本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學及生物檢測領域，具體涉及外周游離外泌體在制備液態(tài)活檢腫瘤診斷試劑中的應用。

背景技術：

惡性腫瘤是危害我國人民生命健康的第一大疾病。隨著我國現(xiàn)代化建設不斷加快和日益嚴重的環(huán)境污染，癌癥的發(fā)病率還呈明顯上升趨勢。

活檢術是臨床用來對可疑腫塊進行病理學確診的最常用方法，然而從原位腫瘤不同部位及轉移灶的穿刺組織的基因組學研究發(fā)現(xiàn)腫瘤存在顯著的異質性，而該技術僅可以向患者提供疾病進展單一方面的信息。而且，腫瘤組織活檢方法是侵入性的，會對患者造成侵入性創(chuàng)傷，對患者而言非常疼痛且費用昂貴。至于CT、B超等常規(guī)影像學檢查，更加只能從腫瘤大小與性質上進行判別。顯然，目前的檢查方式無法滿足更精準的個體化治療需求。因此，開發(fā)研究新的、能早期的、方便的、能監(jiān)控的腫瘤無創(chuàng)診斷新方法在我國有重大需求。

液態(tài)活檢是一種非侵入式的無創(chuàng)血液測試，能監(jiān)測腫瘤或轉移灶釋放到血液的循環(huán)腫瘤細胞(CTC)，循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)碎片或者外泌體，是檢測腫瘤、輔助治療的突破性技術。

其中，體液活檢檢測循環(huán)腫瘤細胞(Circulating Tumor Cells,CTC)或循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是目前被評價最有前景臨床轉化的腫瘤監(jiān)測方法。但是，由于外周血中CTCs數(shù)量稀少，且具有異質性和易聚集成團等特 點，目前的體液活檢CTCs檢測方法存在假陽性或假陰性較高的問題亟待解決。同樣，由于血液中多數(shù)循環(huán)DNA并非起源于腫瘤，外周血中ctDNA的數(shù)量也非常少，而用于痕量DNA分子的檢測和定量分析的現(xiàn)代DNA測序技術的敏感性極高，從而增加了檢測的非特異性。而且，目前最靈敏的ctDNA檢測技術，比如BEAMing等技術，依賴的都是已經非常明確的待測突變，但是這些突變信息還是只能通過組織活檢的方法才能夠獲得。也就是說，我們只能先進行組織活檢，對標本進行測序，發(fā)現(xiàn)突變位點信息之后，根據(jù)這些突變信息設計出特異性的探針，然后才能夠進行ctDNA液體活檢。不過也可以像Rosenfeld等人那樣進行全外顯子組測序。這就不需要預先知道突變信息，但是目前進行這種測序的成本非常高，還不太現(xiàn)實。此外，ctDNA數(shù)量變異度非常大(早期和晚期腫瘤釋放的ctDNA數(shù)量差異非常大)，并且有非常大的個體差異，ctDNA檢測技術對于早期腫瘤患者的檢測效果并不太好。因此，ctDNA檢測技術目前仍不太適合應用于臨床。

癌細胞在生殖和轉移過程中會分泌外泌體(Exosome)。外泌體是一種穿梭在細胞間具有雙分子層的納米級囊泡。外泌體可由多種細胞分泌到細胞外，不同細胞分泌的外泌體可以具有類似的或不同的特性和生物學功能。腫瘤細胞也能釋放外泌體，且腫瘤在生長過程中會不斷地將外泌體釋放到細胞外影響腫瘤微環(huán)境，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中所扮演的角色已經越來越受關注。外泌體不僅在體液如血清、血漿、尿液中能穩(wěn)定存在，還能選擇性的包裹/釋放其細胞中的遺傳信息(miRNA、蛋白等)，因此提取細胞外的外泌體用于疾病、腫瘤等的診斷、監(jiān)控有巨大的應用潛能。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供外周游離外泌體在制備液態(tài)活檢腫瘤診斷試劑中的應用，具體為外周血中的游離外泌體的特異性標志物在制備腫瘤診斷試劑中的應用，利用腫瘤診斷試劑，提取血漿或血清中的總游離外泌體、分選純化出腫瘤相關外泌體、再檢測外泌體的特異性標志物的表達，來進行腫瘤診斷與監(jiān)控，尤其是進行腫瘤高危人群的篩查、早期診斷或患者的預后評估。

