相關申請的交叉參考

本申請要求2011年12月23日提交的美國臨時申請系列號61/580,139的優(yōu)先權。在先申請的公開內容被認為是本申請公開的部分(且通過引用納入本文)。

有關聯(lián)邦資助的研究的聲明

本發(fā)明是在國立衛(wèi)生研究院(nationalinstitutesofhealth)授予的hl036634和hl076611下由政府資助完成。政府對本發(fā)明擁有某些權利。

背景

1.技術領域

本發(fā)明涉及評價腎結構改變(如腎纖維化)的方法和材料以及評價后果的方法和材料。例如，本發(fā)明涉及使用尿液c型利尿鈉肽(cnp)的水平(如尿液與血漿cnp的比率)或血漿cnp的水平以確定哺乳動物是否正發(fā)生腎結構改變(如腎纖維化、腎小球基底增厚、足細胞腫脹和足突消失)的方法和材料。本發(fā)明還涉及使用尿液或血漿cnp(可包括六種分子cnp形式)水平鑒定心力衰竭患者的方法和材料，所述患者發(fā)生不良結果的幾率增加且可能罹患已知與腎臟相關的疾病，所述疾病包括但不限于心力衰竭、高血壓、糖尿病、代謝綜合征和慢性腎疾病。

2.背景信息

c型利尿鈉肽(cnp)是利尿鈉肽家族中的一部分，在腎臟及內皮中生成并可在血漿和尿液中檢測到。首先合成前體103個氨基酸(aa)的蛋白質procnp(aa1-103)，然后被細胞內內切蛋白酶弗林蛋白酶切割成cnp-53(aa51-103)和nt-procnp(aa1-50)。由一未知酶催化的進一步下游加工對將cnp-53切割成主要的生物活性形式cnp-22(aa82-103)及其氨基端nt-cnp-53(51-81)。

通過激活利尿鈉肽受體b(npr-b，也被稱作鳥苷酸環(huán)化酶受體b(gc-b))并生成第二信使3’，5’-環(huán)鳥苷一磷酸(cgmp)，cnp擁有強大的抗纖維化和抗增殖特性。cnp含有有限的排鈉利尿和利尿活性。

概述

本發(fā)明提供了涉及評價腎結構改變(如腎纖維化、腎小球基底增厚、足細胞腫脹和足突消失)的方法和材料。例如，本發(fā)明提供了使用尿液cnp(如尿液與血漿cnp的比率)和/或血漿cnp的水平以確定哺乳動物是否正在或將要發(fā)生腎結構改變(如腎纖維化、腎小球基底增厚、系膜基質膨脹、足細胞腫脹和足突消失)的方法和材料。通過評價尿液或血漿cnp水平(如尿液與血漿cnp的比率)確定人類患者是否正在或將要發(fā)生腎結構改變能夠有助于在癥狀和疾病出現(xiàn)前鑒定臨床前腎結構改變的人，從而啟動設計用于防止慢性腎疾病發(fā)展的策略。

本發(fā)明還提供了評價心力衰竭結果的方法和材料。例如，本發(fā)明提供了使用尿液或血漿cnp和/或其六個可能的分子形式(圖8)鑒定發(fā)生不良結果幾率增加的人的方法和材料。至少部分基于尿液cnp水平上升和/或血漿cnp水平降低對發(fā)生不良結果幾率增加的患者的鑒定能夠幫助醫(yī)生和患者做出適當的治療決定。

總的來說，本發(fā)明的一個方面描述了一種評價腎結構的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：確定哺乳動物的尿液cnp與血漿cnp的比率是否升高，尿液cnp與血漿cnp的比率升高表明哺乳動物腎結構改變或有可能發(fā)生腎結構改變，且尿液cnp與血漿cnp的比率未升高表明哺乳動物未發(fā)生且不會發(fā)生腎結構改變。所述哺乳動物可以是人。所述腎結構改變可以包括腎纖維化。升高的尿液cnp與血漿cnp的比率可以高于12,000pg/天比16pg/ml。升高的尿液cnp與血漿cnp的比率可以高于13,200pg/天比18pg/ml。

在另一個方面，本發(fā)明描述了一種評價腎結構的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：確定哺乳動物的尿液cnp-22與血漿cnp-22的比率是否升高，尿液cnp-22與血漿cnp-22的比率升高表明哺乳動物腎結構改變或有可能發(fā)生腎結構改變，且不存在尿液cnp-22與血漿cnp-22的比率升高表明哺乳動物未發(fā)生且不會發(fā)生腎結構改變。所述哺乳動物可以是人。所述腎結構改變可以包括腎纖維化。升高的尿液cnp-22與血漿cnp-22的比率可以高于12,000pg/天比16pg/ml。升高的尿液cnp-22與血漿cnp-22的比率可以高于13,200pg/天比18pg/ml。

在另一個方面，本發(fā)明描述了一種評價腎結構的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：(a)檢測哺乳動物的尿液cnp與血漿cnp的比率是否升高，以及(b)至少部分基于檢測結果將哺乳動物鑒定為存在腎結構改變或可能發(fā)生腎結構改變。所述哺乳動物可以是人。所述腎結構改變可以包括腎纖維化。升高的尿液cnp與血漿cnp的比率可以高于12,000pg/天比16pg/ml。升高的尿液cnp與血漿cnp的比率可以高于13,200pg/天比18pg/ml。

在另一個方面，本發(fā)明描述了一種評價腎結構的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：(a)檢測哺乳動物的尿液cnp-22與血漿cnp-22的比率是否升高，以及(b)至少部分基于檢測結果將哺乳動物鑒定為存在腎結構改變或可能發(fā)生腎結構改變。所述哺乳動物可以是人。所述腎結構改變可以包括腎纖維化。升高的尿液cnp-22與血漿cnp-22的比率可以高于12,000pg/天比16pg/ml。升高的尿液cnp-22與血漿cnp-22的比率可以高于13,200pg/天比18pg/ml。

在另一個方面，本發(fā)明描述了一種評價結果的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：確定哺乳動物是否患有一種會使尿液cnp水平升高的疾病，尿液cnp水平升高表明哺乳動物可能發(fā)生不良結果，且尿液cnp水平未升高表明哺乳動物不可能發(fā)生不良結果。所述哺乳動物可以是人。所患疾病可以是心力衰竭、高血壓、糖尿病、代謝綜合征或慢性腎臟疾病。所述不良結果可以是死亡、住院治療、心力衰竭、心肌梗塞、腎功能惡化、心臟功能惡化或透析。所述尿液cnp可以是尿液nt-cnp-53。升高的水平可以高于36,000pg的nt-cnp-53/天。升高的水平可以高于42,000pg的nt-cnp-53/天。

在另一個方面，本發(fā)明描述了一種評價結果的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：(a)檢測患病哺乳動物的尿液cnp是否升高，以及(b)至少部分基于檢測結果將哺乳動物鑒定為可能發(fā)生不良結果。所述哺乳動物可以是人。所患疾病可以是心力衰竭、高血壓、糖尿病、代謝綜合征或慢性腎臟疾病。所述不良結果可以是死亡、住院治療、心力衰竭、心肌梗塞、腎功能惡化、心臟功能惡化或透析。所述尿液cnp可以是尿液nt-cnp-53。升高的水平可以高于36,000pg的nt-cnp-53/天。升高的水平可以高于42,000pg的nt-cnp-53/天。

