本發(fā)明屬于免疫分析和生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種基于銀負載硫化銅納米線的夾心型免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在許多國家和地區(qū)，肺癌的發(fā)病率占惡性腫瘤的首位，對人類的健康產(chǎn)生極大危害。肺癌腫瘤標志物的靈敏檢測，在臨床上對于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)，腫瘤高危人群的篩選、良性和惡性腫瘤的鑒別診斷、腫瘤發(fā)展程度的判斷，腫瘤的治療效果的觀察和評價及腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后的預(yù)測產(chǎn)生極大的影響。

目前電化學(xué)免疫傳感器已經(jīng)廣泛用于肺癌及各種腫瘤標志物的檢測，夾心型電化學(xué)免疫傳感器結(jié)合了高特異性的免疫分析技術(shù)和高靈敏的電化學(xué)分析技術(shù)，具有靈敏度高、制備簡單、檢測快速、成本低等優(yōu)點，在臨床檢驗、環(huán)境監(jiān)測、食品安全控制、生物監(jiān)測等領(lǐng)域都有重要的應(yīng)用價值。

本發(fā)明中使用的硫化銅的形貌為納米線，具有良好的穩(wěn)定性和催化性能，具有更多的結(jié)合位點，能有效吸附固載腫瘤標志物抗體。硫化銅納米線通過S-Ag鍵可以與銀納米粒子穩(wěn)定的結(jié)合，由于二者的協(xié)同催化作用有助于提高材料的電化學(xué)性質(zhì)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種基于銀負載硫化銅納米線的夾心型免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用，實現(xiàn)了對肺癌標志物的超靈敏檢測。

本發(fā)明的目的之一是提供一種基于銀負載硫化銅納米線的夾心型免疫傳感器的制備方法。

本發(fā)明的目的之二是將所制備的一種基于銀負載硫化銅納米線的夾心型免疫傳感器應(yīng)用于肺癌標志物的高靈敏、特異性檢測。

本發(fā)明的技術(shù)方案，包括以下步驟。

1. 一種基于銀負載硫化銅納米線的夾心型免疫傳感器的制備方法，步驟如下：

（1）將直徑為4mm的玻碳電極用Al₂O₃拋光粉打磨，超純水清洗干凈；

（2）取6 μL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的L-cys@Ag滴涂到電極表面，室溫下晾干，用超純水沖洗電極表面，晾干；

（3）繼續(xù)將6 μL、10 ~ 15 μg/mL的腫瘤標志物捕獲抗體滴加到電極表面，超純水沖洗，4°C冰箱中干燥；

（4）繼續(xù)將3 μL、2.0~ 3.0 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，超純水沖洗電極表面，4°C冰箱中晾干；

（5）滴加6 μL、0.1pg ~ 30 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標志物抗原溶液，超純水沖洗電極表面，4°C冰箱中干燥；

（6）將6 μL、1 ~ 3 mg/mL的銀負載硫化銅納米線檢測抗體孵化物溶液，滴涂于電極表面上，置于4°C冰箱中晾干，制得一種基于銀負載硫化銅納米線的夾心型免疫傳感器。

2.一種基于銀負載硫化銅納米線的夾心型免疫傳感器的制備方法，所述L-cys@Ag 的制備，步驟如下：

取25 mL，2 mmoL.L^-1的L-半胱氨酸L-cys于燒杯中，邊攪拌邊依次加入1 ~ 3 mL質(zhì)量分數(shù)為1%的聚乙烯吡咯烷酮PVP，1 ~ 3 mL、0.1 moL.L^-1的抗壞血酸和2 ~ 4 mL、0.1 moL.L^-1的AgNO₃溶液，室溫下磁力攪拌10 min；離心分離，超純水洗滌三次，65°C真空干燥6 ~10h，制得L-cys@Ag；