本發(fā)明的以上目的通過以下技術方案實現(xiàn)：

本發(fā)明的一個方面在于提供外周血中的游離外泌體的特異性標志物在制備腫瘤診斷試劑中的應用。

就本發(fā)明的上述應用，所述特異性標志物優(yōu)選為CD9。

就本發(fā)明的上述應用，所述診斷試劑通過檢測被試者外周血中游離外泌體的特異性標志物CD9表達，并與健康對照組的平均水平相比較，以此來判斷被試者的腫瘤患病風險。

就本發(fā)明的上述應用，所述腫瘤診斷試劑包括：用于腫瘤高危人群的篩查的試劑、用于腫瘤早期診斷的試劑、或者用于腫瘤患者的預后評估的試劑。

本發(fā)明的另一個方面在于提供一種用于腫瘤診斷的試劑盒，包括：用于腫瘤高危人群的篩查的試劑盒、用于腫瘤早期診斷的試劑盒、或者用于腫瘤患者的預后評估的試劑盒，其包含檢測外周血中的游離外泌體的特異性標志物的試劑。

就本發(fā)明的上述試劑盒，所述特異性標志物優(yōu)選為CD9。

在本發(fā)明上述試劑盒的一些實施方案中，所述檢測外周血中的游離外泌體的特異性標志物的試劑包括：

(1)用于從外周血中分離總外泌體的總外泌體分離試劑；

(2)用于從所述總外泌體中提純腫瘤來源外泌體的上皮細胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)抗體標記分離磁珠(簡稱為EpCAM分離磁珠)；

(3)用于檢測所述腫瘤來源外泌體中特異性標志物表達的Elisa檢測試劑。

在本發(fā)明上述試劑盒的一些實施方案中，所述Elisa檢測試劑包括能夠結合、吸附和/或偶聯(lián)所述特異性標志物的抗體。

在本發(fā)明上述試劑盒的一些實施方案中，所述Elisa檢測試劑包括：CD9一抗和HRP酶標二抗。

在本發(fā)明上述試劑盒的一些實施方案中，所述Elisa檢測試劑還包括用于Elisa檢測的常規(guī)試劑。

在本發(fā)明上述試劑盒的一些實施方案中，所述用于Elisa檢測的常規(guī)試劑包括：酶標板、封閉液、TMB顯色液、終止溶液。通常，所述用于Elisa檢測的常規(guī)試劑還包括有適量的PBS溶液和PBST溶液。其中，所述酶標板優(yōu)選高結合力酶標板。所述封閉液優(yōu)選含5％脫脂牛奶的PBST溶液。

在本發(fā)明上述試劑盒的一些具體的實施方案中，所述Elisa檢測試劑中，所述CD9一抗的濃度為0.0000373～0.0003733μg/μl，所述HRP酶標二抗的濃度為0.0004～0.00004μg/μl。

在本發(fā)明的所有方面，如果適用的話，優(yōu)選的是，所述癌癥是腎癌、肺癌、食管癌、乳腺癌、胃癌或卵巢癌等。在一個實施方案中，優(yōu)選腎癌，包括原發(fā)性腎癌、腎透明細胞癌、轉移性腎癌、或繼發(fā)性腎癌。

本發(fā)明中，以腎癌為例，首先，使用總外泌體分離試劑從血漿樣本中提取外泌體，并且使用EpCAM分離磁珠選擇性地提純出上皮細胞粘附分子陽性的腫瘤來源外泌體；然后，使用Elisa檢測試劑測定CD9在腫瘤來源外泌體以及對照中的表達水平，發(fā)現(xiàn)：腎透明細胞癌患者中的外泌體CD9的表達水平明顯高于對照組健康個體中的外泌體CD9的水平(P<0.001)；ROC曲線分析顯示使用外周游離exosome CD9來區(qū)別腎透明細胞癌患者和對照組健康人的敏感性為93％，特異性為97％。因此，外周游離exosome CD9，作為腎透明細胞癌中的潛在的生物標記物，可作為一種臨床檢測腫瘤的有效工具。因此，本發(fā)明可以檢測各人群外周游離外泌體中CD9的表達水平，從而診斷腎癌患者的患病風險，篩查高危人群，并對腎癌患者做出早期、快速的無創(chuàng)性診斷。本發(fā)明對腎癌診斷特異性好，操作簡單，不僅可用于腎癌的早期診斷，而且可以用于腎癌患者的大規(guī)模篩查和患病風險的預測，為腎癌的早期診斷和預測提供了強有力的技術支持，具有深遠的臨床意義和推廣性。

