本發(fā)明涉及細胞表征技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種基于多孔介質(zhì)模型的細胞物理狀態(tài)的表征方法。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有的描述細胞力學(xué)狀態(tài)的方法主要有基于赫茲模型利用楊氏模量表征細胞剛度，基于粘彈性理論利用松弛模量與表觀粘度來對細胞進行表征，以及基于多孔介質(zhì)理論來計算細胞質(zhì)的擴散系數(shù)。

利用赫茲模型來計算細胞楊氏模量的方法主要是利用原子力顯微鏡對細胞進行壓痕實驗采集細胞的力-距離曲線，針對不同形狀的探針利用不同的公式進行擬合。

對于錐形探針，利用錐形探針對細胞進行壓痕實驗，如圖1中(a)所示，有：

對于球形探針，利用錐形探針對細胞進行壓痕實驗，如圖1中(b)所示，有：

其中，f是加載力，e是楊氏模量，v是泊松比，是錐形探針的半開角，r是球形探針的半徑，δ是壓入深度。

利用粘彈性模型計算粘度與剛度的方法是先讓探針以一定的速度壓入細胞一定的壓入深度，然后讓其靜置一定的時間，力曲線會隨靜置時間出現(xiàn)一個松弛現(xiàn)象。通過將松弛階段的力曲線與如下方程進行擬合：

其中，er是松弛模量，τσ和τs分別是荷載和變形的松弛時間常數(shù)，表觀粘度可以根據(jù)下式進行計算：

μ＝er(τσ-τε)

afm探針對細胞所施加的力可以通過：

f＝s×δ×k

來計算，其中，s是探針的敏感度，δ是deflection值的變化，k是探針的力常數(shù)。

利用多孔介質(zhì)模型測量細胞擴散系數(shù)的方法也主要是利用松弛階段的曲線進行擬合。擬合方程如下：

對于錐形探針，有：

α＝(2/π)δtanθ

對于球形探針，有：

其中，d是擴散系數(shù)，α是有效接觸面積。

傳統(tǒng)的表征細胞的物理狀態(tài)的方法不論是從模型假設(shè)上還是數(shù)據(jù)采集上具有它們的不足。在模型假設(shè)上，赫茲模型將細胞假設(shè)為一個均質(zhì)彈性體，粘彈性模型將細胞看作是完全粘彈性體，多孔介質(zhì)模型將細胞假設(shè)為一個單一的多孔介質(zhì)體系。而這些假設(shè)均不符合細胞本身的狀態(tài)。在數(shù)據(jù)采集上，赫茲模型一直存在兩個問題，一是不同壓入深度下測量得到的楊氏模量的值有較大差異，二是不同加載速率下測量得到的值也有較大差異。此外，以往的多種模型，都只采用了基于該模型的一種或兩種物理參數(shù)來作為表征細胞力學(xué)狀態(tài)的主要標(biāo)準(zhǔn)，而細胞內(nèi)部由于其復(fù)雜性，由一種或兩種參數(shù)來描述其物理狀態(tài)可能并不能滿足需要，而且其描述的狀態(tài)也有一定的片面性，并不能準(zhǔn)確或完善的描述細胞所處的生理狀態(tài)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

(一)要解決的技術(shù)問題

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是如何減少在不同壓入深度以及不同加載速率下獲取得到的楊氏模量值之間的差異。

(二)技術(shù)方案

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種細胞楊氏模量的獲取方法，包括：

s1.基于待測細胞表面的加載力-時間曲線，獲取待測細胞在時間為區(qū)域無窮大時的加載力與壓入深度；

s2.基于待測細胞在時間為區(qū)域無窮大時的加載力與壓入深度，利用赫茲模型計算得到待測細胞的楊氏模量。

優(yōu)選地，s1具體為：

基于待測細胞表面afm探針的形變-時間曲線，利用粘彈性模型得到待測細胞表面的加載力-時間曲線，獲取待測細胞在時間為區(qū)域無窮大時的加載力與壓入深度。

優(yōu)選地，在所述形變-時間曲線的獲取中，數(shù)據(jù)采集步驟包括：退針段、靜置段、近針段和松弛段。

優(yōu)選地，所述數(shù)據(jù)采集步驟具體為：

s11.根據(jù)待測細胞的力曲線，估測得到探針與待測細胞接觸點的位置，以所述估測位置為接觸點，將探針抬起置于第一高度，記為退針段，采集退針段的時間值和afm探針deflection變化值；

