本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，具體的是涉及一種結(jié)核快速診斷試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：目前結(jié)核檢測技術(shù)分為四類：一、痰涂片，技術(shù)簡單，收費便宜，是篩查的主要手段，但是其陽性率低，不能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非典型結(jié)核分枝桿菌，使其臨床意義受到限制；二、基于特異性抗原抗體的免疫學(xué)檢測方法，此類方法操作簡單，但是特異性和敏感性都不好，使其在臨床推廣中收到限制；三、基于結(jié)核分枝桿菌dna的核酸擴增檢測方法，不管是普通pcr擴增還是等溫擴增方法，其檢測原理是通過特異性的引物檢測樣本(通常為痰液、胸水、肺沖洗液)中結(jié)核分枝桿菌的核酸。此類基于pcr的檢測方法，敏感度和特異性都比較高，但是需要專業(yè)的分子實驗室且檢測成本相對較高、只能檢測肺部結(jié)核，也限制了臨床的推廣；四、基于細胞免疫介導(dǎo)結(jié)核菌r-干擾素釋放的檢測試劑盒，目前比較有代表性的是t細胞斑點免疫法(t-spot)和凱杰公司推出的quantiferon-tb試劑盒，這兩種試劑盒在檢測的靈敏度和特異性方面，都達到了比較高的水平，但是價格十分昂貴，很難作為普篩推廣。我國是結(jié)核大國，結(jié)核病也被列入國家重大傳染病行列，是我們重點防治對象。目前使用的結(jié)核篩查方法，都有著不同方面的缺陷。因此，新的篩查方法的開發(fā)對結(jié)核病的防治，以及提高我國醫(yī)療衛(wèi)生水平有著重大的現(xiàn)實意義。、技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一是提供一種結(jié)核快速診斷試劑盒，該試紙條具有特異性高的優(yōu)點。一種結(jié)核快速診斷試劑盒，包括有特異性結(jié)核刺激抗原和試紙條，所述試紙條由樣品墊、熒光墊、包被膜、和吸水紙順次搭接設(shè)置在底板上構(gòu)成，所述熒光墊上結(jié)合有熒光微球，該熒光微球偶聯(lián)有r-干擾素結(jié)合抗體，所述包被膜上包被有r-干擾素單克隆捕獲抗體；所述特異性結(jié)核刺激抗原為:氨基酸序列如seqidno.1-seqidno.11所示的肽段。本發(fā)明的另一個目的是提供一種特異性結(jié)核刺激抗原。具體技術(shù)方案如下。一種特異性結(jié)核刺激抗原，選取結(jié)核分枝桿菌特異性抗原表達區(qū)域，在體外合成結(jié)核特異性多肽片段共11條。這些合成的多肽片段作為結(jié)核特異性的刺激抗原，用來刺激待測細胞。所述特異性結(jié)核刺激抗原有11條氨基酸序列分別如seqidno.1-seqidno.11所示的肽段。本發(fā)明的另一個目的是提供一種結(jié)核快速診斷試紙條。具體技術(shù)方案如下。一種結(jié)核快速診斷試紙條，所述試紙條由樣品墊、熒光墊、包被膜、和吸水紙順次搭接設(shè)置在底板上構(gòu)成，所述熒光墊上結(jié)合有熒光微球，該熒光微球偶聯(lián)有r-干擾素結(jié)合抗體，所述包被膜上包被有r-干擾素單克隆捕獲抗體。本發(fā)明的另一個目的是提供上述結(jié)核快速診斷試紙條的制備方法。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。上述結(jié)核快速診斷試紙條的制備方法，包括以下步驟：iv)制備包被膜：將0.4-0.6mg/ml的濃度的r-干擾素單克隆捕獲抗體，以0.8-1微升每厘米硝酸纖維素膜噴到硝酸纖維素膜上干燥，切條，得到包被膜備用；v)制備熒光墊：將r-干擾素結(jié)合抗體偶聯(lián)到熒光微球上，再將偶聯(lián)有抗體的熒光微球噴在結(jié)合墊上，干燥，切條，得到熒光墊備用；vi)將準備好的樣品墊、結(jié)合墊、包被膜、和吸水紙順次搭接設(shè)置在底板上，即得所述結(jié)核快速診斷試紙條。