3.一種基于銀負載硫化銅納米線的夾心型免疫傳感器的制備方法，所述銀負載硫化銅納米線檢測抗體孵化物溶液的制備，步驟如下：

（1）硫化銅納米線的合成

稱取1 ~ 3 mmol CuCl₂溶解于50 ml水中，邊攪拌邊依次加入1 ~ 3 mmol的十六烷基胺和0.2 g葡萄糖，溶解后轉(zhuǎn)移到100 mL高壓反應(yīng)釜中60°C反應(yīng)4 ~ 5 h，升溫到120°C反應(yīng)3 ~ 4 h，離心分離；將分離得到的固體分散到50 mL 、0.2 moL.L^-1 的Na₂S溶液中，加入6 ~ 10 mg PVP，繼續(xù)攪拌30 min后轉(zhuǎn)移到高壓反應(yīng)釜中，在120°C下反應(yīng)2 ~ 3 h，冷卻到室溫，在12000 rpm離心10min，超純水洗滌三次，50°C真空干燥箱中干燥12 ~ 14 h，制得硫化銅納米線；

（2）銀負載硫化銅納米線的合成

將0.1 ~ 0.3 g硫化銅納米線分散于100 mL超純水中，攪拌條件下加入10 mL、0.1 moL.L^-1的AgNO₃溶液和1.5 mL、質(zhì)量分數(shù)為1%的PVP溶液，攪拌10 min后，加入10 mL，0.1 moL.L^-1的抗壞血酸，攪拌30 min，離心分離，超純水洗滌三次，60°C真空干燥箱中干燥12 ~ 14 h，制得銀負載硫化銅納米線；

（3）銀負載硫化銅納米線檢測抗體孵化物溶液的制備

將2~ 4 mg的銀負載硫化銅納米線溶于1 mL的pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，震蕩溶解，再加入100 μL、80 ~ 120 μg/mL的腫瘤標志物檢測抗體溶液和900 μL、50 mmol/L的pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液，4°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩，孵化12 h，制得銀負載硫化銅納米線檢測抗體孵化物溶液，4°C下保存?zhèn)溆谩?/p>

4.一種基于銀負載硫化銅納米線的夾心型免疫傳感器，用于腫瘤標志物的檢測，步驟如下：

（1）使用電化學(xué)工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的傳感器為工作電極，在10 mL，含4 mmoL.L^-1的鐵氰化鉀和0.1 moL.L^-1的硝酸鉀溶液中進行測試；

（2）用方波伏安法對分析物進行檢測，初始電位為0 V，終止電位為0.4 V，電位增量為0.004 V，振幅為0.025 V，靜置時間為2 s，記錄電流變化。

上述所述腫瘤標志物選自下列之一：CA125、CA153、SCCA。

本發(fā)明所用原材料均可在化學(xué)試劑公司或生物制藥公司購買。

本發(fā)明的有益成果

（1）本發(fā)明使用了L-半胱氨酸負載銀納米粒子L-cys@Ag作為基底，納米粒子具有大的比表面積，且L-半胱氨酸是親水性物質(zhì)，在水中有優(yōu)越的分散性，且羧基能與腫瘤標志物抗體上的氨基有效結(jié)合，使得結(jié)合更加牢固，可增加與抗體結(jié)合數(shù)目及穩(wěn)定性，；

（2）采用銀負載的硫化銅納米線作為捕獲抗體標記物，具有大的比表面積，Ag納米粒子具有良好的催化性能，銀負載的硫化銅納米線具有良好的穩(wěn)定性和催化性能，能有效吸附固載腫瘤標志物抗體。硫化銅納米線通過S-Ag鍵可以與銀納米粒子穩(wěn)定的結(jié)合，由于二者的協(xié)同催化作用有助于實現(xiàn)了放大電化學(xué)信號的作用，從而提高了傳感器的靈敏度，降低了檢測限；