同樣的實驗以及結果在肺癌、食管癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌患者中進行和證實。由于腫瘤細胞在其發(fā)生發(fā)展中能釋放大量的外泌體，而且釋放的量高于正常細胞，所以檢測腫瘤的外泌體能夠先于檢測其他方法如CTC。通過EpCAM抗體的磁珠篩選方法，能很好的從總外泌體中篩出與腫瘤相關的外泌體，再通過檢查腫瘤相關的外泌體中CD9的表達，可以進一步提高診斷特異性。因此，本發(fā)明可以檢測各人群外周游離外泌體中CD9的表達水平，從而診斷腫瘤患者的患病風險，篩查高危人群，并對腫瘤患者做出早期、快速的無創(chuàng)性診斷。本發(fā)明對腫瘤診斷特異性好，操作簡單，不僅可用于腫瘤的早期診斷，而且可以用于腫瘤患者的大規(guī)模篩查和患病風險的預測，為腫瘤的早期診斷和預測提供了強有力的技術支持，具有深遠的臨床意義和推廣性。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益的技術效果：

(1)由于腫瘤細胞釋放的外泌體在數(shù)量上遠多于CTC，更易獲取和富集；在形式上能夠有效保護核酸類物質，克服了ctDNA在血液中容易降解的問題，因此，本發(fā)明中的外周游離外泌體中CD9作為一種新型生物標記物，不僅非侵入性、易于檢測，而且穩(wěn)定、定量精確，大大提高疾病診斷試劑的敏感性和特異性。

(2)腫瘤在生長過程中會不斷地將外泌體釋放到周圍環(huán)境中去，外泌體可以保存更長時間，并且腫瘤相關外泌體中CD9足夠穩(wěn)定，通過在血液中分離腫瘤相關外泌體并根據(jù)其中CD9表達來進行診斷，克服了直接利用血液提取分子進行診斷時血液中非檢測物質的影響，而且，采用EpCAM分離磁珠獲得上皮細胞粘附因子陽性的外泌體，準確性和特異性非常高，并在一定程度上避免非上皮細胞源性的二次干擾，檢驗結果更加真實、精確，從而有助于腫瘤的早期診斷和預后判斷。

(3)并非所有在組織或外周血中過表達的CD9都能被裝載到分泌的腫瘤相關外泌體中，本發(fā)明中的診斷試劑通過總游離外泌體的提取、腫瘤相關外泌體的分選純化、外泌體的特異性標志物CD9表達的檢測，完成對外周血中腫瘤來源的外泌體中CD9表達的檢測，敏感性高、特異性好。

(4)本發(fā)明中，通過檢測外周血外泌體來源的CD9的表達來診斷腫瘤是否發(fā)生的試劑盒，是一種系統(tǒng)、全面的診斷和監(jiān)測試劑盒，將其用于腫瘤患者的輔助診斷，不但能更好的對腫瘤患者進行診斷，提早治療，而且使得檢驗結果更加靈敏，特異，還有助于反映腫瘤患者的疾病狀態(tài)，為臨床醫(yī)生快速準確掌握患者病情、及時采取更具個性化的防治方案提供支持。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例2的步驟(一)所得產物的電子顯微鏡照片。

圖2a是本發(fā)明實施例2的步驟(一)所得產物在明場圖；圖2b是對本發(fā)明實施例2的步驟(一)所得產物進行的熒光圖。

圖3a和圖3b是對本發(fā)明實施例2的步驟(一)所得產物中EpCAM表達進行流式細胞儀分析的檢測結果。

圖4是對本發(fā)明實施例2的步驟(一)所得產物中的蛋白Hsp70、Tsg101表達的免疫印跡(Western Blot)檢測結果。

圖5是30例腎癌患者和正常中外周游離exosome的CD9檢測的比較與統(tǒng)計分析。

圖6是采用ROC曲線分析來評價使用外周游離exosome CD9檢測來作為檢測腎透明細胞癌的診斷工具的可行性。

圖7是30例肺癌患者和正常中外周游離exosome的CD9檢測的比較與統(tǒng)計分析。

圖8是30例食管癌患者和正常中外周游離exosome的CD9檢測的比較與統(tǒng)計分析。

圖9是30例乳腺癌患者和正常中外周游離exosome的CD9檢測的比較與統(tǒng)計分析。

圖10是30例胃癌患者和正常中外周游離exosome的CD9檢測的比較與統(tǒng)計分析。

圖11是30例卵巢癌患者和正常中外周游離exosome的CD9檢測的比較與統(tǒng)計分析。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，可采用本領域中的常規(guī)方法，例如參考《分子克隆實驗指南》(第三版，紐約，冷泉港實驗室出版社，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)或按照供應商所建議的條件。

