一種引導(dǎo)外周神經(jīng)再生的功能生物材料及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)用材料領(lǐng)域，涉及一種引導(dǎo)外周神經(jīng)再生的功能生物材料及其制備 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 周圍神經(jīng)損傷（PNI)常常導(dǎo)致患者相關(guān)功能的喪失，影響患者的生活質(zhì)量。由于 產(chǎn)傷、車禍或暴力傷等引起的周圍神經(jīng)損傷會(huì)導(dǎo)致感覺或運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變性壞死。盡管周 圍神經(jīng)有再生的能力，但其功能恢復(fù)很不理想。人工神經(jīng)研究的不斷發(fā)展，有力地促進(jìn)了神 經(jīng)軸突的再生和功能恢復(fù)。膠原材料在組織工程中是較好的材料之一。膠原材料因其低免 疫原性和較好的可降解性而被廣泛應(yīng)用于組織再生。
[0003] 在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中生長(zhǎng)因子對(duì)促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)起重要作用。其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 VEGF是一類富含半胱氨酸的糖蛋白，其中VEGF 165的應(yīng)用最為廣泛，它能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞 增殖、分化，抑制內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的遷移等功能，研究證實(shí)VEGF促 血管生成作用在外周神經(jīng)的再生修復(fù)中也發(fā)揮著重要的作用。但血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子溶液體 內(nèi)應(yīng)用后因?yàn)槠浒胨テ诙?、在體液沖刷后大量擴(kuò)散，因而并不能取得滿意的治療效果。為了 在治療部位達(dá)到有效的藥物濃度，周期性注射用藥或大劑量給藥是常用的方法。但這樣的 方法會(huì)導(dǎo)致感染或嚴(yán)重的副作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種制備用于修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原材料的方法。
[0005] 本發(fā)明所提供的用于制備用于修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原材料的方法，具體可包括 如下步驟：將帶有膠原結(jié)合區(qū)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子與有序膠原材料共同孵育，得到所述用 于修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原材料。
[0006] 在所述方法中，所述帶有膠原結(jié)合區(qū)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF-CBD)和所述有 序膠原材料的配比為：〇. 2nmol :l-10mg。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述帶有膠原結(jié)合區(qū) 的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF-CBD)和所述有序膠原材料的配比具體為0. 2nmol :5mg。
[0007] 在所述方法中，所述孵育可為10-37°c (如25°C )孵育0? 5-1小時(shí)（如半小時(shí)）。
[0008] 在所述方法中，所述孵育時(shí)的液體環(huán)境具體為1 X PBS。
[0009] 所述IXPBS的pH為7. 4,溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下：磷酸二氫鉀0. 27g/L，磷 酸氫二鈉1. 42g/L，氯化鈉8g/L，氯化鉀0? 2g/L。
[0010] 在本發(fā)明中，所述孵育具體為：將〇.2nmol所述帶有膠原結(jié)合區(qū)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng) 因子（VEGF-CBD)溶解于5微升所述IXPBS中，然后滴加到5mg所述有序膠原材料上，25°C 孵育半小時(shí)。
[0011] 在本發(fā)明中，所述帶有膠原結(jié)合區(qū)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF-CBD)的氨基酸序 列具體可為如下（a)或（b):
[0012] (a)序列表中序列1的第1-184位；
[0013] (b)序列表中序列1。
[0014] 其中，序列1由192個(gè)氨基酸殘基組成。自N末端第1-166位為VEGF的氨基酸序 列；自N末端第178-184位為膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)的氨基酸序列；自N末端第187-192位 為組氨酸標(biāo)簽。
[0015] 在本發(fā)明中，所述有序膠原材料（L0CS)的制備方法，具體可包括如下步驟：
[0016] 1)將牛筋膜用體積百分濃度為1-1. 5% (如1% )的磷酸三丁酯溶液處理24-72 小時(shí)（如48小時(shí)）；
[0017] 2)用含有 0? 5-1. 5mol/L (如 lmol/L)NaCl 的 25-100mmol/L (如 50mmol/L)、pH 為 7. 6-8. 5 (如pH為8. 0)的Tris-HCl緩沖液處理24-72小時(shí)（如48小時(shí)）；
[0018] 3)用 1. 25X 105-3. 75X 105U (如（2. 5X105U))胰蛋白酶/100mL 緩沖液處理 48-96 小時(shí)（如72小時(shí)），得到所述有序膠原材料；所述緩沖液為25-100mm〇l/L(如50mmol/L) Tris-HCl，pH 為 7-8(如 pH 為 8);