（3）一種基于銀負載硫化銅納米線的夾心型免疫傳感器用于對肺癌標志物的檢測，其對SCCA檢測的線性范圍0.1pg ~ 30 ng/mL，檢測限最低0.03 pg/mL，對CA125檢測的線性范圍0.1pg ~ 20 ng/mL，檢測限最低0.03 pg/mL，對CA153檢測的線性范圍0.5pg ~ 30 ng/mL，檢測限最低0.17 pg/mL，表明一種基于銀負載硫化銅納米線的夾心型免疫傳感器可以達到準確測定的目的。

具體實施方式

現(xiàn)將本發(fā)明通過具體實施方式進一步說明，但不限于此。

實施例1一種基于銀負載硫化銅納米線的夾心型免疫傳感器的制備方法，步驟如下：

（1）將直徑為4mm的玻碳電極用Al₂O₃拋光粉打磨，超純水清洗干凈；

（2）取6 μL、1.0 mg/mL的L-cys@Ag滴涂到電極表面，室溫下晾干，用超純水沖洗電極表面，晾干；

（3）繼續(xù)將6 μL、10 μg/mL的腫瘤標志物捕獲抗體滴加到電極表面，超純水沖洗，4°C冰箱中干燥；

（4）繼續(xù)將3 μL、2.0 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，超純水沖洗電極表面，4°C冰箱中晾干；

（5）滴加6 μL、0.1pg ~ 30 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標志物抗原溶液，超純水沖洗電極表面，4°C冰箱中干燥；

（6）將6 μL、1mg/mL的銀負載硫化銅納米線檢測抗體孵化物溶液，滴涂于電極表面上，置于4°C冰箱中晾干，制得一種基于銀負載硫化銅納米線的夾心型免疫傳感器。

實施例2 一種基于銀負載硫化銅納米線的夾心型免疫傳感器的制備方法，步驟如下：

（1）將直徑為4mm的玻碳電極用Al₂O₃拋光粉打磨，超純水清洗干凈；

（2）取6 μL、2.0 mg/mL的L-cys@Ag滴涂到電極表面，室溫下晾干，用超純水沖洗電極表面，晾干；

（3）繼續(xù)將6 μL、12 μg/mL的腫瘤標志物捕獲抗體滴加到電極表面，超純水沖洗，4°C冰箱中干燥；

（4）繼續(xù)將3 μL、2.5 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，超純水沖洗電極表面，4°C冰箱中晾干；

（5）滴加6 μL、0.1pg ~ 30 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標志物抗原溶液，超純水沖洗電極表面，4°C冰箱中干燥；

（6）將6 μL、2 mg/mL的銀負載硫化銅納米線檢測抗體孵化物溶液，滴涂于電極表面上，置于4°C冰箱中晾干，制得一種基于銀負載硫化銅納米線的夾心型免疫傳感器。

實施例3一種基于銀負載硫化銅納米線的夾心型免疫傳感器的制備方法，步驟如下：

（1）將直徑為4mm的玻碳電極用Al₂O₃拋光粉打磨，超純水清洗干凈；

（2）取6 μL、3.0 mg/mL的L-cys@Ag滴涂到電極表面，室溫下晾干，用超純水沖洗電極表面，晾干；

（3）繼續(xù)將6 μL、15 μg/mL的腫瘤標志物捕獲抗體滴加到電極表面，超純水沖洗，4°C冰箱中干燥；

（4）繼續(xù)將3 μL、3.0 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，超純水沖洗電極表面，4°C冰箱中晾干；

（5）滴加6 μL、0.1pg ~ 30 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標志物抗原溶液，超純水沖洗電極表面，4°C冰箱中干燥；

（6）將6 μL、3 mg/mL的銀負載硫化銅納米線檢測抗體孵化物溶液，滴涂于電極表面上，置于4°C冰箱中晾干，制得一種基于銀負載硫化銅納米線的夾心型免疫傳感器。

實施例4 L-cys@Ag 的制備，步驟如下：

取25 mL，2 mmoL.L^-1的L-半胱氨酸L-cys于燒杯中，邊攪拌邊依次加入1 mL質(zhì)量分數(shù)為1%的聚乙烯吡咯烷酮PVP，1mL、0.1 moL.L^-1的抗壞血酸和2 mL、0.1 moL.L^-1的AgNO₃溶液，室溫下磁力攪拌10 min；離心分離，超純水洗滌三次，65°C真空干燥6 h，制得L-cys@Ag。

