏精漿中超氧化物歧化酶的檢測方法，僅在一些科研文獻(xiàn)中報道過鄰苯三酚法、黃嘌呤氧化酶法、放射免疫分析法(RIA)和四唑鹽法(WST-1法)等檢測方法，且均為手工法，加樣程序多，操作步驟復(fù)雜，不但耗時耗力，而且人為誤差也比較大，因此大大限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。在血清超氧化物歧化酶的檢測中有應(yīng)用到全自動生化分析儀，但是由于血清和精漿的組成和超氧化物歧化酶活性的差異，目前沒有文獻(xiàn)證明運(yùn)用全自動生化分析儀檢測血清中超氧化物歧化酶的試劑盒適用于檢測精漿中超氧化物歧化酶。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種精漿超氧化物歧化酶檢測試劑盒，該試劑盒在檢測精漿超氧化物歧化酶時，基質(zhì)效應(yīng)小、需要試劑量和樣本量少、結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度高，同時可與精漿生化的其他項(xiàng)目聯(lián)檢。本發(fā)明還提供了一種精漿超氧化物歧化酶檢測試劑盒的應(yīng)用，該試劑盒可以在全自動生化分析儀上應(yīng)用。技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述目的，如本發(fā)明所述的一種精漿超氧化物歧化酶，包括R1試劑、R2試劑、校準(zhǔn)品和凍干精漿質(zhì)控品；所述R1試劑為包含EDTA·2Na的Tris-HCl緩沖液；所述的R2試劑為包含鄰苯三酚的鹽酸溶液；所述校準(zhǔn)品為超氧化物歧化酶溶液；所述凍干精漿質(zhì)控品為定值的含超氧化物歧化酶的精漿凍干粉。其中，所述R1試劑中EDTA·2Na的濃度為0.5～5.0mmol/L，Tris的濃度0.01～0.06mol/L，pH為8.0～8.5。所述R2試劑中鄰苯三酚的濃度為0.5～2.5mmol/L，鹽酸的濃度為0.005～0.015mol/L。所述校準(zhǔn)品活性為30U/mL和90U/mL。所述超氧化物歧化酶溶液的溶劑為包含酶保護(hù)劑的磷酸鹽緩沖液，pH＝7.5～8.0，其中酶保護(hù)劑為D-海藻糖，濃度為0.15～0.5mol/L。選用pH＝7.5～8.0的磷酸鹽緩沖液時超氧化物歧化酶的活性最好；磷酸鹽緩沖液優(yōu)選由磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉配制，其中緩沖液中磷酸根濃度為0.01～0.1mol/L。所述凍干精漿質(zhì)控品在凍干前加入保護(hù)劑蔗糖、甘氨酸和NaCl，以及防腐劑山梨酸鉀，使蔗糖、甘氨酸、NaCl和山梨酸鉀的濃度分別為0.01～0.02mol/L、0.05～0.1mol/L、0.01～0.03mol/L和0.01～0.03g/dl，精漿已被檢定HBsAg、HCV抗體、HIV1+2抗體和梅毒均為陰性。所述凍干精漿質(zhì)控品的定值范圍通過以下步驟獲得：取凍干前精漿等體積的純化水復(fù)溶該凍干精漿質(zhì)控品，混勻后，分裝，-25～-20℃保存，備用；從-25～-20℃中每天取出1支分裝后的凍干精漿質(zhì)控品，室溫下自然解凍，混勻后用該試劑盒每天檢測1次，連續(xù)1個月，計算這些數(shù)據(jù)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、±2倍標(biāo)準(zhǔn)差，以平均值為該質(zhì)控品的靶值，平均值±2倍標(biāo)準(zhǔn)差為該質(zhì)控品的定值范圍。進(jìn)一步地，所述精漿超氧化物歧化酶檢測試劑盒包括R1試劑、R2試劑、2瓶校準(zhǔn)品、凍干精漿質(zhì)控品、說明書和內(nèi)襯。