s12.在所述第一高度將探針靜置，記為靜置段，采集靜置段的時間值和afm探針deflection變化值；

s13.以第一速度令探針下降第一距離，從而在細胞表面獲得第一壓入深度，記為近針段，采集近針段的時間值和afm探針deflection變化值；

s14.保持探針在所述第一壓入深度不變，記錄探針的松弛行為，記為松弛段，采集松弛段的時間值和afm探針deflection變化值。

優(yōu)選地，所述數(shù)據(jù)采集步驟還包括：

以s11-s14為一個周期，重復(fù)多個周期。

優(yōu)選地，所述第一速度至少為10μm/s。

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，還提供了一種細胞物理狀態(tài)的表征方法，包括：使用楊氏模量、表觀粘度和擴散系數(shù)綜合表征細胞物理狀態(tài)；其中，所述楊氏模量為使用上述細胞楊氏模量的測量方法獲得。

優(yōu)選地，所述表觀粘度為基于上述細胞楊氏模量的測量方法中所述松弛段的曲線，利用粘彈性模型進行擬合獲得。

優(yōu)選地，所述擴散系數(shù)為基于上述細胞楊氏模量的測量方法中所述松弛段的曲線，利用多孔介質(zhì)模型進行擬合獲得。

優(yōu)選地，所述表征方法還包括：使用綜合孔隙度結(jié)合楊氏模量、表觀粘度和擴散系數(shù)綜合表征細胞物理狀態(tài)；其中，所述綜合孔隙度利用單一孔徑多孔介質(zhì)理論計算獲得。

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，還提供了一種細胞介孔彈性或剛度的獲取方法，包括：使用權(quán)利要求上述所述細胞楊氏模量的獲取方法獲取細胞楊氏模量，以表征細胞的介孔彈性或剛度。

本發(fā)明提出的方法以多孔介質(zhì)模型為基礎(chǔ)，可以有效地解決利用傳統(tǒng)方法根據(jù)赫茲模型測量楊氏模量以及細胞剛度所存在的不同壓入深度與不同加載速率下測量得到的結(jié)果差異大的問題，并合理地解釋傳統(tǒng)方法測量出現(xiàn)差異的原因；本發(fā)明提出的細胞表征方法解決傳統(tǒng)利用各種物理模型來描述細胞物理狀態(tài)所存在的不充分與不全面的問題，根據(jù)多級次多相多孔介質(zhì)理論，更深刻的揭示細胞內(nèi)力學(xué)行為的本質(zhì)，更全面更綜合的描述細胞內(nèi)部的物理狀態(tài)?；诮M織也是多級次多相多孔介質(zhì)，本發(fā)明的方法可以適用于組織或仿生材料，將其應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)，將有可能幫助科學(xué)工作者認清疾病發(fā)生的原因以及對疾病的診斷和治療。

附圖說明

圖1為現(xiàn)有技術(shù)中錐形探針(a)、球形探針(b)分別對細胞進行壓痕實驗的示意圖；

圖2為根據(jù)本發(fā)明實施方式中細胞楊氏模量的獲取方法的總體流程圖；

圖3為根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選實施例中一個周期實驗中z向距離隨時間變化的曲線圖(a)、deflection隨z向距離變化的曲線圖(b)和deflection隨時間變化的曲線圖；

圖4為根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選實施例中利用傳統(tǒng)方法與本發(fā)明的方法所測量得到的3t3細胞楊氏模量值隨壓入深度變化的曲線圖；

圖5為根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選實施例中利用傳統(tǒng)方法與本發(fā)明的方法所測量得到的dc細胞楊氏模量值隨加載速率變化的曲線圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明提供的細胞楊氏模量的獲取方法，如圖2所示，包括：

s1.基于待測細胞表面的加載力-時間曲線，獲取待測細胞在時間為區(qū)域無窮大時的加載力與壓入深度；

s2.基于待測細胞在時間為區(qū)域無窮大時的加載力與壓入深度，利用赫茲模型計算得到待測細胞的楊氏模量。

本發(fā)明基于多孔介質(zhì)模型獲取細胞的楊氏模量，考慮到了利用傳統(tǒng)赫茲模型方法測量楊氏模量所未考慮到的細胞內(nèi)液態(tài)相的作用。在傳統(tǒng)測量楊氏模量的方法中，僅僅將細胞處理為純彈性體，用來計算楊氏模量的壓入深度與加載力的數(shù)據(jù)相當(dāng)于我們用多孔介質(zhì)模型計算時松弛曲線中t＝0的數(shù)據(jù)。而如若將細胞進行多孔介質(zhì)模型的處理，由于液態(tài)相的存在，在t＝0時，細胞內(nèi)的液態(tài)相還未重新分布，細胞的整體狀態(tài)還未完全穩(wěn)定下來，因此，所測量得到的楊氏模量很容易受到壓入深度與加載速率的影響。而如果選取松弛曲線中t＝∞時的值，細胞內(nèi)的液態(tài)相已經(jīng)完全重新分布，細胞的整體狀態(tài)已經(jīng)達到一個完全穩(wěn)定的狀態(tài)，此時，就可以排除在不同壓入深度與加載速率下液態(tài)相的不同行為而造成干擾，因此具有一定的優(yōu)越性與更高的準(zhǔn)確性。