實施例5 L-cys@Ag 的制備，步驟如下：

取25 mL，2 mmoL.L^-1的L-半胱氨酸L-cys于燒杯中，邊攪拌邊依次加入2 mL質(zhì)量分數(shù)為1%的聚乙烯吡咯烷酮PVP，2 mL、0.1 moL.L^-1的抗壞血酸和3 mL、0.1 moL.L^-1的AgNO₃溶液，室溫下磁力攪拌10 min；離心分離，超純水洗滌三次，65°C真空干燥8 h，制得L-cys@Ag。

實施例6 L-cys@Ag 的制備，步驟如下：

取25 mL，2 mmoL.L^-1的L-半胱氨酸L-cys于燒杯中，邊攪拌邊依次加入3 mL質(zhì)量分數(shù)為1%的聚乙烯吡咯烷酮PVP，3 mL、0.1 moL.L^-1的抗壞血酸和4 mL、0.1 moL.L^-1的AgNO₃溶液，室溫下磁力攪拌10 min；離心分離，超純水洗滌三次，65°C真空干燥10 h，制得L-cys@Ag。

實施例7銀負載硫化銅納米線檢測抗體孵化物溶液的制備，步驟如下：

（1）硫化銅納米線的合成

稱取1 mmol CuCl₂溶解于50 ml水中，邊攪拌邊依次加入1 mmol的十六烷基胺和0.2 g葡萄糖，溶解后轉(zhuǎn)移到100 mL高壓反應(yīng)釜中60°C反應(yīng)4 h，升溫到120°C反應(yīng)3 h，離心分離；將分離得到的固體分散到50 mL 、0.2 moL.L^-1 的Na₂S溶液中，加入6 mg PVP，繼續(xù)攪拌30 min后轉(zhuǎn)移到高壓反應(yīng)釜中，在120°C下反應(yīng)2 h，冷卻到室溫，在12000 rpm離心10min，超純水洗滌三次，50°C真空干燥箱中干燥12 h，制得硫化銅納米線；

（2）銀負載硫化銅納米線的合成

將0.1g硫化銅納米線分散于100 mL超純水中，攪拌條件下加入10 mL、0.1 moL.L^-1的AgNO₃溶液和1.5 mL、質(zhì)量分數(shù)為1%的PVP溶液，攪拌10 min后，加入10 mL，0.1 moL.L^-1的抗壞血酸，攪拌30 min，離心分離，超純水洗滌三次，60°C真空干燥箱中干燥12 h，制得銀負載硫化銅納米線；

（3）銀負載硫化銅納米線檢測抗體孵化物溶液的制備

將2 mg的銀負載硫化銅納米線溶于1 mL的pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，震蕩溶解，再加入100 μL、80 μg/mL的腫瘤標志物檢測抗體溶液和900 μL、50 mmol/L的pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液，4°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩，孵化12 h，制得銀負載硫化銅納米線檢測抗體孵化物溶液，4°C下保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例8 銀負載硫化銅納米線檢測抗體孵化物溶液的制備，步驟如下：

（1）硫化銅納米線的合成

稱取2 mmol CuCl₂溶解于50 ml水中，邊攪拌邊依次加入2 mmol的十六烷基胺和0.2 g葡萄糖，溶解后轉(zhuǎn)移到100 mL高壓反應(yīng)釜中60°C反應(yīng)4.5 h，升溫到120°C反應(yīng)3.5 h，離心分離；將分離得到的固體分散到50 mL 、0.2 moL.L^-1 的Na₂S溶液中，加入8 mg PVP，繼續(xù)攪拌30 min后轉(zhuǎn)移到高壓反應(yīng)釜中，在120°C下反應(yīng)2.5h，冷卻到室溫，在12000 rpm離心10min，超純水洗滌三次，50°C真空干燥箱中干燥13 h，制得硫化銅納米線；