在其中一個實施例中，步驟ⅱ)中，以90-110ng/ul的濃度r-干擾素結(jié)合抗體，使用羧基-氨基共價結(jié)合的方式偶聯(lián)到熒光微球上(微球的濃度為0.8-1.2mg/ml，熒光微球與r-干擾素結(jié)合抗體的質(zhì)量比為9—11：1。步驟ⅱ)中，將偶聯(lián)有抗體的熒光微球以6-10微升每cm結(jié)合墊的量噴在結(jié)合墊上。本發(fā)明主要具有以下優(yōu)點：1)本發(fā)明的合成的多肽抗原為短的多肽片段(11-21aa)，其免疫源性大大增加，提高了刺激效率，且對比融合全長抗原或天然抗原，成本較低。2)特異性的抗原多肽，消除了卡介苗和非典型分枝桿菌的影響，檢測特異性大大提高。3)特殊的時間分辨r-干擾素快速檢測方法，從加樣到檢測可以在10分鐘內(nèi)完成，手工操作時間僅為10秒鐘，大大提高了檢測效率和臨床勞動強度，也使高通量篩查成為可能。附圖說明圖1為本發(fā)明的結(jié)核快速診斷試紙條的示意圖。具體實施方式為了便于理解本發(fā)明，下面將參照相關(guān)附圖對本發(fā)明進行更全面的描述。附圖中給出了本發(fā)明的較佳實施例。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實現(xiàn)，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。除非另有定義，本文所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中在本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實施例的目的，不是旨在于限制本發(fā)明。本文所使用的術(shù)語“和/或”包括一個或多個相關(guān)的所列項目的任意的和所有的組合。以上所述實施例的各技術(shù)特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當認為是本說明書記載的范圍。本發(fā)明的一個實施中，涉及到一種快速的r-干擾素檢測方法(見圖1)：當將含有ifn-γ的樣品滴在加樣區(qū)，待測樣品中的抗原(抗體)與結(jié)合墊中的熒光納米微球標記的抗體合并通過毛細作用向前層析，當達到檢測區(qū)后，與檢測線上固定的抗體合，形成微粒-抗體-抗原-抗體夾心復(fù)合物并被固定在檢測線上，而多余的熒光微球標記物繼續(xù)向前層析，與固定在質(zhì)控線二抗結(jié)合。反應(yīng)結(jié)束后，用紫外光源(365nm)對檢測區(qū)掃描檢測，檢測線和質(zhì)控線上熒光納米微球發(fā)出高強度的熒光(615nm)，且衰變時間也較長。利用延緩測量時間，待樣品基質(zhì)中自然發(fā)生的短壽命熒光全部衰變后，再測量微球的特異性熒光，這樣就可以完全排除特異本底熒光的干擾。通過檢測線和質(zhì)控線熒光強度的強弱及其比值，即可分析出樣品中待測物的濃度。本實施例中，所述結(jié)核快速診斷試劑盒結(jié)核快速診斷試劑盒，包括有特異性結(jié)核刺激抗原和試紙條，其制備方法和檢測如下所述。1)特異性結(jié)核刺激抗原多肽片段:teqqwnfagieaaasa(seqidno.1)；ieaaasaiqgnvts(seqidno.2)；aiqgnvtsihslldegkqsltkl(seqidno.3)；qsltklaaawggsgseayqgvq(seqidno.4)；gseayqgvqqkwdatatelnna(seqidno.5)；nferisgdlktqidqvestagsl(seqidno.6)；qvestagslqgqwrgaagtmq(seqidno.7)；rqagvqysradeeqqqalss(seqidno.8)；lfaataaaaaavdrgdpp(seqidno.9)；asaaalagdaagawr(seqidno.10)；msghalaartllaaa(seqidno.11)。2)首先合成上述片段的多肽，純度需大于85％。其次，將11種多肽片段等比混合后，先加入dmso(二甲基亞砜)溶解(每50mg多肽加入100uldmso)，然后用無內(nèi)毒素的dpbs(杜氏磷酸鹽緩沖液)稀釋成5mg/ml的溶液備用，儲存于-20攝氏度備用。用時取肝素鋰抗凝全血1ml，加入上述抗原混合液5ul,于37攝氏度過夜培養(yǎng)，分離血漿待檢。