[0019] 上述處理的溫度均為2-8°C (如4°C )。
[0020] 進(jìn)一步，在步驟3)用胰蛋白酶處理后，還可包括用0? 5-1. 5mol/L強(qiáng)堿溶液（如1M NaOH水溶液）處理5-10分鐘（如5分鐘）步驟。
[0021] 步驟1)中所述磷酸三丁酯溶液的溶劑為PBS緩沖液或Tris-HCl緩沖液，如 25-100mmol/L (如 50mmol/L)、pH 為 7. 6-8. 5 (如 pH 為 8. 0)的 Tris-HCl 緩沖液。
[0022] 步驟1)中，所述牛筋膜在處理前還要去除內(nèi)層粘附的肌肉組織和外層粘附的脂 肪。
[0023] 利用上述方法制備得到的用于修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原材料也屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
[0024] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原支架及其制備方 法。
[0025] 本發(fā)明所提供的用于修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原支架的制備方法，具體可包括如下 步驟：
[0026] (1)根據(jù)待修復(fù)外周神經(jīng)損傷部位的半徑，采用膠原膜制備相同半徑的膠原管；
[0027] (2)向步驟（1)制備得到的膠原管中填充所述用于修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原材 料，即獲得了所述用于修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原支架。
[0028] 在所述方法中，步驟（1)具體可為：根據(jù)待修復(fù)外周神經(jīng)損傷部位的半徑，找到 相同半徑的模具（材質(zhì)可為玻璃或塑料），將膠原膜用水（如三蒸水）浸泡（如浸泡1~ 2min)，將浸泡過的膠原膜裹在所述模具上形成管狀（如纏繞5/4圈），然用液態(tài)膠原涂裹一 圈，風(fēng)干，10~30°C (如25°C )放置12小時(shí)使之交聯(lián)，去除所述模具，獲得所述膠原管。
[0029] 步驟⑴中，在所述去除模具后，還可包括先后分別采用NaH2P04(0. 1M，溶劑為水） 溶液與水（去離子水）進(jìn)行洗滌的步驟。具體可為先用NaH2P04(0. 1M，溶劑為水）溶液洗 滌5次，再用水（去離子水）洗滌5次。
[0030] 步驟（1)中，在去除所述模具后還包括將所述膠原管凍干、輻照（輻射劑量具體可 為8kGy)的步驟。
[0031] 在所述方法中，步驟（2)中所述填充為將所述膠原管填充至占一半空間。
[0032] 利用所述方法制備得到的用于修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原支架也屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
[0033] 另外，用于修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原材料，或用于修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原支架 在如下任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0034] (al)制備促進(jìn)外周神經(jīng)再生的材料；
[0035] (a2)制備促進(jìn)受損的外周神經(jīng)功能指數(shù)恢復(fù)的材料；
[0036] (a3)制備促進(jìn)外周神經(jīng)橫斷部位電生理恢復(fù)的材料；
[0037] (a4)制備促進(jìn)外周神經(jīng)受損部位S-100蛋白和/或神經(jīng)絲蛋白（NF)表達(dá)的材料；
[0038] (a5)制備促進(jìn)外周神經(jīng)受損部位髓鞘直徑和/或髓鞘壁厚度增加的材料；
[0039] (a6)制備促進(jìn)靶器官恢復(fù)的材料。
[0040] 在（a6)中，所述靶器官為受損傷的所述外周神經(jīng)直接支配的器官。在本發(fā)明中， 所述外周神經(jīng)具體為坐骨神經(jīng)；所述外周神經(jīng)損傷具體為坐骨神經(jīng)橫斷損傷。更加具體的， 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述坐骨神經(jīng)橫斷損傷是指將SD大鼠（如成年雄性SD大鼠）的 坐骨神經(jīng)距梨狀肌出口 5_處用減去3_長(zhǎng)度的神經(jīng)后形成的損傷。相應(yīng)的，所述靶器官具 體為腓腸肌。所述外周神經(jīng)功能指數(shù)具體為坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（Sciatic nerve function index, SFI);其計(jì)算公式為：
[0041] SFI = 109. 5(ETS-NTS)/NTS-38. 3(EPL-NP L)/NPL+13. 3(EIT-NIT)/NIT-8. 8
[0042] 式中，ETS代表右側(cè)足的足趾寬度，EPL代表右側(cè)足的足印長(zhǎng)度，EIT代表右側(cè)足的 中間足趾距離；NTS代表左側(cè)足的足趾寬度，NPL代表左側(cè)足的足印長(zhǎng)度，NIT代表左側(cè)足的 中間足趾距離。SFI = 0為正常，SFI = -100為功能的完全喪失。
[0043] 本發(fā)明首次將VEGF-CBD因子交聯(lián)到有序膠原支架材料上，通過建立動(dòng)物外周神 經(jīng)一坐骨神經(jīng)神經(jīng)橫斷損傷模型，評(píng)價(jià)含VEGF-CBD因子的外周神經(jīng)損傷修復(fù)膠原材料在 橫斷面神經(jīng)損傷修復(fù)中發(fā)揮的作用。結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明所提供的含VEGF-CBD因子的外周神 經(jīng)損傷修復(fù)