下列實施例中未特別說明的各種儀器和試劑均為本領域熟知的市售產品，可通過商業(yè)途徑獲得。在下列實施例中列出的所使用的具體材料及其來源，僅僅是示例性的，并不意圖限制本發(fā)明，與如下組織、細胞、試劑和儀器的類型、型號、品質、性質或功能相同或相似的材料均可以用于實施本發(fā)明。

實施例1制備檢測試劑盒

以1m l的血漿為對象：

(1)200μl總外泌體分離試劑(Total Exosome Isolation,Invitrogen)；

(2)20μl EpCAM分離磁珠(EpCAM beads,Invitrogen)、3ml的1×PBS；

(3)Elisa檢測試劑盒，包括：

100μl 1:5000稀釋的CD9一抗(proteintech)(原始濃度56μg/150μl，1:5000稀釋后濃度為0.0000746μg/μl)；

100μl 1:10000稀釋的HRP酶標二抗(sigma)(原始濃度0.4μg/μl，1:10000稀釋后濃度為0.00004μg/μl)；

高結合力酶標板；200μl含5％脫脂牛奶的PBST做封閉液；100μl TMB顯色液；100μl終止溶液；200μl的1×PBS；12*200μl的1×PBST。

其中，PBS是指磷酸緩沖鹽溶液，PBST是在PBS中含有Tween-20，Tween-20在整個PBST溶液中的質量百分比為0.05％。

實施例2采用實施例1的試劑盒檢測腎癌患者外周游離外泌體的CD9表達

(一)腫瘤外泌體的提取與純化

①得到患者知情及倫理的同意下，收集腫瘤患者病人(病理活檢已經確認為腎透明細胞癌)術前的血液標本10ml于采血管中，在4℃、300g的離心條件下離心10分鐘，分離以去除血液中的細胞，然后得到1ml上層血漿。

②將血漿在4℃、10000g的離心條件下離心30分鐘，分離以去除細胞器及其他雜質，得到上清液。

③將上清液移入新的離心管中，并向其中加入200μl exosome抽提液(Total Exosome Isolation,Invitrogen)混合，震蕩均勻后，4℃孵育過夜(6～16小時均可)，然后，將孵育后的混合液在4℃、10000g離心1小時，移除上層清液后，得到沉淀于該離心管底部的血漿總外泌體(exosome)。

④用0.5ml的1×PBS將③所得血漿總外泌體進行重懸，得到總外泌體的重懸液。

⑤將20μl抗體磁珠(EpCAM beads,Invitrogen)和1ml的1×PBS在另一新的離心管中混勻后上磁力架吸附2分鐘，移除管內液體，這樣在該離心管中吸附有EpCAM抗體標記磁珠。

⑥將上述④所得的0.5ml總外泌體的重懸液加入到上述⑤所得的吸附有EpCAM抗體標記磁珠的離心管中，4℃孵育過夜(6～16小時均可)。

⑦將⑥中的離心管置于磁力架，吸附2分鐘，移除管內液體。

⑧再向上述⑦中的離心管中加入1ml的1×PBS，置于磁力架，吸附2分鐘，移除管內液體；重復一次；獲得磁珠結合的Epcam陽性(腫瘤細胞來源)的exosome。

(二)外周游離腫瘤外泌體的ELisa檢測

①將上述步驟(一)獲得的腫瘤外泌體用200μl 1×PBS將其重懸，100μl/孔加至高結合力酶標板包被。4℃過夜(6～16小時均可)孵化后棄孔內液體，200μl 1×PBST(1×PBS含0.05％Tween)洗板3次，每次浸泡1-2min，200μl/孔。移除上清液體。

②將200μl含5％脫脂牛奶的PBST加入孔內，37℃孵化2h進行封閉后，移除上清液體。并用200μl 1×PBST洗板3次，每次浸泡1-2min，移除上清液體。