3)全血細胞刺激實驗：試用肝素鋰抗凝的采血管，取至少3.5ml血液，立即顛倒試管混勻若干次。取三支空白采血管，分別加入5ulpbs溶液，標記為陰性對照管(n)，5ul濃度為5mg/ml的pha溶液，標記為陽性對照管(p)，5ul濃度為5mg/ml的上述抗原溶液。每管中加入1ml血樣，并于37攝氏度，培養(yǎng)16-24小時。培養(yǎng)后的全血在3000g離心15分鐘，分離血漿，待測。4)一種r-干擾素干式熒光免疫試紙條的制備：a)原材料準備：硝酸纖維素膜(nc膜)包被，將r-干擾素單克隆捕獲抗體(杭州啟泰，克隆號：mjh01)，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)操作方法，以0.5mg/ml的濃度，以0.9微升每厘米硝酸纖維素膜噴到膜上，并在37攝氏度干燥12小時，切條備用(2.5cmx30cm)；b)原材料準備：熒光墊處理，將r-干擾素結(jié)合抗體(杭州啟泰，克隆號：mjh03)以100ng/ul的濃度，使用羧基-氨基共價結(jié)合的方式偶聯(lián)到濃度為1mg/ml的熒光微球上，熒光微球與結(jié)合抗體的用量比為10：1(質(zhì)量比)；再將偶聯(lián)有抗體的熒光微球以1mg/ml的濃度，以每cm結(jié)合墊8微升噴在結(jié)合墊(玻璃纖維)上得到熒光墊，并于37攝氏度干燥12小時，切條備用(1cmx30cm)。以上所用的抗體、微球的濃度和用量，按照所用的總量不變，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)試紙條制備的常識可以相應(yīng)地換算和改動。c)樣本墊制備：上海金標的玻纖，經(jīng)過0.01mpb溶液(磷酸二氫鈉+磷酸氫二鈉緩沖液，ph7.4)浸泡，然后于37攝氏度干燥12小時，切條備用(1.5cmx30cm)。d)支持物準備：將吸水紙(3.1cmx30cm)和pvc(8cmx30cm)板切成相應(yīng)規(guī)格，備用。e)將上述預(yù)處理的原材料按照樣品墊(樣品墊為玻璃纖維)、結(jié)合墊、包被膜、吸水紙的順序，貼在底板(pvc板)上，各組分之間有1毫米左右的重疊。f)切條：將貼好的大板切成4mmx8cm規(guī)格的試紙條，并裝入卡槽中，包裝成成品，質(zhì)檢后入庫備用。即得到所述試紙條，該試紙條由樣品墊、熒光墊、包被膜、和吸水紙順次搭接設(shè)置在底板上構(gòu)成，所述熒光墊上結(jié)合有熒光微球，該熒光微球偶聯(lián)有r-干擾素結(jié)合抗體，所述包被膜上包被有r-干擾素單克隆捕獲抗體。5)取r-干擾素檢測試紙條，加入50ul待測血漿，反應(yīng)10分鐘，利用干式免疫熒光分析儀測量熒光值，并換算成r-干擾素濃度(每一批次的試紙條出廠時都會帶有一個熒光值對應(yīng)干擾素濃度的標準曲線，標準曲線是通過0.25iu,1iu,4iu,8iu的標準品定量得來的)。每一例樣本同時做陰性對照和陽性對照刺激。結(jié)果判讀如下表：陰性對照(n)，陽性對照(p)，抗原刺激(t)；單位iu/ml。實施例2一、檢測目的本實施例采用實施例1所述結(jié)核快速診斷試劑盒和檢測方法，評價所述該試劑盒的檢測效果，以及相應(yīng)的特異性和靈敏度。二、檢測樣品表1中的檢測樣品為廣東省第二人民醫(yī)院(廣東省應(yīng)急醫(yī)院)承擔的臨床樣本經(jīng)過實驗室確診方法確認為結(jié)核陽性和陰性樣本各78例。表2中的檢測樣品為廣東省第二人民醫(yī)院(廣東省應(yīng)急醫(yī)院)承擔臨床樣本經(jīng)過實驗室確診方法確認為卡介苗接種者的結(jié)核陽性樣本60例，非典型分枝桿菌感染者22例。表3中的檢測樣品為219例臨床采集的全血樣本(廣東省第二人民醫(yī)院(廣東省應(yīng)急醫(yī)院)。對比試劑的r-干擾素的檢測采用的是elisa檢測方式，操作完成按照試劑說明書進行。三、實驗過程：1)全血樣本采集：使用肝素鋰抗凝的采血管，采集全血樣本，每個樣本量不少于3.5ml.采集血液后，立即顛倒采血管，混勻，采集的血樣于室溫保存不超過4小時，應(yīng)用于抗原刺激實驗。2)抗原刺激實驗：取三支空白采血管，分別標記p(陽性對照管)、n(陰性對照管)、t(結(jié)核抗原刺激管)。