本發(fā)明所述的精漿超氧化物歧化酶檢測試劑盒在全自動生化分析儀上的應(yīng)用。所述應(yīng)用的檢測步驟為：(1)試劑和樣本的準(zhǔn)備：采集精液、液化，3000～10000r/min離心5～10min分離精漿，即刻用于檢測；試劑盒從2～8℃取出后，于室溫下平衡30～60min；其中優(yōu)選通過手淫法采集禁欲2～7天的精液于采樣杯中，置37℃水浴箱中液化；精漿量應(yīng)大于0.5mL，液化良好；不能立即檢測的精漿樣本于-20℃可保存1個月，避免反復(fù)凍融；(2)全自動生化分析儀的主、副波長分別為330～340nm、660～700nm，R1/樣本/R2加樣量按體積比40:1:12，范圍為(120～200μl):(3～5μl):(36～60μl)；優(yōu)選200/5/60μl；全自動生化分析儀選自邁瑞B(yǎng)S-380型全自動生化分析儀、勞拉Faith-1000型全自動生化分析儀、奧林巴斯AU400型全自動生化分析儀或科華310型全自動生化分析儀；(3)檢測方法：速率法，加入R1和樣品后混勻，37℃孵育5min，加入R2后混勻，37℃孵育2～5min，連續(xù)測定2～5min內(nèi)的吸光度變化，儀器自動計算吸光度變化率△A/min；(4)計算公式：樣本中SOD活性(U/mL)＝K×△A/min+B式中，K和B分別為校準(zhǔn)曲線的斜率和截距，通過全自動生化儀自動測定校準(zhǔn)品得到；△A/min通過全自動生化儀自動測定樣本得到。(5)取凍干前精漿等體積的純化水復(fù)溶凍干精漿質(zhì)控品，混勻后，分裝，-25～-20℃保存，備用；從-25～-20℃中取出一支分裝后的凍干精漿質(zhì)控品，在室溫下自然解凍、混勻，將此凍干精漿質(zhì)控品隨著樣本一起檢測，根據(jù)質(zhì)控品結(jié)果是否在定值范圍內(nèi)以判斷樣本結(jié)果是否在控。本發(fā)明中所使用的試劑和藥品均由市售可得。有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：1、本發(fā)明提供一種與全自動生化分析儀配套使用的檢測精漿中超氧化物歧化酶活性的試劑盒，該試劑盒在檢測精漿超氧化物歧化酶時，基質(zhì)效應(yīng)小、需要試劑量和樣本量少、結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度高，同時可與精漿生化的其他項(xiàng)目聯(lián)檢。2、該試劑盒中不僅提供雙校準(zhǔn)品，還配備定值的質(zhì)控品。校準(zhǔn)品是保證臨床檢測準(zhǔn)確一致的主要工具，同時也是量值有效傳遞的計量實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)控品是臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系的重要環(huán)節(jié)，同時也是實(shí)驗(yàn)室發(fā)出檢驗(yàn)報告的準(zhǔn)確性和可靠性的保證。試劑盒中的雙定標(biāo)液和質(zhì)控品可保證臨床檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和室間一致性。3、質(zhì)控品在凍干前，加入了一定比例的防腐劑和保護(hù)劑。保護(hù)劑、防腐劑和凍干過程都是確保質(zhì)控品中極易失活的超氧化物歧化酶穩(wěn)定的重要舉措。4、本發(fā)明提供了一種在全自動生化分析儀上配套使用的檢測精漿超氧化物歧化酶試劑盒的檢測方法，該方法操作簡便，適用于目前市場上所有的全自動生化分析儀，從而彌補(bǔ)了精漿全自動生化在檢測超氧化物歧化酶方面的空白。