基于在時間為區(qū)域無窮大∞下的加載力與壓入深度而非傳統(tǒng)方法中利用t為0時的加載力與壓入深度，利用赫茲模型計算得到的楊氏模量值更加精確，減少了在不同壓入深度以及不同加載速率下獲取得到的楊氏模量值之間的差異。

其中，壓入深度是指探針在待測細胞的表面的壓入深度。

赫茲模型為本領(lǐng)域中常用的赫茲模型，通常主要利用原子力顯微鏡afm探針對細胞進行壓痕實驗采集細胞的力-位移曲線以及afm探針的形變-時間(也稱deflection-t，或deflection-時間)的曲線。

針對不同形狀的探針可以利用不同的公式進行擬合，對于錐形探針，利用錐形探針對細胞進行壓痕實驗，如圖1中(a)所示，有：

對于球形探針，利用錐形探針對細胞進行壓痕實驗，如圖1中(b)所示，有：

其中，f是加載力，e是楊氏模量，v是泊松比，是錐形探針的半開角，r是球形探針的半徑，δ是壓入深度。

在本發(fā)明的實施方式中，將得到的加載力以及壓入深度代入上述模型中，就可以得到細胞的楊氏模量。

在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，所用的是球形探針，直徑通常為10μm。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實際需要以及各探針的已知優(yōu)缺點來選用不同類型或是不同尺寸的探針。

在本發(fā)明一個優(yōu)選實施例中，為了得到更加準(zhǔn)確的加載力以及壓入深度，s1具體為：

基于待測細胞表面afm探針的形變-時間曲線，利用粘彈性模型得到待測細胞表面的加載力-時間曲線，獲取待測細胞在時間為區(qū)域無窮大時的加載力與壓入深度。

其中，當(dāng)探針沿被測物體表面運動時，被測表面的反作用力使探針發(fā)生形變。使用afm探針時，可以通過待測細胞表面afm探針的形變-時間曲線去獲取待測細胞表面的加載力-時間曲線。

其中，根據(jù)afm探針的形變-時間(deflection-t)曲線，在粘彈性模型中，afm探針對細胞所施加的力可以通過：

f＝s×δ×k

來計算得到加載力-時間(f-t)的曲線，其中，s是探針的敏感度，δ是deflection值的變化，k是探針的力常數(shù)。

為了使數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確以及得到其它表征值，在本發(fā)明一個優(yōu)選實施例中，在形變deflection-時間t的變化曲線的獲取中，如圖3所示，數(shù)據(jù)采集步驟包括：退針段、靜置段、近針段和松弛段。

為了減少數(shù)據(jù)采集對不同壓入深度以及不同加載速率下測量得到的楊氏模量的影響，在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，優(yōu)選選用下述方法來采集數(shù)據(jù)：

s11.根據(jù)待測細胞的力曲線，估測得到探針與待測細胞接觸點的位置，以所述估測位置為接觸點，將探針抬起置于第一高度，記為退針段，采集退針段的時間值和afm探針deflection變化值；

s12.在第一高度將探針靜置，記為靜置段，采集靜置段的時間值和afm探針deflection變化值；

s13.以第一速度令探針下降第一距離，從而在細胞表面獲得第一壓入深度，記為近針段，采集近針段的時間值和afm探針deflection變化值；

s14.保持探針在第一壓入深度不變，記錄探針的松弛行為，記為松弛段，采集松弛段的時間值和afm探針deflection變化值。

同時，也可以在退針段、靜置段、近針段以及松弛段分別采集z向距離值，可以得到z向距離隨時間變化(z向距離-t)曲線以及形變隨z向距離變化(deflection-z向距離)曲線，如圖3所示，可以將整個實驗過程在不同的表象下表現(xiàn)出來。

其中，在s11中，在待測細胞上做一條力曲線來估測接觸點的位置。以該估測位置為接觸點，將探針抬起置于第一高度d0。

在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，為了更準(zhǔn)確地得到接觸點的位置，可以根據(jù)形變隨z向距離變化(deflection-z向距離)曲線，曲線的線性段與非線性段的分界點即為預(yù)估位置，以該預(yù)估位置為接觸點，將探針抬起置于第一高度d0。

