本發(fā)明涉及以6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶-金納米簇為探針的總蛋白熒光檢測(cè)試劑盒，屬于分析化學(xué)及納米技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

各種精確的蛋白質(zhì)定量方法對(duì)許多基礎(chǔ)研究抑或是某些前沿領(lǐng)域的科學(xué)研究都是不可或缺的。蛋白質(zhì)定量涉及了細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、分子生物學(xué)、食品安全等領(lǐng)域的研究課題，不同的檢測(cè)樣品類型依據(jù)不同的條件選擇相應(yīng)的蛋白質(zhì)定量方法?？偟鞍锥糠治龅膫鹘y(tǒng)方法有：測(cè)量在280 nm 的紫外吸光值；二喹啉酸（BCA）和Bradford檢測(cè)法；以及其他替代方法，例如Lowry 檢測(cè)法等。然而，目前這些已知的方法都有其適用條件，并且都存在一定的缺點(diǎn)：它們既不是蛋白質(zhì)特異的（存在干擾），也不是對(duì)所有的蛋白質(zhì)都同樣準(zhǔn)確和兼容。因此，發(fā)展一種抗干擾能力強(qiáng)、定量準(zhǔn)確快速的新方法仍具有一定的意義。

金納米簇（gold nanoclusters, Au NCs）是一種新型的熒光納米材料，其具有尺寸小、無毒、水溶性好、光穩(wěn)定性好、Stokes位移大、比表面積大、制備條件溫和、表面易于修飾以及熒光性質(zhì)隨尺寸可調(diào)等突出優(yōu)點(diǎn)，是近年來的研究熱點(diǎn)，其已被廣泛應(yīng)用于催化、傳感檢測(cè)、納米標(biāo)記、醫(yī)學(xué)成像和光電子學(xué)等領(lǐng)域。

本發(fā)明以6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶-金納米簇作為熒光探針，基于蛋白質(zhì)與金納米團(tuán)簇的特異性吸附作用，增強(qiáng)金納米簇的熒光，用于總蛋白的檢測(cè)，提供了一種簡便、靈敏的總蛋白檢測(cè)試劑盒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種以6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶-金納米簇為探針的總蛋白熒光檢測(cè)試劑盒。試劑盒中包括提供金納米簇探針溶液（a液），牛血清白蛋白溶液（標(biāo)準(zhǔn)液）。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明所述的一種金納米簇為探針的總蛋白熒光檢測(cè)試劑盒，其特征是試劑盒中有金納米簇探針溶液和牛血清白蛋白溶液，所述的金納米簇探針為6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶-金納米簇，金納米簇探針溶液作為a液，牛血清白蛋白溶液為標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

上述的金納米簇探針由下述方法制備的：取含0.2 mol/L氫氧化鈉，濃度為80 mmol/L的6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶溶液與濃度為10 mg/mL的氯金酸溶液按1:1比例混合均勻，室溫下磁力攪拌1小時(shí)，用截留分子量為3500的透析袋對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行純化，冷凍干燥后得到6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶-金納米簇粉末。

所述的金納米簇為探針的總蛋白熒光檢測(cè)試劑盒，其特征是利用金納米簇探針在535 nm處的熒光強(qiáng)度值以判斷總蛋白含量，所使用的激發(fā)波長為472 nm。

所述的金納米簇為探針的總蛋白熒光檢測(cè)試劑盒，其特征是測(cè)定的線性范圍為10~400 μg/mL，檢測(cè)限為0.88 μg/ml。

本發(fā)明所述的一種金納米簇為探針的總蛋白熒光檢測(cè)試劑盒測(cè)定人血清總蛋白的方法，其特征是將牛血清白蛋白溶液作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液用雙蒸水稀釋為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在20 μL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入180 μL用雙蒸水配制的鹽酸調(diào)節(jié)pH為5的濃度為0.5 mg/mL的金納米簇探針溶液，充分混勻后置于30 °C水浴反應(yīng)30分鐘，以472 nm為激發(fā)波長，測(cè)定在535 nm處的熒光強(qiáng)度值，繪制總蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線或計(jì)算回歸方程，取人血清樣品，用雙蒸水稀釋50倍，在20 μL人血清稀釋液中加入180 μL 用雙蒸水配制的鹽酸調(diào)節(jié)pH為5的濃度為0.5 mg/mL的金納米簇探針溶液，充分混勻后置于30 °C水浴反應(yīng)30分鐘，以472 nm為激發(fā)波長，測(cè)定在535 nm處的熒光強(qiáng)度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程進(jìn)行定量，獲得血清樣品中的總蛋白含量。