具體實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1精漿超氧化物歧化酶檢測試劑盒，包括如下成分：R1試劑：含EDTA·2Na和Tris-HCl的緩沖液，每升R1試劑中含有5.0mmolEDTA·2Na和0.01molTris，該溶液用濃鹽酸調(diào)整pH至8.00。R2試劑：含鄰苯三酚的鹽酸溶液，每升R2溶液中含有0.5mmol鄰苯三酚和0.015mol鹽酸。校準(zhǔn)品1為活性30U/mL的超氧化物歧化酶溶液，校準(zhǔn)品2為活性90U/mL的超氧化物歧化酶溶液，該超氧化物歧化酶溶液為包含酶保護(hù)劑D-海藻糖的磷酸鹽緩沖液，每升超氧化物歧化酶溶液中含0.15molD-海藻糖和0.01mol磷酸根，該磷酸鹽緩沖液由0.01mol/L磷酸二氫鈉溶液調(diào)節(jié)0.01mol/L磷酸氫二鈉溶液，使其pH值在7.5。凍干精漿質(zhì)控品在凍干前加入保護(hù)劑蔗糖、甘氨酸和NaCl，以及防腐劑山梨酸鉀，使蔗糖、甘氨酸、NaCl和山梨酸鉀的濃度分別為0.01mol/L、0.05mol/L、0.01mol/L和0.01g/dl，精漿已被檢定HBsAg、HCV抗體、HIV1+2抗體和梅毒均為陰性，混勻后分裝，凍干。該質(zhì)控品的定值方法：取凍干前精漿等體積的純化水復(fù)溶該凍干精漿質(zhì)控品，混勻后，分裝，-20℃保存，備用；從-20℃每天取出1支分裝后質(zhì)控品，室溫下自然解凍，混勻后用該試劑盒每天檢測1次，連續(xù)1個月，計算這些數(shù)據(jù)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、±2倍標(biāo)準(zhǔn)差，以平均值為該質(zhì)控品的靶值，平均值±2倍標(biāo)準(zhǔn)差為該質(zhì)控品的定值范圍。實(shí)施例2精漿超氧化物歧化酶檢測試劑盒，包括如下成分：R1試劑：含EDTA·2Na和Tris-HCl的緩沖液，每升R1試劑中含有0.5mmolEDTA·2Na和0.06molTris，該溶液用濃鹽酸調(diào)整pH至8.50。R2試劑：含鄰苯三酚的鹽酸溶液，每升R2溶液中含有2.5mmol鄰苯三酚和0.005mol鹽酸；校準(zhǔn)品1為活性30U/mL的超氧化物歧化酶溶液，校準(zhǔn)品2為活性90U/mL的超氧化物歧化酶溶液，該超氧化物歧化酶溶液為包含酶保護(hù)劑D-海藻糖的磷酸鹽緩沖液，每升超氧化物歧化酶溶液中含0.5molD-海藻糖和0.1mol磷酸根，該磷酸鹽緩沖液由0.1mol/L磷酸二氫鈉溶液調(diào)節(jié)0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液，使其pH值在8.0；凍干精漿質(zhì)控品在凍干前加入保護(hù)劑蔗糖、甘氨酸和NaCl，以及防腐劑山梨酸鉀，使蔗糖、甘氨酸、NaCl和山梨酸鉀的濃度分別為0.02mol/L、0.1mol/L、0.03mol/L和0.03g/dl，精漿已被檢定HBsAg、HCV抗體、HIV1+2抗體和梅毒均為陰性，混勻后分裝，凍干。該質(zhì)控品的定值方法：取凍干前精漿等體積的純化水復(fù)溶該凍干精漿質(zhì)控品，混勻后，分裝，-25℃保存，備用；從-25℃每天取出1支分裝后質(zhì)控品，室溫下自然解凍，混勻后用該試劑盒每天檢測1次，連續(xù)1個月，計算這些數(shù)據(jù)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、±2倍標(biāo)準(zhǔn)差，以平均值為該質(zhì)控品的靶值，平均值±2倍標(biāo)準(zhǔn)差為該質(zhì)控品的定值范圍。實(shí)施例3精漿超氧化物歧化酶檢測試劑盒，包括如下成分：R1試劑：含EDTA·2Na和Tris-HCl的緩沖液，每升R1試劑中含有2.5mmolEDTA·2Na和0.03molTris，該溶液用濃鹽酸調(diào)整pH至8.20。