在另一個方面，本發(fā)明描述了一種評價腎結構的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：(a)使用抗-cnp抗體進行免疫試驗以檢測哺乳動物中尿液cnp與血漿cnp的比率升高，以及(b)將哺乳動物鑒定為存在腎結構改變或可能發(fā)生腎結構改變。所述哺乳動物可以是人。所述腎結構改變可以包括腎纖維化。升高的尿液cnp與血漿cnp的比率可以高于12,000pg/天比16pg/ml。升高的尿液cnp與血漿cnp的比率可以高于13,200pg/天比18pg/ml。

在另一個方面，本發(fā)明描述了一種評價腎結構的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：(a)使用抗-cnp抗體進行免疫試驗以檢測哺乳動物中尿液cnp-22與血漿cnp-22的比率升高，以及(b)將哺乳動物鑒定為存在腎結構改變或可能發(fā)生腎結構改變。所述哺乳動物可以是人。所述腎結構改變可以包括腎纖維化。升高的尿液cnp-22與血漿cnp-22的比率可以高于12,000pg/天比16pg/ml。升高的尿液cnp-22與血漿cnp-22的比率可以高于13,200pg/天比18pg/ml。

在另一個方面，本發(fā)明描述了一種評價結果的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：(a)使用抗-cnp抗體進行免疫試驗以檢測患病哺乳動物中尿液cnp水平是否升高，以及(b)至少部分基于檢測結果將哺乳動物鑒定為可能發(fā)生不良結果。所述哺乳動物可以是人。所患疾病可以是心力衰竭、高血壓、糖尿病、代謝綜合征或慢性腎臟疾病。所述不良結果可以是死亡、住院治療、心力衰竭、心肌梗塞、腎功能惡化、心臟功能惡化或透析。所述尿液cnp可以是尿液nt-cnp53。升高的水平可以高于36,000pg的nt-cnp53/天。升高的水平可以高于42,000pg的nt-cnp53/天。

在另一個方面，本發(fā)明描述了一種評價哺乳動物是否存在死亡或心肌梗塞風險升高的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：確定哺乳動物的血漿cnp-22水平是否升高，血漿水平升高表明該哺乳動物有可能比該水平未升高的同等哺乳動物早發(fā)生死亡或心肌梗塞，且血漿水平未升高表明該哺乳動物有可能比該水平升高的同等哺乳動物晚發(fā)生死亡或心肌梗塞。所述哺乳動物可以是人。升高的水平可以高于14pg/ml。升高的水平可以高于16pg/ml。

在另一個方面，本發(fā)明描述了一種評價哺乳動物是否存在死亡或心肌梗塞風險升高的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：(a)使用抗-cnp抗體進行免疫試驗以檢測哺乳動物中血漿cnp-22水平是否升高，以及(b)至少部分基于檢測結果將哺乳動物鑒定為可能發(fā)生死亡或心肌梗塞。所述哺乳動物可以是人。升高的水平可以高于14pg/ml。升高的水平可以高于16pg/ml。所述方法可包括將哺乳動物鑒定為可能比該水平未升高的同等哺乳動物早發(fā)生死亡或心肌梗塞。

在另一個方面，本發(fā)明描述了一種治療腎結構改變風險升高的哺乳動物的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：(a)確定哺乳動物的尿液cnp與血漿cnp的比率升高，(b)監(jiān)測哺乳動物是否存在腎結構改變的風險因素，以及(c)指導給予哺乳動物治療劑以減輕腎結構改變的癥狀。所述哺乳動物可以是人。升高的尿液cnp與血漿cnp的比率可以高于12,000pg/天比16pg/ml。升高的尿液cnp與血漿cnp的比率可以高于13,200pg/天比18pg/ml。所述風險因素可以選自由以下因素組成的組：年齡因素、高血壓、血清肌酸酐水平升高、蛋白尿、體重指數升高、膽固醇水平升高、吸煙習慣和糖尿病。所述治療劑可以是ace抑制劑、血管緊張素受體阻斷劑、醛固酮拮抗劑、抑制素、天然利尿鈉肽或設計利尿鈉肽。

在另一個方面，本發(fā)明描述了一種治療不良結果風險升高的哺乳動物的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：(a)確定哺乳動物的尿液cnp水平升高，(b)監(jiān)測哺乳動物是否存在不良結果的風險因素，以及(c)指導給予哺乳動物治療劑以降低不良結果發(fā)生的可能性。所述哺乳動物可以是人。所述尿液cnp可以是尿液nt-cnp-53。升高的水平可以高于36,000pg的nt-cnp-53/天。升高的水平可以高于42,000pg的nt-cnp-53/天。所述風險因素可以選自由以下因素組成的組：年齡因素、高血壓、血清肌酸酐水平升高、蛋白尿、體重指數升高、膽固醇水平升高、吸煙習慣和糖尿病。所述治療劑可以是ace抑制劑、血管緊張素受體阻斷劑、醛固酮拮抗劑、抑制素、天然利尿鈉肽或設計利尿鈉肽。

在另一個方面，本發(fā)明描述了一種治療心肌梗塞風險升高的哺乳動物的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：(a)確定哺乳動物的血漿cnp-22水平升高，(b)監(jiān)測哺乳動物是否存在心肌梗塞的風險因素，以及(c)指導給予哺乳動物治療劑以降低心肌梗塞的風險。所述哺乳動物可以是人。升高的水平可以高于14pg/ml。升高的水平可以高于16pg/ml。所述風險因素可以選自由以下因素組成的組：年齡因素、高血壓、血清肌酸酐水平升高、蛋白尿、體重指數升高、膽固醇水平升高、吸煙習慣和糖尿病。所述治療劑可以是ace抑制劑、血管緊張素受體阻斷劑、醛固酮拮抗劑、抑制素、天然利尿鈉肽或設計利尿鈉肽。

除非另外定義，本文使用的所有技術和科學術語的意義與本發(fā)明所屬領域普通技術人員通常所理解的相同。雖然在本發(fā)明的實施或測試中可以采用類似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但下文描述了合適的方法和材料。本文中述及的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻都通過引用全文納入本文。在抵觸的情況下，以本說明書(包括定義在內)為準。此外，材料、方法和實施例都僅是說明性的，并不意在構成限制。

從下文的詳述和權利要求中能夠很容易地了解本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點。

附圖說明

圖1.(a)天狼猩紅染色在20x物鏡放大下的代表性組織學圖像和定量(b)2、11和20個月齡費歇爾大鼠的腎皮質纖維化的20x物鏡放大下的代表性組織學圖像。數值為平均值±se。所有年齡組中n＝7。*p＜0.05相對于2個月，p＜0.05相對于11個月。

圖2.(a)天狼猩紅染色在20x物鏡放大下的代表性組織學圖像和定量(b)2、11和20個月齡費歇爾大鼠的腎髓質纖維化的20x物鏡放大下代表性組織學圖像。數值為平均值±se。所有年齡組中n＝7。*p＜0.05相對于2個月，p＜0.05相對于11個月。

圖3.來自2個月(a)、11個月(b)和20個月(c)齡費歇爾大鼠的腎小球在8000x放大下的代表性電子顯微鏡圖。

圖4.來自2、11和20個月齡費歇爾大鼠中腎小球基底增厚的定量。數值為平均值±se。所有年齡組中n＝5。*p＜0.05相對于2個月，p＜0.05相對于11個月。

圖5.來自2、11和20個月齡費歇爾大鼠中腎皮質和髓質cnp的免疫組化定位在20x物鏡放大下的代表性圖像。

圖6.在2、11和20個月齡費歇爾大鼠之間血漿cnp(a)、尿液cnp排泄(b)、尿液與血漿cnp的比率(c)和蛋白尿(d)的變化。數值為平均值±se。所有年齡組中n＝10。*p<0.05相對于2個月，相對于11個月。