在s12中，在靜置段，在該第一高度將探針靜置一段時間，該時間可以根據(jù)需要設(shè)置。不同細胞對探針的響應(yīng)有可能相同，也有可能不同，靜置片刻是為了使細胞恢復(fù)正常狀態(tài)，這個時間需要根據(jù)具體的實驗對象及現(xiàn)象來進行調(diào)整。一般是幾秒鐘。

在s13中，在近針段，第一速度可以根據(jù)需要設(shè)置，本發(fā)明中以至少10μm/s的速度為例詳述本發(fā)明。其中，第二高度為d1，壓入深度為δ。

在該速度范圍值內(nèi)，細胞中的液態(tài)物質(zhì)尚未重新分布。

在s14中，在松弛段，由于細胞流體相的重新分布，探針會表現(xiàn)出一個時間依賴性的松弛現(xiàn)象，記錄探針的松弛行為。

根據(jù)實驗需要，可以將第一高度d0和第一距離d1設(shè)為同樣或不同的值，可以采集到細胞在同一壓入深度或不同壓入深度下的實驗數(shù)據(jù)。

當(dāng)?shù)谝桓叨群偷谝痪嚯x值設(shè)為相同時，即，將探針抬起第一高度然后再下降與第一高度相同的距離，同時經(jīng)過靜置過程細胞恢復(fù)到正常狀態(tài)，那么下降后的位置與抬起前的位置是同樣的位置，即兩次實驗的壓入深度也是一樣的，即可采集到細胞在同一壓入深度下的實驗數(shù)據(jù)。

為了得到更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采集步驟還包括：將s11-s14設(shè)為一個周期，重復(fù)多個周期。

其中，本發(fā)明中的“多個”指2個或2個以上。

即上述一個周期的實驗完成后，可以緊接著進行下一個周期的實驗。

本發(fā)明還提供了一種細胞剛度的獲取方法，包括：使用上述細胞楊氏模量的測量方法獲取細胞楊氏模量，從而得到細胞的剛度。

其中，細胞的剛度與細胞楊氏模量一一對應(yīng)，從生物學(xué)的角度來看，都是用來表示細胞的軟硬程度。

由于該楊氏模量是在多孔介質(zhì)模型的思想上測量的，因此又可以將上述方法測量得到的楊氏模量稱之為細胞的介孔彈性。

即，本發(fā)明還提供了一種細胞介孔彈性的表征方法，包括：使用上述細胞楊氏模量的獲取方法獲取待測細胞楊氏模量，以表征細胞的介孔彈性。

本發(fā)明還提供了一種細胞物理狀態(tài)的表征方法，包括：使用楊氏模量、表觀粘度和擴散系數(shù)綜合表征細胞物理狀態(tài)；其中，楊氏模量為使用上述細胞楊氏模量的測量方法獲得。

在本發(fā)明的表征方法中，將細胞視為一個多級次多相多孔介質(zhì)，在傳統(tǒng)的模型假設(shè)上，赫茲模型將細胞假設(shè)為一個均質(zhì)彈性體，粘彈性模型將細胞看作是完全粘彈性體，多孔介質(zhì)模型將細胞假設(shè)為一個單一的多孔介質(zhì)體系。而這些假設(shè)均不符合細胞本身的狀態(tài)?；诩毎旧淼臓顟B(tài)，本發(fā)明創(chuàng)新地將細胞視為一個多級次多相多孔介質(zhì)，使用本發(fā)明所測量得到的楊氏模量結(jié)合表觀粘度和擴散系數(shù)來綜合表征細胞物理狀態(tài)，其中，使用本發(fā)明的方法得到的楊氏模量更能反映出細胞骨架的狀態(tài)，表觀粘度則與細胞液的狀態(tài)關(guān)系更大，擴散系數(shù)綜合描述了一個細胞內(nèi)部的活動狀態(tài)，彌補了以往各種模型對細胞進行物理狀態(tài)表征所存在的不足。

為了更準(zhǔn)確反映細胞液的狀態(tài)，表觀粘度為根據(jù)本發(fā)明的細胞楊氏模量的測量方法中松弛段的曲線，利用粘彈性模型進行擬合獲得。

為了更準(zhǔn)確反映細胞內(nèi)部的活動狀態(tài)，擴散系數(shù)為根據(jù)本發(fā)明的細胞楊氏模量的測量方法中松弛段的曲線，利用多孔介質(zhì)模型進行擬合獲得。