本發(fā)明所述的一種金納米簇為探針的總蛋白熒光檢測(cè)試劑盒測(cè)定人血漿總蛋白的方法，其特征是將牛血清白蛋白溶液作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液用雙蒸水稀釋為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在20 μL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入180 μL用雙蒸水配制的鹽酸調(diào)節(jié)pH為5的濃度為0.5 mg/mL的金納米簇探針溶液，充分混勻后置于30 °C水浴反應(yīng)30分鐘，以472 nm為激發(fā)波長，測(cè)定在535 nm處的熒光強(qiáng)度值，繪制總蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線或計(jì)算回歸方程，取人血漿樣品，用雙蒸水稀釋50倍，在20 μL人血漿稀釋液中加入180 μL 用雙蒸水配制的鹽酸調(diào)節(jié)pH為5的濃度為0.5 mg/mL的金納米簇探針溶液，充分混勻后置于30 °C水浴反應(yīng)30分鐘，以472 nm為激發(fā)波長，測(cè)定在535 nm處的熒光強(qiáng)度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程進(jìn)行定量，獲得血漿樣品中的總蛋白含量。

本發(fā)明所述的一種金納米簇為探針的總蛋白熒光檢測(cè)試劑盒測(cè)定牛奶總蛋白的方法，其特征是將牛血清白蛋白溶液作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液用雙蒸水稀釋為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在20 μL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入180 μL用雙蒸水配制的鹽酸調(diào)節(jié)pH為5的濃度為0.5 mg/mL的金納米簇探針溶液，充分混勻后置于30 °C水浴反應(yīng)30分鐘，以472 nm為激發(fā)波長，測(cè)定在535 nm處的熒光強(qiáng)度值，繪制總蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線或計(jì)算回歸方程，取牛奶樣品，用雙蒸水稀釋10倍，在10 μL牛奶稀釋液中加入10 μL濃度為10 mol/L的EDTA溶液和180 μL用雙蒸水配制的鹽酸調(diào)節(jié)pH為5的濃度為0.5 mg/mL的金納米簇探針溶液，充分混勻后置于30 °C水浴反應(yīng)30分鐘，以472 nm為激發(fā)波長，測(cè)定在535 nm處的熒光強(qiáng)度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程進(jìn)行定量，獲得牛奶樣品中的總蛋白含量。

本發(fā)明所述的一種金納米簇為探針的總蛋白熒光檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞總蛋白的方法，其特征是將牛血清白蛋白溶液作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液用雙蒸水稀釋為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在20 μL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入180 μL用雙蒸水配制的鹽酸調(diào)節(jié)pH為5的濃度為0.5 mg/mL的金納米簇探針溶液，充分混勻后置于30 °C水浴反應(yīng)30分鐘，以472 nm為激發(fā)波長，測(cè)定在535 nm處的熒光強(qiáng)度值，繪制總蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線或計(jì)算回歸方程，取細(xì)胞裂解樣品，用雙蒸水稀釋6倍，在20 μL細(xì)胞裂解稀釋液中加入180 μL用雙蒸水配制的鹽酸調(diào)節(jié)pH為5的濃度為0.5 mg/mL的金納米簇探針溶液，充分混勻后置于30 °C水浴反應(yīng)30分鐘，以472 nm為激發(fā)波長，測(cè)定在535 nm處的熒光強(qiáng)度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程進(jìn)行定量，獲得細(xì)胞樣品中的總蛋白含量。