圖7.尿液cnp排泄與腎皮質(a)和髓質(b)纖維化、以及尿液與血漿cnp的比率與腎皮質(c)和髓質(d)纖維化之間的關聯(lián)。

圖8為cnp分子形式的示意圖。

圖9為cnp分子形式的氨基酸序列表。

圖10.來自年輕人類供體(a-c)和年長人類供體(d-f)的腎組織內cnp免疫組化定位在20x物鏡放大下的圖像。陰性對照(g)。

圖11.腎小球基底膜(gbm)厚度與尿液cnp排泄之間(a)以及gbm厚度與尿液與血漿cnp的比率之間(b)的關聯(lián)。

圖12.adhf患者(hhf)對比對照組中尿液kim-1排泄。帶有24小時kim-1排泄數值的中位數和四分位差(iqr；盒)以及1.5*iqr(誤差線)的異常值盒狀圖。

圖13a-c。nt-cnp-53排泄和臨床結果之間的關聯(lián)：(a)死亡率，(b)首次非選擇性(所有原因)再入院治療的時間/死亡，(c)首次非選擇性心血管再入院治療的時間/死亡。帶有24小時nt-cnp-53排泄數值的中位數和四分位差(iqr；盒)以及1.5*iqr(誤差線)的異常值盒狀圖(轉化成自然對數數據)。

圖14a-c。adhf中主要結果(死亡率)形成的cnp分子的尿液排泄。顯示adhf中24小時尿液的(a)cnp22、(b)cnp53和(c)nt-cnp53排泄數值的中位數和四分位差(iqr；盒)以及1.5*iqr(誤差線)相對于死亡率的異常值盒狀圖。

圖15a-b。普通人群中根據血漿cnp-22水平四分位數的死亡(a)和心肌梗塞(mi；b)的卡普蘭-邁耶曲線。cnp-22q1為2.0至10.1pg/ml；cnp-22q2為10.2至13.1pg/ml；cnp-22q3為13.2至16.7pg/ml；且cnp-22q4為16.8至265.0pg/ml。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供了涉及評價腎結構改變(如腎纖維化)的方法和材料。例如，本發(fā)明提供了使用尿液cnp水平(例如尿液與血漿cnp的比率)和/或血漿cnp水平以確定哺乳動物是否腎結構改變或有可能發(fā)生腎結構改變的方法和材料。如本文所述，存在尿液cnp水平升高、血漿cnp水平降低和/或尿液與血漿cnp的比率升高表明哺乳動物腎結構改變或有可能發(fā)生腎結構改變。腎結構改變的示例包括但不限于腎纖維化、腎小球基底膜增厚、系膜基質膨脹、足細胞腫脹和足突消失。本文所提供的方法和材料可用于評價任何適當哺乳動物中的腎結構改變，所述哺乳動物包括但不限于人類、猴、馬、奶牛、綿羊、山羊、小鼠和大鼠。

人類cnp的六種分子形式的氨基酸序列列于圖8和9。

本文中相對于血漿或尿液cnp水平(或cnp的一種特定分子形式，如cnp-53)所用術語“升高的水平”表示高于沒有腎疾病的健康哺乳動物的年齡匹配隨機群體(如含有10、20、30、40、50、100或500個健康哺乳動物的年齡匹配隨機群體)中血漿或尿液水平中位數的任意水平。在一些情況下，血漿cnp(如血漿cnp-22)升高的水平可以是高于16pg/ml的任意水平。在一些情況下，尿液cnp(如尿液cnp-22)升高的水平可以是高于12,000pg/天的任意水平。

本文中相對于尿液cnp與血漿cnp的比率所用術語“升高”表示高于沒有腎疾病的健康哺乳動物的年齡匹配隨機群體(如含有10、20、30、40、50、100或500個健康哺乳動物的年齡匹配隨機群體)中尿液cnp與血漿cnp的比率平均值的任意比率水平。在一些情況下，升高的尿液cnp與血漿cnp的比率可以是高于12,000pg/天的尿液cnp比16pg/ml血漿cnp的一個比率。在一些情況下，可使用血漿cnp與尿液cnp的比率替代尿液cnp與血漿cnp的比率。

在一些情況下，血漿cnp水平降低可表明哺乳動物腎結構改變或有會發(fā)生腎結構改變或可能發(fā)生不良結果。本文中相對于血漿cnp水平所用術語“降低的水平”表示低于沒有腎疾病的健康哺乳動物的年齡匹配隨機群體(如含有10、20、30、40、50、100或500個健康哺乳動物的年齡匹配隨機群體)中血漿cnp水平中位數的任意水平。在一些情況下，降低的血漿cnp水平可以是低于10pg/ml的任意水平。

在一些情況下，存在血漿cnp水平降低、尿液cnp水平升高和血漿nt-probnp水平升高可表明哺乳動物腎結構改變或可能發(fā)生腎結構改變或可能發(fā)生不良結果。本文中相對于血漿nt-probnp水平所用術語“升高的水平”表示高于沒有腎疾病的健康哺乳動物的年齡匹配隨機群體(如含有10、20、30、40、50、100或500個健康哺乳動物的年齡匹配隨機群體)中血漿水平中位數的任意水平。在一些情況下，血漿nt-probnp升高的水平可以是高于450pg/ml的任意水平。

可使用任意適當方法以確定尿液cnp水平、血漿cnp水平、尿液cnp與血漿cnp的比率、血漿nt-probnp水平或血漿cnp與尿液cnp的比率。例如，可使用多肽檢測法(如免疫試驗(如elisa或放射免疫試驗))和質譜確定血漿或尿液樣品中的cnp水平。在一些情況下，可使用放射免疫試驗確定尿液cnp與血漿cnp的比率。

本發(fā)明還提供了涉及評價結果的方法和材料。例如，本發(fā)明提供了使用尿液cnp或其六種可能的分子形式(如cnp-53或nt-cnp-53)的水平以確定哺乳動物是否可能發(fā)生不良結果的方法和材料。如本文所述，存在尿液cnp水平升高表明哺乳動物可能發(fā)生不良結果。不良結果的示例包括但不限于死亡、住院、心力衰竭、心肌梗塞、腎功能惡化、心臟功能惡化和透析。本文所提供的方法和材料可用于評價任何適當哺乳動物中的結果，所述哺乳動物包括但不限于人類、猴、馬、奶牛、綿羊和山羊。

在一些情況下，本文中相對于尿液nt-cnp-53水平所用術語“升高的水平”表示高于健康哺乳動物的年齡匹配隨機群體(如含有10、20、30、40、50、100或500個健康哺乳動物的年齡匹配隨機群體)中尿液nt-cnp-53水平中位數的任意水平，所述健康哺乳動物沒有其他共病病史，如心力衰竭、高血壓、糖尿病、代謝綜合征或慢性腎臟疾病。在一些情況下，升高的尿液nt-cnp-53水平可以是高于36,000pg/天的任意水平。

本發(fā)明還提供了幫助醫(yī)療或研究專家確定哺乳動物是否腎結構改變或有可能發(fā)生腎結構改變的方法和材料以及幫助醫(yī)療或研究專業(yè)人員確定哺乳動物是否可能發(fā)生不良結果的方法和材料。醫(yī)療專業(yè)人員可以是例如醫(yī)生、護士、醫(yī)療實驗室技術人員和藥劑師。研究專業(yè)人員可以是例如研究負責人、研究技術員、博士后研究員或研究生?？梢酝ㄟ^(1)確定尿液cnp水平、血漿cnp水平、尿液cnp與血漿cnp的比率或血漿cnp與尿液cnp的比率，以及(2)將上述水平和比率的信息與專業(yè)人員交流的方式幫助專業(yè)人員確定哺乳動物是否腎結構改變或有可能發(fā)生腎結構改變?？梢酝ㄟ^(1)確定尿液cnp水平，以及(2)將上述水平的信息與專業(yè)人員交流的方式幫助專業(yè)人員確定哺乳動物是否可能發(fā)生不良結果。