R2試劑：含鄰苯三酚和鹽酸，每升R2溶液中含有1.5mmol鄰苯三酚和0.01mol鹽酸。校準(zhǔn)品1為活性30U/mL的超氧化物歧化酶溶液，校準(zhǔn)品2為活性90U/mL的超氧化物歧化酶溶液，該超氧化物歧化酶溶液為包含酶保護(hù)劑D-海藻糖的磷酸鹽緩沖液，每升超氧化物歧化酶溶液中含0.3molD-海藻糖和0.05mol磷酸根，該磷酸鹽緩沖液由0.05mol/L磷酸二氫鈉溶液調(diào)節(jié)0.05mol/L磷酸氫二鈉溶液，使其pH值在7.8；凍干精漿質(zhì)控品在凍干前加入保護(hù)劑蔗糖、甘氨酸和NaCl，以及防腐劑山梨酸鉀，使蔗糖、甘氨酸、NaCl和山梨酸鉀的濃度分別為0.015mol/L、0.075mol/L、0.02mol/L和0.02g/dl，精漿已被檢定HBsAg、HCV抗體、HIV1+2抗體和梅毒均為陰性，混勻后分裝，凍干。該質(zhì)控品的定值方法：取凍干前精漿等體積的純化水復(fù)溶該凍干精漿質(zhì)控品，混勻后，分裝，-20℃保存，備用；從-20℃每天取出1支分裝后質(zhì)控品，室溫下自然解凍，混勻后用該試劑盒每天檢測1次，連續(xù)1個月，計算這些數(shù)據(jù)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、±2倍標(biāo)準(zhǔn)差，以平均值為該質(zhì)控品的靶值，平均值±2倍標(biāo)準(zhǔn)差為該質(zhì)控品的定值范圍。實(shí)施例4實(shí)施例1-3的精漿超氧化物歧化酶檢測試劑盒各成分采用如下步驟制得，其中不同實(shí)施例的各物質(zhì)的質(zhì)量或體積根據(jù)最終的濃度分別計算配制：1、R1的制備工藝方法稱定三羥甲基氨基甲烷(Tris)、二水合乙二胺四乙酸二鈉，加適量純化水溶解，然后用鹽酸調(diào)pH值為8.0～8.5，定容，混勻后分裝，貼標(biāo)簽，檢驗(yàn)，置于2～8℃保存。2、R2的制備工藝方法精密量取鹽酸置燒杯中，加入純化水中，攪拌至混勻，再將稱定好的焦性沒食子酸(鄰苯三酚)加入燒杯中，用配好的鹽酸溶液溶解、定容、混勻，分裝，貼標(biāo)簽，檢驗(yàn)，置于2～8℃避光保存。3、校準(zhǔn)品的制備工藝方法3.1稱定二水合磷酸二氫鈉、D-海藻糖，加純化水?dāng)嚢柚寥芙?，得到磷酸二氫鈉溶液，置于2～8℃保存。3.2稱定十二水合磷酸氫二鈉、D-海藻糖，加純化水?dāng)嚢柚寥芙?，得到磷酸氫二鈉溶液，置于2～8℃保存。3.3用磷酸二氫鈉溶液調(diào)磷酸氫二鈉溶液，使其pH在7.5-8.0，得到校準(zhǔn)品的溶劑，置于2～8℃保存。3.4精密量取0.1mL7500U/mL超氧化物歧化酶溶液置燒杯中，加24.9mLpH7.5～8.0磷酸鹽緩沖液攪拌至混勻，得到30U/mL超氧化物歧化酶校準(zhǔn)品1，置于2～8℃避光保存。3.5精密量取0.3mL7500U/mL超氧化物歧化酶溶液置燒杯中，加24.7mLpH7.5～8.0磷酸鹽緩沖液攪拌至混勻，得到90U/mL超氧化物歧化酶校準(zhǔn)品2，置于2～8℃避光保存。4、質(zhì)控品的制備工藝方法收集已完全液化且HCV抗體、HIV1+2抗體、HBsAg和梅毒檢測均為陰性的男性新鮮精液樣本，離心后取上清液、混合，加入NaCl、蔗糖、甘氨酸和山梨酸鉀，攪拌、溶解、混勻、分裝、凍干。真空冷凍干燥機(jī)的凍干步驟：設(shè)置凍干程序，如表1。啟動真空冷凍干燥機(jī)，-30℃預(yù)凍6h后，啟動凍干程序。凍干結(jié)束，放氣取出，封蓋，得到干粉狀的精漿超氧化物歧化酶質(zhì)控品。