（2）銀負載硫化銅納米線的合成

將0.2 g硫化銅納米線分散于100 mL超純水中，攪拌條件下加入10 mL、0.1 moL.L^-1的AgNO₃溶液和1.5 mL、質(zhì)量分數(shù)為1%的PVP溶液，攪拌10 min后，加入10 mL，0.1 moL.L^-1的抗壞血酸，攪拌30 min，離心分離，超純水洗滌三次，60°C真空干燥箱中干燥13 h，制得銀負載硫化銅納米線；

（3）銀負載硫化銅納米線檢測抗體孵化物溶液的制備

將3 mg的銀負載硫化銅納米線溶于1 mL的pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，震蕩溶解，再加入100 μL、100 μg/mL的腫瘤標志物檢測抗體溶液和900 μL、50 mmol/L的pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液，4°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩，孵化12 h，制得銀負載硫化銅納米線檢測抗體孵化物溶液，4°C下保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例9 銀負載硫化銅納米線檢測抗體孵化物溶液的制備，步驟如下：

（1）硫化銅納米線的合成

稱取3 mmol CuCl₂溶解于50 ml水中，邊攪拌邊依次加入3 mmol的十六烷基胺和0.2 g葡萄糖，溶解后轉(zhuǎn)移到100 mL高壓反應(yīng)釜中60°C反應(yīng)5 h，升溫到120°C反應(yīng)4 h，離心分離；將分離得到的固體分散到50 mL 、0.2 moL.L^-1 的Na₂S溶液中，加入10 mg PVP，繼續(xù)攪拌30 min后轉(zhuǎn)移到高壓反應(yīng)釜中，在120°C下反應(yīng)3 h，冷卻到室溫，在12000 rpm離心10min，超純水洗滌三次，50°C真空干燥箱中干燥14 h，制得硫化銅納米線；

（2）銀負載硫化銅納米線的合成

將0.3 g硫化銅納米線分散于100 mL超純水中，攪拌條件下加入10 mL、0.1 moL.L^-1的AgNO₃溶液和1.5 mL、質(zhì)量分數(shù)為1%的PVP溶液，攪拌10 min后，加入10 mL，0.1 moL.L^-1的抗壞血酸，攪拌30 min，離心分離，超純水洗滌三次，60°C真空干燥箱中干燥14 h，制得銀負載硫化銅納米線；

（3）銀負載硫化銅納米線檢測抗體孵化物溶液的制備

將4 mg的銀負載硫化銅納米線溶于1 mL的pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，震蕩溶解，再加入100 μL、120 μg/mL的腫瘤標志物檢測抗體溶液和900 μL、50 mmol/L的pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液，4°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩，孵化12 h，制得銀負載硫化銅納米線檢測抗體孵化物溶液，4°C下保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例10腫瘤標志物CA125的檢測，步驟如下：

（1）使用電化學(xué)工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的傳感器為工作電極，在10 mL、含4 mmoL.L^-1的鐵氰化鉀和0.1 moL.L^-1的硝酸鉀溶液中進行測試；

（2）用方波伏安法對分析物進行檢測，初始電位為0 V，終止電位為0.4 V，電位增量為0.004 V，振幅為0.025 V，靜置時間為2 s，記錄電流變化；

（3）根據(jù)所得電流與CA125濃度之間的線性關(guān)系，繪制工作曲線，測得線性范圍為0.1pg ~ 20 ng/mL，檢測限最低0.03 pg/mL。

實施例11腫瘤標志物CA153的檢測

按照實施例10的方法對CA153進行檢測，其線性范圍為0.5pg ~ 30 ng/mL，檢測限為0.17 pg/mL。

實施例12腫瘤標志物SCCA的檢測

按照實施例10的方法對SCCA進行檢測，其線性范圍0.1pg ~ 30 ng/mL，檢測限最低0.03 pg/mL。