可使用任何方法與其他人員(如專業(yè)人員)交流信息。例如，可以將信息直接或間接地提供給專業(yè)人員。此外，可使用任何形式的交流方式以交流信息。例如，可使用郵件、電子郵件、電話和面對面交談。也可以通過將這些信息電子化的方式將信息傳遞給專業(yè)人員來與專業(yè)人員交流信息。例如可以通過將信息置于計算機數據庫中以使專業(yè)人員能夠獲得該信息，從而實現(xiàn)與專業(yè)人員交流信息。此外，信息可以傳遞給醫(yī)院、診所、或者作為所述專業(yè)人員媒介的研究機構。

本發(fā)明還提供了治療腎結構改變或有可能發(fā)生腎結構改變的哺乳動物的方法和材料。例如，可以評價哺乳動物以確定哺乳動物的尿液cnp與血漿cnp的比率是否升高。如本文所述，尿液cnp與血漿cnp的比率升高的哺乳動物可能腎結構改變或有可能發(fā)生腎結構改變。一旦哺乳動物被鑒定為尿液cnp與血漿cnp的比率升高，可監(jiān)測該哺乳動物以確定是否存在腎結構改變的一項或多項風險因素。例如，可監(jiān)測或評價該哺乳動物以確定是否存在年齡因素、高血壓、血清肌酸酐水平升高、蛋白尿、男性性別、體重指數升高、膽固醇水平升高、吸煙習慣和/或糖尿病。一旦鑒定存在尿液cnp與血漿cnp的比率升高和一項或多項風險因素的哺乳動物，可使用一種或多種治療劑治療該哺乳動物，所述治療劑被設計用于緩解或抵消腎結構改變的癥狀。例如，可使用ace抑制劑、血管緊張素受體阻斷劑(arb)、醛固酮拮抗劑、抑制素、天然利尿鈉肽或設計利尿鈉肽治療尿液cnp與血漿cnp的比率升高和高血壓的哺乳動物以緩解腎結構改變的癥狀。在一些情況下，可指導尿液cnp與血漿cnp的比率升高且?guī)в幸豁椈蚨囗楋L險因素的哺乳動物使用一種或多種治療劑進行自我治療，所述治療劑被設計用于緩解或抵消腎結構改變的癥狀。

本發(fā)明還提供了治療可能發(fā)生不良結果(如死亡、住院、心力衰竭、心肌梗塞、腎功能惡化、心臟功能惡化和透析)的哺乳動物的方法和材料。例如，可對哺乳動物進行評價以確定哺乳動物的尿液cnp或其六種可能分子形式(如cnp-53或nt-cnp-53)的水平是否升高。如本文所述，尿液cnp或其六種可能分子形式(如cnp-53或nt-cnp-53)的水平升高的哺乳動物可能發(fā)生不良結果。一旦哺乳動物被鑒定為尿液cnp或其六種可能分子形式(如cnp-53或nt-cnp-53)的水平升高，則可監(jiān)測該哺乳動物以確定是否存在不良結果的一項或多項風險因素。例如，可監(jiān)測或評價該哺乳動物以確定是否存在年齡因素、高血壓、血清肌酸酐水平升高、蛋白尿、男性性別、體重指數升高、膽固醇水平升高、吸煙習慣和/或糖尿病。一旦鑒定存在尿液cnp或其六種可能分子形式(如cnp-53或nt-cnp-53)的水平升高和一種或多種風險因素的哺乳動物，可使用一種或多種治療劑治療該哺乳動物，所述治療劑被設計用來降低不良結果發(fā)生的可能性。例如，可使用ace抑制劑、arb、醛固酮拮抗劑、抑制素、天然利尿鈉肽或設計利尿鈉肽治療存在尿液cnp或其六種可能分子形式(如cnp-53或nt-cnp-53)的水平升高和高血壓的哺乳動物以降低不良結果發(fā)生的可能性。在一些情況下，可指導尿液cnp或其六種可能分子形式(如cnp-53或nt-cnp-53)的水平升高且有一項或多項風險因素的哺乳動物使用一種或多種治療劑進行自我治療，所述治療劑被設計用來降低不良結果發(fā)生的可能性。

本發(fā)明還提供了治療哺乳動物的方法和材料。例如，可以評價哺乳動物以確定哺乳動物的血漿cnp-22水平是否升高。如本文所述，血漿cnp-22水平升高的哺乳動物遭受死亡或心肌梗塞的風險上升。一旦哺乳動物被鑒定為血漿cnp-22水平升高，可監(jiān)測該哺乳動物以確定是否存在死亡或心肌梗塞的一項或多項風險因素。例如，可監(jiān)測或評價該哺乳動物以確定是否存在年齡因素、高血壓、血清肌酸酐水平升高、蛋白尿、男性性別、體重指數升高、膽固醇水平升高、吸煙習慣和/或糖尿病。一旦鑒定到血漿cnp-22水平升高且有一項或多項風險因素的哺乳動物，可使用一種或多種治療劑治療該哺乳動物，所述治療劑被設計用來降低哺乳動物遭受死亡或心肌梗塞的風險。例如，可使用ace抑制劑、arb、醛固酮拮抗劑、抑制素、天然利尿鈉肽或設計利尿鈉肽治療血漿cnp-22水平升高且膽固醇水平升高的哺乳動物以降低該哺乳動物遭受死亡或心肌梗塞的風險。在一些情況下，可指導血漿cnp-22水平升高且有一項或多項風險因素的哺乳動物使用一種或多種治療劑進行自我治療，所述治療劑被設計用來降低哺乳動物遭受死亡或心肌梗塞的風險。

以下實施例進一步描述了本發(fā)明，這些實施例并不限制權利要求書所述的本發(fā)明的范圍。

實施例

實施例1-使用尿液cnp排泄作為衰老期間腎纖維化的生物標記

動物

研究在2、11和20個月齡雄性費歇爾大鼠中進行(哈倫實驗室公司(harlanlaboratories，inc.)，威斯康星州麥迪遜，每個年齡組n＝8-10，另有說明者除外)。實驗性研究按照動物福利法和梅約臨床機構動物管理和使用委員會(mayoclinicinstitutionalanimalcareandusecommittee)的批準進行。

人類腎活檢組織

人類腎組織獲得自捐獻腎臟時健康生活的腎供體的細針抽吸活檢樣本，如他處所述(rule等，ann.intern.med.，152：561-567(2010))。本研究中檢測了總共六份石蠟包埋腎活檢樣本。年輕組由三名平均年齡為19歲(年齡范圍18至20歲)的女性供體組成，年老組由三名71歲的女性供體組成。

24小時尿液收集

大鼠置于代謝籠中，能夠自由進食和飲水并用24小時時間使之適應環(huán)境。適應期后，隨即用24小時收集尿液用于蛋白尿和cnp評價。使用鄰苯三酚紅染色結合試驗測量24小時尿液樣品中的尿蛋白排泄。