③用100μl的1:5000稀釋CD9一抗(proteintech)加入孔中，37℃孵化1h后移除上清。200μl 1×PBST洗板3次，每次浸泡1-2min，移除上清液體。

④用100μl的1:10000稀釋HRP酶標二抗(sigma)加入孔中，37℃孵化1h后移除上清。200μl 1×PBST洗板3次，每次浸泡1-2min，移除上清液體。

⑤將100μl TMB顯色液加入孔中，避光顯色15-20min，若顏色偏淡，可放在37℃顯色，不超過30min。

⑥將100μl終止溶液加入孔中，液體顏色由藍色變?yōu)辄S色。立即把酶標版放入酶聯(lián)儀中，在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。

(三)產物的表征和鑒定

1、將上述步驟(一)獲得的產物(即，磁珠結合的腫瘤細胞來源的exosome)用1ml低pH(pH值為5-6)的TE緩沖液洗脫磁珠上結合的細胞，并使用電子顯微鏡觀察。電子顯微鏡觀察到的照片如圖1所示，可以發(fā)現(xiàn)：從磁珠上洗脫下的細胞為50-100nm大小的雙分子層膜結構泡體，形態(tài)學和其他文獻報道的外泌體一致。

2、免疫印跡(Western Blot)檢測蛋白Hsp70、Tsg101的存在

具體檢測步驟如下：

(1)將上述步驟(一)獲得的產物(即，磁珠結合的腫瘤細胞來源的exosome)用1ml的1×PBS重懸，得到腫瘤exosome重懸液，加入1ml裂解液，提取總蛋白。

(2)制作BSA標準曲線，加入1ml的考馬斯藍，化學分光儀上檢測exosome蛋白含量。

(3)制作10％及4％的梯度膠，加入足夠的緩沖液，每孔上樣50ug的exosome總蛋白。

(4)在電壓40V～60V進行4～5h的電泳。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉膜。

(5)轉膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預先準備好的Western洗滌液(P0023C)中，漂洗1～2分鐘，以洗去膜上的轉膜液。后加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉60分鐘。

(6)封閉結束后，立即加入稀釋好的一抗(Hsp70,Tsg101)。4℃緩慢搖動孵育過夜后，回收一抗，Western洗滌液洗滌3次。

(7)按照適當比例用Western二抗稀釋液(P0023D)稀釋辣根過氧化物酶(HRP) 標記的二抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時，回收二抗，Western洗滌液洗滌3次。

(8)膜上蛋白面加入ECL液進行顯影。

檢測結果如圖4所示，可以發(fā)現(xiàn)：在實施例2步驟(一)所得產物中檢測到了exosome表面特有的蛋白Hsp90、Tsg101的表達，因此，從分子特性上說明了實施例2步驟(一)所得產物為exosome。

3、免疫熒光檢測蛋白CD9的存在

將上述步驟(一)獲得的產物(即，磁珠結合的腫瘤細胞來源的exosome)用1ml的1×PBS重懸，得到腫瘤exosome重懸液，加入CD9一抗和Alexa二抗進行4℃閉關孵育1小時后，磁力架上用1ml的1×PBS清洗3次后，20μl滴入載玻片進行熒光觀察。

免疫熒光檢測結果如圖2b所示，為方便對照，一并附上上述步驟(一)獲得的產物在明場(未加熒光)的圖2a。圖2a中顯示信號和背景均為黃色，圖2b中顯示信號為紅色，顯示背景為藍色。由圖2a和圖2b對對照，可以發(fā)現(xiàn)：圖2b中，在與圖2a中所示的磁珠復合物所在位置相對應的位置，發(fā)出紅色熒光，這意味著磁珠復合物與熒光CD9抗體標記物結合并發(fā)出紅色熒光，從而證實磁珠復合物，也即是上述步驟(一)獲得的產物，中存在蛋白CD9的表達。這同時也能說明上述步驟(一)獲得的產物為exosome。免疫熒光檢測結果也說明上述產物中外泌體與磁珠偶聯(lián)成功。

4、流式細胞儀檢測EpCAM表達

將上述步驟(一)獲得的產物(即，磁珠結合的腫瘤細胞來源的exosome)用1ml的1×PBS重懸，得到腫瘤exosome重懸液，分別加入Epcam-FITC和Igm-FITC抗體進行4℃閉關孵育1小時后，磁力架上用1ml的1×PBS清洗3次后，加入500μl的1×PBS上流式細胞儀進行檢測。