表1凍干精漿質(zhì)控品凍干程序溫度(℃)時間(min)-20900-15360-10360-51800180101801518020249實(shí)施例5用精漿超氧化物歧化酶檢測試劑盒檢測精漿中超氧化物歧化酶活性，具體步驟為：一、樣本準(zhǔn)備及要求手淫法采集禁欲7天的精液于采樣杯中，置37℃水浴箱中液化，3000r/min離心10min分離精漿，即刻用于檢測。精漿量0.8mL，液化良好。不能立即檢測的精漿樣本于-20℃可保存1個月，避免反復(fù)凍融。二、試劑準(zhǔn)備選取實(shí)施例1至3中任意一組試劑盒。將R1、R2和校準(zhǔn)品從2℃取出，室溫下平衡30min。三、檢測方法1、基本參數(shù)：采用邁瑞B(yǎng)S-380型全自動生化分析儀，主/副波長：340nm/660nm；溫度：37℃；方法：速率法；反應(yīng)方向：上升2、操作步驟3、計算公式：樣本中SOD活性(U/mL)＝K×△A/min+B式中，K和B分別為校準(zhǔn)曲線的斜率和截距，通過全自動生化儀自動測定校準(zhǔn)品得到；△A/min通過全自動生化分析儀自動測定樣本得到。4、質(zhì)控品的檢測：取凍干前精漿等體積的純化水復(fù)溶該凍干精漿質(zhì)控品，混勻后，分裝，-20℃保存，備用；從-20℃中取出一支分裝后的凍干精漿質(zhì)控品，在室溫下自然解凍、混勻，將此凍干精漿質(zhì)控品隨著樣本一起檢測，根據(jù)質(zhì)控品結(jié)果是否在定值范圍內(nèi)以判斷樣本結(jié)果是否在控。四、該試劑盒的主要性能指標(biāo)1.試劑空白吸光度變化率(ΔA/min)≤0.2；2.線性范圍：[5～160]U/mL，r≥0.990；3.重復(fù)性：CV≤8％；4.批間差：R≤10％；5.準(zhǔn)確度(相對偏差)：B≤±10％。五、報告結(jié)果樣本檢測結(jié)束后，以匯總報告的形式輸出。六、參考區(qū)間根據(jù)正常生育男性精漿超氧化物歧化酶檢測結(jié)果，以第5百分位數(shù)確定正常參考值區(qū)間，精漿超氧化物歧化酶的參考區(qū)間≥27.26U/mL。七、臨床適用癥狀本試劑盒用于體外檢測精漿中超氧化物歧化酶(SOD)的活性。精漿中的SOD能有效地清除O2-類自由基，對抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。在維護(hù)精液中的抗氧化系統(tǒng)和抗氧化產(chǎn)生的損傷方面起著關(guān)鍵性的作用。如果樣本中SOD活性過低，無法有效地清除O2-類自由基，可能導(dǎo)致精子功能受損，進(jìn)而引起不育。實(shí)施例6用精漿超氧化物歧化酶檢測試劑盒檢測精漿中超氧化物歧化酶活性，具體步驟為：一、樣本準(zhǔn)備及要求手淫法采集禁欲2天的精液于采樣杯中，置37℃水浴箱中液化，10000r/min離心5min分離精漿，即刻用于檢測。精漿量3mL，液化良好。不能立即檢測的精漿樣本于-20℃可保存1個月，避免反復(fù)凍融。二、試劑準(zhǔn)備選取實(shí)施例1至3中任意一組試劑盒。將R1、R2和校準(zhǔn)品從8℃取出，室溫下平衡60min。三、檢測方法1、基本參數(shù)：采用奧林巴斯AU400型全自動生化分析儀，主/副波長：330nm/700nm；溫度：37℃；方法：速率法；反應(yīng)方向：上升2、操作步驟3、計算公式：樣本中SOD活性(U/mL)＝K×△A/min+B式中，K和B分別為校準(zhǔn)曲線的斜率和截距，通過全自動生化儀自動測定校準(zhǔn)品得到；△A/min通過全自動生化分析儀自動測定樣本得到。4、質(zhì)控品的檢測：取凍干前精漿等體積的純化水復(fù)溶該凍干精漿質(zhì)控品，混勻后，分裝，-25℃保存，備用；從-25℃中取出一支分裝后的凍干精漿質(zhì)控品，在室溫下自然解凍、混勻，將此凍干精漿質(zhì)控品隨著樣本一起檢測，根據(jù)質(zhì)控品結(jié)果是否在定值范圍內(nèi)以判斷樣本結(jié)果是否在控。