急性血壓研究、腎小球過濾速率和血漿收集

麻醉大鼠(氧氣中1.5％異氟烷)，將pe-50管置于頸動脈以使用cardiosoftpro軟件(sonometrics公司，安大略省倫敦)采集血壓(bp)并取血樣。將插管插入膀胱進行尿液收集。將pe-50管插入頸靜脈并持續(xù)注入含2％菊粉的生理鹽水(西格瑪公司(sigma)，密蘇里州圣路易斯)。60分鐘平衡后，進行廓清研究。廓清研究持續(xù)60分鐘，在廓清研究結束時同血樣一起收集尿液以計算菊粉廓清中的gfr并用于測量血漿cnp。從頸動脈中收集血液并置于冰上的edta管中(stingo等，am.j.phys.，263：h1318-1321(1992))。立即將血液在4℃下2,500rpm離心10分鐘，血漿儲存于聚苯乙烯管，在-80℃保存以備后續(xù)使用。使用用于gfr分析的蒽酮法測量菊粉濃度，如他處所述(davidson和sackner，j.lab.clin.med.，62：351-356(1963))。

大鼠腎組織

急性研究后，完整移除大鼠腎臟，隨后將其分成幾部分。將腎組織的橫截面保存于10％福爾馬林中用于纖維化和cnp的組織學分析，較小的方形部分保存于2.5％戊二醛中用于電子顯微鏡(em)分析。

纖維化的組織學分析

將固定后的大鼠腎組織(n＝7)脫水并包埋于石蠟中，切成厚度為4μm的切片。使用天狼猩紅對纖維化的膠原蛋白和延伸進行染色。使用axioplaniiks400顯微鏡(卡爾蔡司公司(carlzeiss，inc)，德國)在每張切片中捕捉至少4張隨機選擇的圖像，使用20x物鏡并使用ks400軟件確定纖維化區(qū)域占組織總面積的百分比。

電子顯微鏡分析

將2.5％戊二醛中固定的大鼠腎組織脫水并包埋于樹脂模具中。根據em核心設備程序切割超薄切片。使用jem-1400透射電子顯微鏡在5000x和8000x放大下對腎小球進行成像。

腎小球基底膜厚度測量

在每個年齡組(n＝5)的大鼠中使用5000x放大捕捉腎小球em圖像。使用應用數字顯微照片(digitalmicrograph)(gatan公司，加利福尼亞州普萊森頓)測量gbm的厚度。對于每只大鼠，由一名有經驗的em技術員測量20次并使用excel形態(tài)測量宏處理數據，給出以納米(nm)為單位的平均厚度。

血漿和尿液cnp

使用來自于菲尼克斯制藥有限公司(phoenixpharmaceutical)(加利福尼亞州芒廷維尤)的市售非平衡放射免疫試驗試劑盒和與大鼠cnp-22具有完全交叉反應性的抗-人cnp-22抗體確定血漿和尿液cnp-22的方法如他處所述(stingo等，am.j.phys.，263：h1318-1321(1992))。使用c-18bondelut固相萃取筒提取一毫升血漿。使用4ml100％甲醇和4ml水清洗筒后，加入血漿并清洗筒。在savant快速真空濃縮器中濃縮洗脫液，并用300μl試驗緩沖液重懸沉淀。將100μl標準品和樣品與100μl抗-人cnp抗體在4℃下孵育。18小時后，加入100μl(10,000計數)i¹²⁵標記的cnp并在4℃下孵育18小時。隨后，在所有樣品中加入二抗以使游離和結合的部分分離，并對樣品進行離心。吸出游離的部分并在γ計數器上對結合的部分進行計數。生成并使用標準曲線以計算未知樣品的濃度，其報告單位為pg/ml。標準曲線的范圍為0.5至128pg，檢測的下限為0.5pg。試驗間和試驗內差異分別為11％和5.2％。回收率為72±6％。與anp、bnp、內皮素和腎上腺髓質素的交叉反應性＜1％，與cnp-53的交叉反應性為97％。

cnp免疫組化

評價是否存在腎臟cnp免疫組化的方法如他處所述(stingo等，am.j.phys.，263：h1318-1321(1992))。簡單地說，將石蠟包埋的腎組織切片在60℃加熱爐中孵育2小時，隨后使用已有的實驗室方法進行脫石蠟。脫石蠟后，用甲醇中0.6％過氧化氫室溫下孵育切片20分鐘以限制內源性過氧化氫酶活性，隨后在加入一抗前使用5％正常山羊血清封閉非特異性蛋白結合位點。將切片置于保濕室，以1∶500的稀釋比例加入一抗(兔抗人cnp-22，菲尼克斯制藥有限公司(phoenixpharmaceutical)，加利福尼亞州芒廷維尤)，室溫反應18-24小時。使用正常兔血清處理對照切片。將切片與共價連接了辣根過氧化物酶的山羊抗兔igg以及過氧化物酶的底物3-氨基-9-乙基-咔唑孵育，并使用蘇木精反染以強化核的細節(jié)。隨后由一名不知道年齡分組的腎臟病理學家觀察并解釋染色的切片。

統(tǒng)計學分析

結果表示為平均值±se。使用anova及隨后的newman-keuls多重比較檢驗進行組內比較。進行皮爾森相關以計算尿液cnp排泄和腎纖維化以及gfr之間和尿液與血漿cnp的比率和腎纖維化之間的關聯(lián)。上述計算使用graphpadprism軟件(圖形軟件有限公司(graphpadsoftware)，加利福尼亞州拉由拉市)。統(tǒng)計的顯著性接受為p＜0.05。

結果

與年齡相關的人體測量、腎臟特征和血液動力學確定了體重(bw)、腎臟總重量(tkw)、血漿肌酸酐、gfr以及平均動脈壓(map)水平(表1)。相比于2個月的組，11個月時bw和tkw有顯著增加，在20個月時持續(xù)。當使用bw對tkw進行標準化時，tkw∶bw比率在11和20個月時出現(xiàn)顯著下降。此外，相比于2個月，11和20個月時血漿肌酸酐水平顯著上升，11個月時gfr存在下降的趨勢，在20個月時持續(xù)。map僅在20個月時出現(xiàn)顯著上升。

表1.老化費歇爾大鼠中體重、腎臟特征和血壓匯總。

bw＝體重；tkw＝腎臟總重量；cr＝血漿肌酸酐；gfr＝腎小球過濾速率；map＝平均動脈壓。數值為平均值±se。所有年齡組中n＝10。*p＜0.05相對于2個月，p＜0.05相對于11個月。

腎纖維化和腎小球超結構

獲得了使用天狼猩紅對腎皮質(圖1a)和髓質(圖2a)進行染色的代表性顯微照片。這些顯微照片提供了對纖維膠原沉積的估計。具體而言，隨著年齡的增長，皮質(圖1b)和髓質(圖2b)間隙的膠原染色出現(xiàn)明顯且逐步的增長。此外，還獲得了腎小球的代表性電子顯微照片(圖3)。在2個月時(圖3a)，內臟表皮細胞的足突是完整的。11個月時(圖3b)，系膜區(qū)域與基質一起溫和膨脹，且相比于2個月時毛細血管袢基膜呈現(xiàn)溫和增厚。20個月時(圖3c)，系膜基質出現(xiàn)彌漫性膨脹。相比于2和11個月時，毛細血管袢基膜增厚且內臟表皮細胞的足突出現(xiàn)集中性消失。對gbm的厚度進行了形態(tài)測量分析(圖4)。隨著年齡的增長，毛細血管袢基膜逐步且明顯地增厚，20個月時基膜的厚度幾乎達到了2個月時基膜厚度的3倍。