上流式細胞儀檢測結果如圖3所示，可以發(fā)現(xiàn)：在上述步驟(一)所得產物(如圖3a)中檢測到了Epcam蛋白表達，且熒光強度明顯強于同型對照組(如圖3b)。由此可見，該產物為Epcam陽性的外泌體，這說明了上述步驟(一)獲得的產物為腫瘤細胞來源的exosome。

(四)作為診斷生物標志物的統(tǒng)計分析

1、外周游離exosome的CD9檢測在30例腎癌患者和正常中的比較與統(tǒng)計分 析

以腎透明細胞癌患者(n＝30)和健康人(n＝30)中的血液標本為對象，按照上述步驟(一)和步驟(二)的方法，檢測血漿外泌體CD9的表達水平，并通過散點圖來分析和比較。散點圖如圖5所示，Elisa檢測結果顯示：腎透明細胞癌患者中的外泌體CD9的表達水平明顯高于對照組(健康人)中的外泌體CD9的表達水平(P<0.001)。圖中黑色橫線代表中位值。采用Mann-Whitney U檢驗來計算統(tǒng)計學差異。

2、外周游離exosome的CD9檢測作為腎透明細胞癌患者的診斷工具的可行性分析

采用ROC曲線分析來評價使用血漿exosome CD9檢測來作為檢測腎透明細胞癌的診斷工具的可行性。在區(qū)別腎透明細胞癌患者和對照組方面，exosomal CD9在ROC曲線以下的面積(AUC)為0.97(95％CI：0.9263-1.014)，其敏感性為93％，特異性為97％(圖6)?？梢姡琑OC曲線分析顯示血漿外泌體中CD9能夠區(qū)別腎透明細胞癌患者和健康人。

由此可見，可以將外周游離exosome中的CD9檢測作為腎透明細胞癌中潛在生物標記物，并用于腎癌診斷：檢測腎透明細胞癌患者與健康對照組的血漿外泌體中CD9的表達水平的差異，當檢測結果顯示外周游離exosome CD9水平高于對照組中的水平，則提示所述對象腎癌患病風險。

實施例3采用實施例1的試劑盒檢測肺癌患者外周游離外泌體的CD9表達

采用與實施例2中步驟(一)基本相同的方法，對于收集到的30例肺癌患者病人血漿(1ml)與30例健康人血漿(1ml)進行腫瘤外泌體的提取與純化，獲得磁珠結合的Epcam陽性(腫瘤細胞來源)的exosome。即：(一)中血漿樣本為肺癌患者病人術前的血漿標本，其它步驟與實施例2中完全相同。血漿樣本的獲得方法也與實施例2中步驟(一)①相同。

采用與實施例2中步驟(二)基本相同的方法，進行外周游離腫瘤外泌體的ELisa檢測。對實施例3上述所得的各Epcam陽性(腫瘤細胞來源)的exosome進行CD9表達檢測，并通過散點圖來分析和比較。散點圖如圖7所示，Elisa檢測結果顯示：本實施例中，肺癌患者病人的外周游離血中提取的腫瘤細胞來源的exosome中CD9的表達水平高于正常對照(健康人)中的外泌體CD9的表達水平(OD平均值：0.46vs 0.23,P<0.01)。圖中黑色橫線代表中位值。采用Mann-Whitney U檢驗來計算統(tǒng)計學差異。

實施例4采用實施例1的試劑盒檢測食管癌患者外周游離外泌體的CD9表達

采用與實施例2中步驟(一)基本相同的方法，對于收集到的30例食管癌患者病人血漿(1ml)與30例健康人血漿(1ml)進行腫瘤外泌體的提取與純化，獲得磁珠結合的Epcam陽性(腫瘤細胞來源)的exosome。即：(一)中血漿樣本為食管癌患者病人術前的血漿標本，其它步驟與實施例2中完全相同。血漿樣本的獲得方法也與實施例2中步驟(一)①相同。

采用與實施例2中步驟(二)基本相同的方法，進行外周游離腫瘤外泌體的ELisa檢測。對實施例4上述所得的各Epcam陽性(腫瘤細胞來源)的exosome進行CD9表達檢測，并通過散點圖來分析和比較。散點圖如圖8所示，Elisa檢測結果顯示：本實施例中，食管癌患者病人的外周游離血中提取的腫瘤細胞來源的exosome中CD9的表達水平高于正常對照(健康人)中的外泌體CD9的表達水平(OD平均值：0.42vs 0.18,P<0.01)。圖中黑色橫線代表中位值。采用Mann-Whitney U檢驗來計算統(tǒng)計學差異。