四、該試劑盒的主要性能指標(biāo)1.試劑空白吸光度變化率(ΔA/min)≤0.2；2.線性范圍：[5～160]U/mL，r≥0.990；3.重復(fù)性：CV≤8％；4.批間差：R≤10％；5.準(zhǔn)確度(相對偏差)：B≤±10％。五、報告結(jié)果樣本檢測結(jié)束后，以匯總報告的形式輸出。六、參考區(qū)間根據(jù)正常生育男性精漿超氧化物歧化酶檢測結(jié)果，以第5百分位數(shù)確定正常參考值區(qū)間，精漿超氧化物歧化酶的參考區(qū)間≥27.26U/mL。七、臨床適用癥狀本試劑盒用于體外檢測精漿中超氧化物歧化酶(SOD)的活性。精漿中的SOD能有效地清除O2-類自由基，對抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。在維護(hù)精液中的抗氧化系統(tǒng)和抗氧化產(chǎn)生的損傷方面起著關(guān)鍵性的作用。如果樣本中SOD活性過低，無法有效地清除O2-類自由基，可能導(dǎo)致精子功能受損，進(jìn)而引起不育。試驗(yàn)例1采用實(shí)施例5的檢測方法，采用實(shí)施例1所制備的試劑盒確認(rèn)該試劑盒的線性范圍，線性范圍確認(rèn)：取超氧化物歧化酶標(biāo)準(zhǔn)液，配制成理論活性為5、10、20、40、60、80、100、120、140、150、160U/mL超氧化物歧化酶標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，相應(yīng)活性的標(biāo)準(zhǔn)品放入樣本盤，儀器先定標(biāo)，主/副波長：340/660nm，光徑1cm下，每個活性測試3次，分別求出每個活性檢測結(jié)果的均值。以理論活性為自變量，以每個理論活性檢測結(jié)果均值為因變量作出線性圖，求出線性回歸方程，并計算線性回歸的相關(guān)系數(shù)。用上述方法中理論活性代入線性回歸方程，計算理論活性的計算值及檢測均值與計算值的相對偏差，結(jié)果如表2。表2試劑盒的線性范圍檢測結(jié)果由表2可知，通過該試驗(yàn)例說明試劑盒在[5-160]U/mL內(nèi)檢測結(jié)果準(zhǔn)確，因?yàn)樵撛噭┖械膮⒖紖^(qū)間為：≥27.26U/mL，說明該試劑盒在檢測正常和異常樣本的結(jié)果方面都是可靠的。同時采用實(shí)施例2和3的試劑盒或者實(shí)施例6的檢測方法，結(jié)果與上述類似。試驗(yàn)例2采用實(shí)施例5的檢測方法，分別采用實(shí)施例1～3所制備的試劑盒進(jìn)行試劑盒的重復(fù)性檢測，重復(fù)性檢測方法：包括樣本收集、準(zhǔn)備，然后上機(jī)測試，分別用試劑盒測定同一份精漿，重復(fù)檢測10次，取平均值按下列公式計算重復(fù)性變異系數(shù)(CV)，式中：重復(fù)檢測10次所得結(jié)果的平均值；S：重復(fù)檢測10次所得結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差；CV：變異系數(shù)；其結(jié)果如表3所示。表3試劑盒的重復(fù)性檢測結(jié)果由表3的結(jié)果可知，該試劑盒檢測結(jié)果的精密度較好，同時采用實(shí)施例6的檢測方法，結(jié)果與上述類似。試驗(yàn)例3采用實(shí)施例5的檢測方法，分別采用實(shí)施例1～3所制備的試劑盒進(jìn)行試劑盒的準(zhǔn)確性檢測，準(zhǔn)確度使用分別試劑盒檢測質(zhì)控品，重復(fù)檢測3次，計算測試結(jié)果的平均值(M)，按下列公式計算相對偏差(B)，式中：M：測試結(jié)果的平均值；T：質(zhì)控品定值；結(jié)果如表4。