腎cnp的免疫組化定位

評估了2、11和20個月齡的費歇爾大鼠中腎皮質(左圖)和髓質(右圖)內cnp的免疫組化定位(圖5)。2個月時，近端腎管沒有明顯染色，cnp的免疫染色位于腎皮質的遠端腎管中。在11個月時，腎皮質中cnp的免疫染色主要位于遠端腎管，近端腎管中只有微弱染色。在20個月時，可在腎皮質的遠端腎管內和近端腎管的集中觀察到強烈的cnp免疫染色。在腎髓質的遠端腎管中也可觀察到強烈的cnp免疫染色，且不隨年齡出現(xiàn)顯著變化。

此外，圖10顯示了在來自健康人類腎臟供體的年輕(a-c)和年老(d-f)活檢樣本中cnp的免疫組化定位。在從年輕腎臟供體獲得的活檢樣本中，cnp染色主要位于遠端腎管，在近端腎管中可觀察到相對較弱且集中的染色。在從年老腎臟供體(d-f)獲得的活檢樣本中，在遠端和近端腎管中均可觀察到強烈的cnp染色。

尿液和血漿cnp、尿液與血漿cnp的比率和蛋白尿

評估了隨年齡增長血漿和尿液cnp的變化(圖6)。在三個年齡組間觀察到血漿cnp明顯且逐步的降低(2個月平均值±se：29±3pg/ml；11個月平均值±se：20±1*pg/ml；20個月平均值±se：9±1*pg/ml；*p＜0.05相對于2個月，p＜0.05相對于11個月)(圖6a)。相反地，11個月時尿液cnp排泄出現(xiàn)顯著增長，在20個月時保持上升(2個月平均值±se：64±4pg/天；11個月平均值±se：110±6*pg/天；20個月平均值±se：103±7*pg/天；*p＜0.05相對于2個月)(圖6b)。此外，尿液與血漿cnp的比率也出現(xiàn)了明顯且逐步的增加(圖6c：2個月平均值±se：2.2±0.2pg/天/pg/ml；11個月平均值±se：5.4±0.3*pg/天/pg/ml；20個月平均值±se：11.7±1.0*pg/天/pg/ml；*p＜0.05相對于2個月，p＜0.05相對于11個月)。僅在20個月時觀察到蛋白尿的顯著升高(圖6d)。

尿液cnp排泄和尿液血漿cnp的比率之間的關聯(lián)

cnp和腎皮質纖維化之間(圖7a；n＝21，r＝0.54，p＝0.01)以及cnp和腎髓質纖維化之間(圖7b；n＝21，r＝0.65，p＝0.001)存在正相關關系。此外，尿液與血漿cnp的比率和腎皮質纖維化(圖7c；n＝21，r＝0.83，p＝0.0001)之間之間，以及尿液與血漿cnp的比率和腎髓質纖維化(圖7d；n＝21，r＝0.77，p＝0.0001)之間存在強烈的正相關關系。尿液cnp和gfr之間不存在關聯(lián)(n＝30，r＝0.01，p＝0.97)。圖11顯示了gbm厚度、尿液cnp(圖11a；n＝15，r＝0.77，p＝0.0008)和尿液與血漿cnp的比率(圖11b；n＝15，r＝0.95，p＝0.0001)之間強烈的正相關關系。

本文所提供的結果證明衰老期間尿液cnp排泄增加，且尿液cnp排泄的增加與腎纖維化及gbm增厚強烈相關，后者的出現(xiàn)早于明顯的蛋白尿或bp升高。隨著腎臟老化可觀察到尿液cnp排泄的增加，并與尿液與血漿cnp的比率顯著增加和循環(huán)cnp及腎功能的下降同時出現(xiàn)。這些結果證明尿液cnp及其與血漿cnp的比率是衰老期間臨床跡象出現(xiàn)前所發(fā)生的早期腎結構改變的生物標記。

實施例2-cnp是一種在住院急性失代償性心力衰竭(adhf)中有預后價值且獨立于腎小球過濾速率和nt-probnp的尿液生物標記

患者群體

共研究了60名adhf(急性失代償性心力衰竭)患者，對照組包括20名健康對象。adhf患者接受預期鑒定并通過連續(xù)入院的登記簿招募。對于新發(fā)生或已建立的慢性hf，準入標準均為與弗雷明漢標準一致的收縮hf臨床診斷(mckee等，n.engl.j.med.，285：1441-6(1971))，通過超聲心動描記術中左心室射血分數(lvef)的降低(＜50％)加以確認。為使研究群體反映正常臨床實踐的異質性，對于適當的尿液生物標記而言，單一的排除標準是不完整或不正確的尿液收集。基于此排除了兩名adhf患者，在adhf組中總共剩下58名同意的連續(xù)患者。對所有患者進行基線歷史評價、身體檢查和經胸壁超聲心動圖，作為部分常規(guī)臨床護理。在入院后72小時內取得用于cnp和nt-probnp測量的血漿樣品并進行24小時尿液收集。在冰上將尿液樣品收集于醋酸中(30ml1∶1醋酸；17.4m)。在定時的尿液收集(平均值22.9±4小時)結束時，記錄總量并將樣品分至各個容器，凍存于-80℃至分析。對于初級分析，gfr被定義為24小時肌酸酐清除。重復驗證結果以與腎病膳食改良(mdrd)中估計的gfr一致。

對照對象從健康志愿者群體中招募。所有人都是不吸煙者且沒有心血管或系統(tǒng)疾病病史。招募后即對用于cnp和nt-probnp測量的血漿樣品進行取樣并進行24小時尿液收集。

尿液生物標記測定

ngal和kim-1

根據生產商的說明書(elisa，r&d系統(tǒng)公司(r&dsystems))，通過酶連免疫試驗測量尿液中ngal和kim-1的濃度。ngal的最低可檢測劑量為0.012ng/ml，而kim-1的最低可檢測劑量為0.009ng/ml。兩個試驗的試驗內和試驗間變異系數分別為＜5％和＜8％。ngal被認為能與mmp9形成復合物；重組人類mmp-9/ngal復合物在所用試驗中表現(xiàn)出0.3％的交叉反應性。在kim試驗中沒有明顯的交叉反應性或干擾。

cnp-22(aa82-103)

可使用來自菲尼克斯制藥有限公司(phoenixpharmaceutical)(加利福尼亞州芒廷維尤)的市售非平衡放射免疫試驗試劑盒以及能夠檢測人類cnp-22的抗體確定尿液cnp-22，如他處所述(sangaralingham等，am.j.physiol.renalphysiol.，301：f943-52(2011))。標準曲線的范圍為0.5-128pg，檢測的下限為0.5pg。試驗間和試驗內差異分別為11％和5％?；厥章蕿?5％。與anp、bnp、內皮素和nt-cnp53的交叉反應性為0％，與cnp-53的交叉反應性為59％。

cnp-53(aa51-103)和nt-cnp53(aa51-81)

與cnp-22相似，可使用來自于菲尼克斯制藥有限公司(phoenixpharmaceutical)(加利福尼亞州芒廷維尤)的市售非平衡放射免疫試驗試劑盒以及能夠檢測人類cnp-53和僅當cnp-53與環(huán)結構分離時其氨基端起始的前29個氨基酸(nt-cnp-53)的抗體確定尿液cnp-53和nt-cnp-53。生成并使用標準曲線以計算未知樣品的濃度，其報告單位為pg/ml。對于cnp-53，標準曲線的范圍為0.5-128pg。試驗間和試驗內差異分別為8％和7％。回收率為81±4％。與cnp-22的交叉反應性為100％，與nt-cnp-53、anp和bnp的交叉反應性為0％。對于nt-cnp-53，標準曲線的范圍為0.5-128pg。試驗間和試驗內差異分別為10％和6％?；厥章蕿?2±5.2％。與anp、bnp、cnp-22、cnp-53和內皮素的交叉反應性為0％。