將采集的全血，吸取1ml分別加入三個對應(yīng)的管子中。在p管中加入5ul濃度為10mg/ml的植物凝血素原(購自sigma)；在n管中加入5ul的pbs溶液(不加結(jié)核抗原刺激液)；在t管中加入5ul濃度為10mg/ml的上述結(jié)核抗原刺激液；加樣后，顛倒采血管若干次，以混勻。然后，靜置37度烘箱，過夜培養(yǎng)(16小時-24小時)。3)r-干擾素濃度測定：將過夜培養(yǎng)的缺血，在3000g離心15分鐘，取上清用于檢測。取50ul上清液，加入r-干擾素定量檢測試紙條，反應(yīng)15分鐘，使用熒光免疫分析儀，讀取r-干擾素的濃度。結(jié)果判定方式見上述表格。四、檢測結(jié)果表一：陰陽性符合率的表二：特異性實驗樣本類型臨床診斷實施例結(jié)果特異性全血樣本60例結(jié)核陰性，卡介苗接種者60例陰性好全血樣本22例結(jié)核陰性，非典型分枝桿菌感染者22例陰性好表三：比對性實驗靈敏度：121/(121+2)x100％＝98.4％特異性：95/(95+1)x100％＝99.0％總符合率：(121+95)/(121+1+2+95)x100％＝98.6％。結(jié)果分析：總共219例臨床采集的全血樣本，分別用于刺激。收集的血漿，用r-干擾素定量檢測試紙條或者elisa的方法檢測。我們的結(jié)果顯示，實施例所述檢測試劑盒共測的122例陽性，97例陰性樣本。而比對試劑測的123例陽性，96例陰性。實施例1所述檢測試劑盒的靈敏度為98.4％，特異性為99％，具有非常高的靈敏度和特異性。實施例和比對試劑(凱杰公司的qft產(chǎn)品)的總符合率為98.6％，具有非常高的一致性。需要說明的是，實施例1所述檢測試劑盒中所述特異性結(jié)核刺激抗原多肽片段，應(yīng)該包括上述11種同時使用，發(fā)明人在實驗中發(fā)現(xiàn)，這11條多肽，如果缺少其中一條，陽性率都會下降，通過統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)其中缺一條，陽性率通常會要下降15-25％。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。sequencelisting<110>廣州市寶創(chuàng)生物技術(shù)有限公司<120>結(jié)核快速診斷試劑盒及其制備方法<160>11<170>patentinversion3.3<210>1<211>16<212>prt<213>人工序列<400>1thrgluglnglntrpasnphealaglyileglualaalaalaserala151015<210>2<211>14<212>prt<213>人工序列<400>2ileglualaalaalaseralaileglnglyasnvalthrser1510<210>3<211>23<212>prt<213>人工序列<400>3alaileglnglyasnvalthrserilehisserleuleuaspglugly151015lysglnserleuthrlysleu20<210>4<211>22<212>prt<213>人工序列<400>4glnserleuthrlysleualaalaalatrpglyglyserglyserglu151015alatyrglnglyvalgln20<210>5<211>22<212>prt<213>人工序列<400>5glyserglualatyrglnglyvalglnglnlystrpaspalathrala151015thrgluleuasnasnala20<210>6<211>23<212>prt<213>人工序列<400>6asnphegluargileserglyaspleulysthrglnileaspglnval151015gluserthralaglyserleu20<210>7<211>21<212>prt<213>人工序列<400>7glnvalgluserthralaglyserleuglnglyglntrpargglyala151015alaglythrmetgln20<210>8<2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