表4.試劑盒準(zhǔn)確度的檢測結(jié)果由表3的結(jié)果可知，試劑盒的測試準(zhǔn)確度比較好，同時采用實(shí)施例6的檢測方法，結(jié)果與上述類似。試驗(yàn)例4基質(zhì)效應(yīng)的評估采用實(shí)施例5的檢測方法以及實(shí)施例2的試劑盒，選擇1個精漿樣本，按照表5的方法制備基礎(chǔ)樣本，分析樣本1，分析樣本2和分析樣本3；表5基質(zhì)效應(yīng)樣本的制備方法將制備的樣本在邁瑞B(yǎng)S380全自動生化分析儀上重復(fù)檢測3次，對結(jié)果進(jìn)行分析，如表6所示。表6基質(zhì)效應(yīng)樣本檢測結(jié)果通過表6可知，該試劑盒的回收率差值(≤±10％)和比例系統(tǒng)誤差(≤5％)都符合要求，說明該試劑盒的基質(zhì)效應(yīng)小。同時采用實(shí)施例1和3的試劑盒或者實(shí)施例6的檢測方法，結(jié)果與上述類似。試驗(yàn)例5與其他項(xiàng)目聯(lián)檢采用實(shí)施例5的檢測方法以及使用實(shí)施例1的試劑盒對一精漿樣本中超氧化物歧化酶活性進(jìn)行檢測；同時使用南京欣迪生物藥業(yè)工程有限責(zé)任公司已上市的四個全自動試劑盒：精漿果糖定量檢測試劑盒(果糖脫氫酶法)(注冊證號：蘇食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2014第2400712號)(簡稱FDH)、精漿鋅定量檢測試劑盒(PAN法)(注冊證號：蘇食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2014第2400711號)(簡稱ZN)、精漿α-葡糖苷酶定量檢測試劑盒(速率法)(注冊證號：蘇食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2014第2400709號)(簡稱TAG)和精漿γ-L-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶定量檢測試劑盒(速率法)(注冊證號：蘇食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2014第2400710號)(簡稱GGT)在全自動生化分析儀上對該精漿樣本中精漿果糖、精漿鋅、精漿α-葡糖苷酶和精漿γ-L-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶進(jìn)行檢測，檢測方法參考四種試劑盒的使用說明書。在全自動生化分析儀上將精漿超氧化物歧化酶檢測項(xiàng)目與精漿果糖、精漿鋅、精漿α-葡糖苷酶和精漿γ-L-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶項(xiàng)目同時申請檢測同一精漿樣本，重復(fù)10次，檢測結(jié)果如表7：表7項(xiàng)目聯(lián)檢的檢測結(jié)果由表7的結(jié)果能看出，該試劑盒與其他幾個試劑盒同時檢測同一樣本，該試劑盒的重復(fù)性滿足性能指標(biāo)中要求；同時采用實(shí)施例2和3的試劑盒或者實(shí)施例6的檢測方法，結(jié)果與上述類似。結(jié)論：通過以上的試驗(yàn)結(jié)果表明，該試劑盒在檢測精漿超氧化物歧化酶活性時，基質(zhì)效應(yīng)小、結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度高，同時可與精漿生化的其他項(xiàng)目聯(lián)檢；同時R1/樣本/R2最大加樣量只需為200/5/60μl，所以需要試劑量和樣本量少。當(dāng)前第1頁1 2 3