上述松馳段的曲線為細胞的形變-時間(deflection-t)曲線中的松馳段曲線，再根據(jù)f＝s×δ×k計算獲得該松馳段曲線的力-時間(f-t)曲線，分別利用粘彈性模型進行擬合獲得細胞表觀粘度值以及利用多孔介質(zhì)模型進行擬合獲得細胞的擴散系數(shù)。

也可以將細胞的整個形變-時間(deflection-t)曲線根據(jù)f＝s×δ×k計算獲得相應(yīng)的力-時間(f-t)曲線，再根據(jù)其中松弛段的曲線，分別利用粘彈性模型進行擬合獲得細胞表觀粘度值以及利用多孔介質(zhì)模型進行擬合獲得細胞的擴散系數(shù)。

其中，利用粘彈性模型進行擬合獲得細胞表觀粘度值為本領(lǐng)域中常見的方法，在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，具體為：

通過將松馳段的f-t曲線與如下方程進行擬合：

其中，er是松弛模量，τσ和τs分別是荷載和變形的松弛時間常數(shù)，表觀粘度可以根據(jù)下式進行計算：

μ＝er(τσ-τε)

其中，利用多孔介質(zhì)模型進行擬合獲得細胞的擴散系數(shù)為本領(lǐng)域中常見的方法，在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，具體為：

通過將松馳段的f-t曲線與如下方程進行擬合：

對于本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中的球形探針，有：

其中，d為擴散系數(shù)，α是有效接觸面積。

從上式中可以得到擴散系數(shù)d值。

在多孔介質(zhì)中，為了更加全面的反映細胞的物理狀態(tài)，通常還需要使用綜合孔隙度結(jié)合楊氏模量、表觀粘度和擴散系數(shù)一起來表征細胞物理狀態(tài)。

在本發(fā)明中，綜合孔隙度可以利用單一孔徑多孔介質(zhì)理論計算獲得，即，楊氏模量，表觀粘度，擴散系數(shù)以及孔徑大小有著如下的關(guān)系：

其中，ξ是孔徑大小，表征綜合孔隙度；d是擴散系數(shù)；α是有效接觸面積；e是楊氏模量。

在一個優(yōu)選的實施方式中，由于細胞內(nèi)多孔介質(zhì)結(jié)構(gòu)的不同最可能體現(xiàn)在其形貌特點上，因此采取兩種形貌差異較大的兩種細胞3t3細胞和dc細胞作為實驗對象。其中，3t3細胞大而薄，dc細胞小而厚。

使用本發(fā)明的方法對3t3細胞和dc細胞進行測量，如圖4所示，得到了針對3t3細胞在不同壓入深度下利用傳統(tǒng)方法與本發(fā)明的方法得到的楊氏模量值，如圖5所示，得到了針對dc細胞在不同加載速率下利用傳統(tǒng)方法與本發(fā)明的方法得到的楊氏模量值。

從圖中可以得出，使用本發(fā)明的方法在不同的壓入深度下以及不同的加載速度下，細胞楊氏模量的差異很小，不同于使用傳統(tǒng)方法所得到的值。

表1中給出了使用本發(fā)明的表征方法得到的3t3細胞以及dc細胞的剛度值、表觀粘度值、擴散系數(shù)以及綜合孔隙度。

表1用本發(fā)明的表征方法得到的細胞參數(shù)值

從表1中可以看出，對于不同細胞，其各種物理特性具有明顯的差異，且差異大小不一，因此，單用某一種物理量來表征細胞的狀態(tài)可能并不充分，需要綜合此四種參數(shù)來共同進行描述，可以更加全面與準(zhǔn)確的描述細胞的物理狀態(tài)。

本發(fā)明基于多級次多相多孔介質(zhì)理論，考慮到細胞內(nèi)流體相的存在，提出了利用赫茲模型獲取細胞楊氏模量以及剛度的新的采集數(shù)據(jù)的方法，完美的解決了傳統(tǒng)方法中一直存在的細胞剛度容易受壓入深度與加載速率的影響這兩個問題，也從側(cè)面揭示了傳統(tǒng)假設(shè)的不足。同時，本發(fā)明提出了用擴散系數(shù)，楊氏模量，表觀粘度以及綜合孔隙度來綜合描述細胞物理狀態(tài)的方法，它們可能分別與細胞整體的活躍度，細胞骨架的狀態(tài)，細胞液狀態(tài)以及細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)特點有關(guān)。如果將這套體系應(yīng)用到臨床醫(yī)學(xué)中去，可能有助于對多種疾病進行了解，診斷與治療，也可能為細胞的生理狀態(tài)提供一個新的衡量標(biāo)準(zhǔn)。

最后，本發(fā)明的方法僅為較佳的實施方案，并非用于限定本發(fā)明的保護范圍。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。