上述使用的金納米簇探針由下述方法制備的：取含0.2 mol/L氫氧化鈉，濃度為80 mmol/L的6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶溶液與濃度為10 mg/mL的氯金酸溶液按1:1比例混合均勻，室溫下磁力攪拌1小時(shí)，用截留分子量為3500的透析袋對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行純化，冷凍干燥后得到6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶-金納米簇粉末。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明具體采用以下技術(shù)方案：

（一）金納米簇探針的制備

以下過程中使用的所有玻璃器皿均經(jīng)過王水浸泡，并用雙蒸水徹底清洗，晾干。金納米簇探針的制備如下：濃度為80 mmol/L的6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶溶液（含0.2 mol/L氫氧化鈉）與濃度為10 mg/mL的氯金酸溶液按1:1比例混合均勻，室溫下磁力攪拌1小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為3500的透析袋對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行純化，冷凍干燥后得到金納米簇探針粉末。

（二）總蛋白檢測(cè)試劑盒：a液包括上述技術(shù)方案（一）制備后用雙蒸水配制，鹽酸調(diào)節(jié)pH=5的濃度為0.5 mg/mL的金納米簇探針溶液，標(biāo)準(zhǔn)貯備液包括濃度為4.0 mg/mL的牛血清白蛋白溶液。

（三）總蛋白的檢測(cè)方法

將技術(shù)方案（二）的標(biāo)準(zhǔn)貯備液用雙蒸水稀釋為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在20 μL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入180 μL技術(shù)方案（二）的a液，充分混勻后置于30 °C水浴反應(yīng)30分鐘，以472 nm為激發(fā)波長，測(cè)定在535 nm處的熒光強(qiáng)度值（F₅₃₅），繪制總蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線或計(jì)算回歸方程。在20 μL樣品溶液中加入180 μL技術(shù)方案（二）的a液，充分混勻后置于30 °C水浴反應(yīng)30分鐘，以472 nm為激發(fā)波長，測(cè)定在535 nm處的熒光強(qiáng)度值（F₅₃₅），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

（1）本發(fā)明基于蛋白質(zhì)與金納米簇探針的特異性吸附作用，增強(qiáng)金納米簇探針的熒光強(qiáng)度，用于總蛋白的檢測(cè)。

（2）本發(fā)明使用的6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶保護(hù)的金納米簇探針其制備過程快速、簡便，液相一步還原，不需要任何前修飾步驟。

（3）本發(fā)明所構(gòu)建的試劑盒與檢測(cè)方法特異性好、靈敏度高，金納米團(tuán)簇?zé)晒鈴?qiáng)度與BSA濃度在10~400 μg/ml 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限低至0.88 μg/mL。

（4）本發(fā)明所構(gòu)建的試劑盒和檢測(cè)方法無需復(fù)雜的樣品前處理過程即可用于人血清、人血漿、牛奶、細(xì)胞等的總蛋白檢測(cè)。

附圖說明

圖1為蛋白質(zhì)與金納米簇探針作用后的熒光光譜圖。

圖2為總蛋白測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

濃度為80 mmol/L的6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶溶液（含0.2 mol/L氫氧化鈉）與濃度為10 mg/mL的氯金酸溶液按1:1比例混合均勻，室溫下磁力攪拌1小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為3500的透析袋對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行純化，冷凍干燥后得到金納米簇探針粉末。

實(shí)施例2：

一種基于金納米簇探針的總蛋白熒光檢測(cè)試劑盒。試劑盒中包括提供金納米簇探針溶液（a液）和牛血清白蛋白溶液（標(biāo)準(zhǔn)貯備液）。a液包括實(shí)施例1制備的金納米簇探針粉末、用雙蒸水配制，鹽酸調(diào)節(jié)pH=5的濃度為0.5 mg/mL的金納米簇探針溶液，標(biāo)準(zhǔn)貯備液為濃度為4.0 mg/mL的牛血清白蛋白溶液。