實施例5采用實施例1的試劑盒檢測乳腺癌患者外周游離外泌體的CD9表達

采用與實施例2中步驟(一)基本相同的方法，對于收集到的30例乳腺癌患者病人血漿(1ml)與30例健康人血漿(1ml)進行腫瘤外泌體的提取與純化，獲得磁珠結合的Epcam陽性(腫瘤細胞來源)的exosome。即：(一)中血漿樣本為乳腺癌患者病人術前的血漿標本，其它步驟與實施例2中完全相同。血漿樣本的獲得方法也與實施例2中步驟(一)①相同。

采用與實施例2中步驟(二)基本相同的方法，進行外周游離腫瘤外泌體的ELisa檢測。對實施例5上述所得的各Epcam陽性(腫瘤細胞來源)的exosome進行CD9表達檢測，并通過散點圖來分析和比較。散點圖如圖9所示，Elisa檢測結果顯示：本實施例中，乳腺癌患者病人的外周游離血中提取的腫瘤細胞來源的exosome中CD9的表達水平高于正常對照(健康人)中的外泌體CD9的表達水平(OD平均值：0.32vs 0.21,P<0.03)。圖中黑色橫線代表中位值。采用Mann-Whitney U檢驗來計算統(tǒng)計學差異。

實施例6采用實施例1的試劑盒檢測胃癌患者外周游離外泌體的CD9表達

采用與實施例2中步驟(一)基本相同的方法，對于收集到的30例胃癌患者病人血漿(1ml)與30例健康人血漿(1ml)進行腫瘤外泌體的提取與純化，獲得 磁珠結合的Epcam陽性(腫瘤細胞來源)的exosome。即：(一)中血漿樣本為胃癌患者病人術前的血漿標本，其它步驟與實施例2中完全相同。血漿樣本的獲得方法也與實施例2中步驟(一)①相同。

采用與實施例2中步驟(二)基本相同的方法，進行外周游離腫瘤外泌體的ELisa檢測。對實施例6上述所得的各Epcam陽性(腫瘤細胞來源)的exosome進行CD9表達檢測，并通過散點圖來分析和比較。散點圖如圖10所示，Elisa檢測結果顯示：本實施例中，胃癌患者病人的外周游離血中提取的腫瘤細胞來源的exosome中CD9的表達水平高于正常對照(健康人)中的外泌體CD9的表達水平(OD平均值：0.39vs 0.17,P<0.01)。圖中黑色橫線代表中位值。采用Mann-Whitney U檢驗來計算統(tǒng)計學差異。

實施例7采用實施例1的試劑盒檢測卵巢癌患者外周游離外泌體的CD9表達

采用與實施例2中步驟(一)基本相同的方法，對于收集到的30例卵巢癌患者病人血漿(1ml)與30例健康人血漿(1ml)進行腫瘤外泌體的提取與純化，獲得磁珠結合的Epcam陽性(腫瘤細胞來源)的exosome。即：(一)中血漿樣本為卵巢癌患者病人術前的血漿標本，其它步驟與實施例2中完全相同。血漿樣本的獲得方法也與實施例2中步驟(一)①相同。

采用與實施例2中步驟(二)基本相同的方法，進行外周游離腫瘤外泌體的ELisa檢測。對實施例7上述所得的各Epcam陽性(腫瘤細胞來源)的exosome進行CD9表達檢測，并通過散點圖來分析和比較。散點圖如圖11所示，Elisa檢測結果顯示：本實施例中，卵巢癌患者病人的外周游離血中提取的腫瘤細胞來源的exosome中CD9的表達水平高于正常對照(健康人)中的外泌體CD9的表達水平(OD平均值：0.40vs 0.20,P<0.01)。圖中黑色橫線代表中位值。采用Mann-Whitney U檢驗來計算統(tǒng)計學差異。

由此可見，本發(fā)明的目的已經完整并有效的予以實現(xiàn)。本發(fā)明的方法以及原理已在實施例中予以展示和說明，在不背離所述原理的情況下，實施方式可作任意修改。所以，本發(fā)明包括了基于權利要求精神及權利要求范圍的所有變形實施方式。