尿液生物標記排泄

可通過尿液總體積(ml)和尿液收集時間(小時)確定平均尿流(ml/小時)。以尿液生物標記濃度(pg/ml或ng/ml)和尿流速率(ml/小時)的結果計算尿液生物標記排泄，并在對尿液肌酸酐排泄(ng/gcr)進行調節(jié)后報道。

血漿生物標記試驗

將血液置于edta管中并冷凍，直至4℃、2500rpm離心10分鐘。將血漿分裝為1ml并凍存于-20℃直至測試。使用與尿液相同的非平衡ria(菲尼克斯制藥公司(phoenixpharmaceuticals)，加利福尼亞州貝爾蒙特)以及抗-人cnp抗體確定cnp分子形式的血漿濃度。使用電化學發(fā)光免疫試驗測量血漿nt-probnp，如先前他處所述(costello-boerrigter等，j.am.collegecardiol.，47：345-53(2006))。nt-probnp檢測的下限為5pg/ml；試驗間和試驗內差異分別為3.1％和2.5％。與cnp形式不存在交叉反應性。

統(tǒng)計分析

所有尿液生物標記均表現(xiàn)為非高斯分布；因此數值表示為中位數±四分位差。對于adhf和對照對象之間的比較，使用了非參數威爾科克森(wilcoxon)秩和檢驗。使用斯皮爾曼(spearman′s)秩相關確定連續(xù)變量之間的關系。在cox回歸分析前使用自然對數轉化標準化生物標記排泄數據以檢測以下獨立預測因子：(i)死亡率，以及(ii)到首次非選擇性所有原因再入院治療/死亡的時間。通過包括當地初級護理數據的機構記錄確定死亡率和再入院治療。否則在末次已知隨訪時審查患者。使用c-統(tǒng)計以比較生物標記的分辨力(harrell等，statisticsinmedicine，15：361-87(1996))。c-統(tǒng)計與二元端點(binaryendpoint)的曲線下面積相似，并可將其解釋為使用cox模型的風險評分正確排序的事件時間的可能性。使用計算標準誤差中的近似重疊法計算c-統(tǒng)計的置信區(qū)間。此外，利用綜合鑒別指數(idi)(pencina等，statisticsinmedicine，27：157-72(2008)；討論部分207-12)，使用cnp和血漿nt-probnp的組合代替單獨使用nt-probnp評價用于adhf中的不良后果(死亡率和重新入院/死亡)預測精確度方面的提升。概率值為雙側的；p＜0.05被認為具有顯著性。使用jmp軟件版本9.0(sas研究院有限公司(sasinstitute，inc)，北卡羅來納州卡雷)和sas版本9.2(sas研究院有限公司(sasinstitute，inc)，北卡羅來納州卡雷)分析數據。

結果

表2顯示了研究群體的基線臨床和生化特性。確認為adhf的患者的年齡大于對照組(70.1±10.3對比53.5±6.1歲，p＜0.0001)，23名(40％)為女性；且平均左心室射血分數(lvef)為38.4±18.9％。22名(38％)adhf患者的主要癥狀為單獨的呼吸困難；4名(7％)患者為單獨的水腫；而24名(41％)患者為呼吸困難和外周性水腫。剩余的一些患者在心率失常相關的癥狀下出現(xiàn)為乏力或adhf。55％的患者存在nyhaiii類。相比于對照組，adhf患者中血漿nt-probnp顯著升高同時gfr下降(p＜0.0001)(表2)。觀察到adhf患者中的尿液肌酸酐濃度低于對照組(表3)，可能與臨床adhf管理期間的鼓舞或利尿療法的升級相關。

表2.基線特征。

*數值表示為平均值(sd)

μ值表示為中位數(第25-75百分位)。

cva，腦血管意外；crt，心臟再同步治療；lvef，左心室射血分數；gfr，腎小球過濾速率；nt-probnp，腦利尿鈉肽前體n端；cnp-22，c型利尿鈉肽-22；cnp-53，c型利尿鈉肽-53；nt-cnp-53，c型利尿鈉肽-53n端片段。

急性失代償性心力衰竭和尿液生物標記排泄

所有尿液生物標記的排泄速率均表現(xiàn)為非高斯分布。adhf中kim-1和所有三種cnp分子形式的排泄的中位數顯著高于對照組，尿總蛋白/肌酸酐比率也是如此(表3和圖12)。尿液ngal排泄沒有變化(p＝ns)。對adhf患者的尿液生物標記排泄與臨床特性之間的關系進行了研究。kim-1表現(xiàn)出與gfr之間較弱且不明顯的關系(spearman’sρ-0.19；p＝0.098)，但任意尿液生物標記和出現(xiàn)的nyha類(iii或iv)之間不存在明顯的關系，也沒有明顯的與lvef(無收縮劑)相關的趨勢(兩者中p＝ns)。

表4顯示了尿液cnp的排泄速率與其他測量的hf生物標記之間的單變相關系數。三種尿液cnp分子形式之間均觀察到中度關聯(lián)，但只有尿液cnp-22與其在血漿中的濃度有關聯(lián)，盡管只是中度關聯(lián)(ρ0.28，p＝0.04)。尿液cnp-22和cnp-53與血漿nt-probnp弱相關(分別為p0.45，p＝0.0003；ρ0.33，p＝0.01)；尿液nt-cnp-53沒有相關性。尿液cnp-22(p0.68，p＝0.0001)和尿液kim-1(ρ0.78，p＜0.0001)與尿液總蛋白/肌酸酐比率顯著相關，而以下的其他尿液生物標記并不明顯：cnp-53、nt-cnp-53或ngal。

在adhf患者中，入院時藥物包括血管緊張素轉化酶抑制劑或血管緊張素受體阻斷劑(66％)、β阻斷劑(76％)、髓袢利尿藥(84％)和醛固酮拮抗劑(21％)。探索性分析中，在使用髓袢利尿藥的adhf患者中，在使用acei或arb的情況下尿液ngal高于(中位數±iqr：443±1924相對于177±227ng/gcr；p＝0.003)，且尿液nt-cnp-53低于(34.0±43.7相對于60.4±202.0；p＝0.01)那些不使用者。當前組中未觀察到使用這些藥劑與尿液cnp-22、cnp-53、或kim-1水平之間的其他顯著關聯(lián)。

表3.尿液生物標記排泄。

*數值表示為平均值(sd)

§值表示為中位數(第25-75百分位)。

kim-1，腎損傷分子1；ngal，中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白；cnp-22，c型利尿鈉肽-22；cnp-53，c型利尿鈉肽-53；nt-cnp-53，c型利尿鈉肽-53n端片段。

表4.相關性分析：adhf患者中cnp分子形式和疾病嚴重性或預后的其他潛在重要生物標記之間的斯皮爾曼ρ(rho)秩相關系數。

gfr，腎小球過濾效率；kim-1，腎損傷分子1；ngal，中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白；cnp-22，c型利尿鈉肽-22；cnp-53，c型利尿鈉肽-53；nt-cnp-53，c型利尿鈉肽-53n端片段；nt-probnp，腦利尿鈉肽前體n端。

c型利尿鈉肽的血漿濃度

表2顯示了cnp分子形式和nt-probnp的血漿濃度。相比于對照組，adhf組中血漿cnp-22和cnp-53水平升高，而血漿nt-cnp-53水平沒有改變。血漿cnp-22與其同時的尿液排泄限制性相關(ρ0.28，p＝0.04)，并與尿液cnp-53(ρ0.24，p＝0.07)和nt-cnp-53(ρ0.26，p＝0.05)排泄之間存在微弱的正相關關系(表4)。相反地，血漿cnp-53和血漿nt-cnp-53與任何cnp分子形式的尿液排泄之間均不存在任何關系。