實(shí)施例3：

將實(shí)施例2的標(biāo)準(zhǔn)貯備液用雙蒸水稀釋為2.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在20 μL濃度為2.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入180 μL實(shí)施例2的a液，充分混勻后置于30 °C水浴反應(yīng)30分鐘，以472 nm為激發(fā)波長，測(cè)定熒光光譜。如圖1所示，最大熒光波長為535 nm。

實(shí)施例4：

將實(shí)施例2的標(biāo)準(zhǔn)貯備液用雙蒸水稀釋為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在20 μL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入180 μL實(shí)施例2的a液，充分混勻后置于30 °C水浴反應(yīng)30分鐘，以472 nm為激發(fā)波長，測(cè)定在535 nm處的熒光強(qiáng)度值（F₅₃₅），繪制總蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線或計(jì)算回歸方程。如圖2所示，隨著蛋白質(zhì)濃度的不斷增大，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，測(cè)定的線性范圍為10~400 μg/mL，回歸方程相關(guān)系數(shù)為0.998，檢測(cè)限為0.88 μg/ml。

實(shí)施例5：

將實(shí)施例2的標(biāo)準(zhǔn)貯備液用雙蒸水稀釋為2.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在10份20 μL濃度為2.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入180 μL實(shí)施例2的a液，充分混勻后置于30 °C水浴反應(yīng)30分鐘，以472 nm為激發(fā)波長，測(cè)定在535 nm處的熒光強(qiáng)度值（F₅₃₅），測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

實(shí)施例6：

取人血清樣品，用雙蒸水稀釋50倍，在20 μL人血清稀釋液中加入180 μL實(shí)施例2的a液，充分混勻后置于30 °C水浴反應(yīng)30分鐘，以472 nm為激發(fā)波長，測(cè)定在535 nm處的熒光強(qiáng)度值（F₅₃₅），根據(jù)實(shí)施例4標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，獲得血清樣品中的總蛋白含量。與BCA法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明本發(fā)明所使用的方法與BCA方法無顯著性差異。

血清總蛋白的測(cè)定結(jié)果

實(shí)施例7：

取人血漿樣品，用雙蒸水稀釋50倍，在20 μL人血漿稀釋液中加入180 μL實(shí)施例2的a液，充分混勻后置于30 °C水浴反應(yīng)30分鐘，以472 nm為激發(fā)波長，測(cè)定在535 nm處的熒光強(qiáng)度值（F₅₃₅），根據(jù)實(shí)施例4標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，獲得血漿樣品中的總蛋白含量。與BCA法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明本發(fā)明所使用的方法與BCA方法無顯著性差異。

血漿總蛋白的測(cè)定結(jié)果

實(shí)施例8：

取牛奶樣品，用雙蒸水稀釋10倍，在10 μL牛奶稀釋液中加入10 μL 濃度為10 mmol/L的EDTA溶液和180 μL實(shí)施例2的a液，充分混勻后置于30 °C水浴反應(yīng)30分鐘，以472 nm為激發(fā)波長，測(cè)定在535 nm處的熒光強(qiáng)度值（F₅₃₅），根據(jù)實(shí)施例4標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，獲得牛奶樣品中的總蛋白含量。與BCA法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明本發(fā)明所使用的方法與BCA方法無顯著性差異。

牛奶總蛋白的測(cè)定結(jié)果

實(shí)施例9：

用細(xì)胞裂解液裂解HL60細(xì)胞后，提取細(xì)胞總蛋白，用雙蒸水稀釋6倍，在20 μL細(xì)胞裂解稀釋液中加入180 μL實(shí)施例2的a液，充分混勻后置于30 °C水浴反應(yīng)30分鐘，以472 nm為激發(fā)波長，測(cè)定在535 nm處的熒光強(qiáng)度值（F₅₃₅），根據(jù)實(shí)施例4標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，獲得細(xì)胞樣品中的總蛋白含量。與BCA法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明本發(fā)明所使用的方法與BCA方法無顯著性差異。

細(xì)胞總蛋白的測(cè)定結(jié)果

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改，等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。