臨床結果

58名被研究的adhf患者中，在后續(xù)隨訪的平均(sd)時間為1.5(0.9)年中有18人死亡(總adhf死亡率為31％)。另外有18名adhf患者再入院治療(所有原因再入院治療/死亡率為62％)，其中13名患者再入院治療時主要存在心血管病因。對兩名患者進行選擇性心臟再同步治療；最終分析的事件中并不包括這些。

死亡的adhf患者的年齡大于對照組(74.8±9.2相對于67.9±10.2歲，p＝0.02)但兩組的性別、nyha類型和lvef類似。同樣，隨訪期間出現(xiàn)所有原因再入院治療/死亡的次要結果的adhf患者與沒有這些基線特征相關事件的adhf患者之間沒有差異。該組中有或沒有不良結果的adhf患者之間的血漿nt-probnp或gfr水平均沒有顯著性差異。所評估的尿液生物標記中，相比與幸存者，死亡的adhf患者中所有三種cnp形式的水平均有升高(圖13a-c和14a-c)。尿液kim-1和ngal排泄沒有變化(兩者p＝ns)。死亡的adhf患者的血漿cnp-22水平高于幸存者(15.8±18.8相對于10.5±8.3pg/ml；p＝0.02)，但血漿cnp-53和nt-cnp-53沒有顯著差異。對于出現(xiàn)次要結果的患者，尿液cnp-22和nt-cnp-53排泄表現(xiàn)出升高的趨勢(cnp-22中位數：15.3相對于9.3ng/gcr，p＝0.07；nt-cnp-53：37.4相對于32.6ng/gcr，p＝0.06)，血漿cnp-22也是如此(13.8±16.3相對于10.5±7.7；p＝0.06)。其他尿液生物標記和血漿cnp形式沒有變化。

cox回歸分析(表5)表明，在所有評估的尿液和血漿生物標記中，只有尿液nt-cnp-53排泄能夠顯著地預測死亡率(單變量hr1.67，95％ci1.14-2.37，p＝0.01)和所有原因再入院治療/死亡(單變量hr1.78，95％ci1.30-2.39，p＝0.0004)。此外，在對年齡、尿液蛋白質/肌酸酐比率和血漿nt-probnp調整后其關聯(lián)仍持續(xù)存在(表5)。在所有原因死亡率發(fā)生的c-統(tǒng)計(c-指數)分析中，尿液nt-cnp-53的c-統(tǒng)計(0.66；95％ci0.53-0.78)與nt-probnp的(0.57，95％ci0.43-0.71)相當，且生物標記的組合(尿液nt-cnp-53和血漿nt-probnp)提供了遞增效應的證據，組合c-統(tǒng)計為0.69(95％ci0.56-0.82)。綜合鑒別指數的檢測為尿液nt-cnp-53和血漿nt-probnp組合顯著提升該組中不良結果的預測提供了進一步證據(表6)。本研究中其他尿液或血漿生物標記均未表現(xiàn)出顯著的預測價值。

表5.adhf患者中尿液nt-cnp-53排泄和血漿nt-probnp對于臨床結果的預測價值。單變量和調整后cox比例風險分析。

*ln轉換數據(風險比率以1個對數單位為單位增加)

模型1：根據年齡調整

模型2：根據年齡和尿液蛋白質/肌酸酐比率調整

模型3：根據年齡、尿液蛋白質/肌酸酐比率和血漿nt-probnp調整cv，心血管；nt-cnp-53，c型利尿鈉肽-53n端片段；nt-probnp，b型利尿鈉肽前體n端；ns，無顯著性(即p＞0.05)。

表6.預測精確度的測量

血漿nt-probnp

尿液nt-cnp-53

*相比于單獨的nt-probnp

nt-probnp，b型利尿鈉肽前體n端；nt-cnp-53，c型利尿鈉肽-53n端片段；se，標準誤差。

這些結果證明升高的kim-1排泄水平似乎能夠區(qū)分失代償性心力衰竭患者和健康的對照患者，但與心力衰竭結果不相關。相反地，升高的尿液nt-cnp-53排泄水平與異質性入院治療心力衰竭群體(如adhf患者)中的不良結果之間顯著相關，獨立于gfr。nt-cnp-53是唯一有預測價值的尿液生物標記。

實施例3-血漿cnp-22是一種能夠預測普通人群中死亡和心肌梗塞的內皮細胞生物標記

以下實施例用于確定血漿cnp-22是否是一種來源于內皮細胞的、能夠預測普通人群中未來死亡率和心肌梗塞(mi)的生物標記。評估了1，841名對象(平均年齡62±11歲，48％為男性)的血漿cnp-22，這些對象隨機選自美國明尼蘇達州奧姆斯特德縣(olmstedcounty)的普通社區(qū)。對死亡率和mi的隨訪時間中位數為12年。在12年的隨訪期間內，升高的血漿cnp-22水平(cnp-22＞16pg/ml)與死亡率(未調整hr1.41，95％ci1.12-1.79；p＝0.004)和mi(未調整hr1.60，95％ci1.19-2.16；p＝0.002)顯著相關(表7)。在根據傳統(tǒng)風險因素(如年齡、性別、體重指數(bmi)、膽固醇、血清肌酸酐、吸煙、以及糖尿病和高血壓的發(fā)生)進行調整后，升高的血漿cnp-22水平仍與死亡率(調整后hr1.34，95％ci1.02-1.75；p＝0.04)和mi(調整后hr1.59，95％ci1.13-2.25；p＝0.008)顯著相關(表7)。

表7.升高的血漿cnp-22水平預測死亡率和心血管疾病(所有組；n＝1841)。

模型3：年齡、性別、bmi、總膽固醇、血清肌酸酐、吸煙，發(fā)生糖尿病、高血壓、冠狀動脈疾病

圖15a和15b分別顯示了根據血漿cnp-22四分位數的死亡和mi。未調整的死亡和mi事件發(fā)生率隨著分別顯示了根據血漿cnp-22四分位數的升高顯著提高，其中cnp-22q1＝2.0至10.1pg/ml；cnp-22q2＝10.2至13.1pg/ml；cnp-22q3＝13.2至16.7pg/ml；且cnp-22q4＝16.8至265.0pg/ml。

這些結果證明升高的血漿cnp-22水平是一種能夠預測普通人群中未來心臟相關死亡和mi的內皮細胞生物標記。這些結果還證明可對血漿cnp-22水平升高者使用早期mi檢測策略和/或用于mi預防的積極治療策略。

其他實施方式

應理解雖然本發(fā)明已結合其詳述進行描述，但以上描述意在說明而不是限制本發(fā)明的范圍，該范圍由所附權利要求的范圍限定。其他方面、優(yōu)勢和修改在以下權利要求的范圍內。

序列表

<110>梅約醫(yī)學教育與研究基金會（mayofoundationformedicaleducationandresearch）

<120>評估腎結構改變和結果

<130>07039-1097wo1

<140>pct/us2012/059670

<141>2012-10-11

<150>61/580,139

<151>2011-12-23

<160>13

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<210>1

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<213>智人（homosapiens）

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