本申請(qǐng)為申請(qǐng)?zhí)?01410790793.1、申請(qǐng)日2014.12.17、發(fā)明名稱(chēng)“用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的抗原刺激物、試劑盒及其應(yīng)用”的分案申請(qǐng)。

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體涉及一種用于結(jié)核分枝桿菌感染檢測(cè)的抗原刺激物及其應(yīng)用、及含有該抗原刺激物的試劑盒。

背景技術(shù)：

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一類(lèi)嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的傳染病。雖然結(jié)核分枝桿菌最初感染人體的呼吸系統(tǒng)，但是它能擴(kuò)散至人體幾乎所有的器官并且導(dǎo)致相應(yīng)的疾病發(fā)生。據(jù)估計(jì)，全球大約有1/3的人口感染了結(jié)核分枝桿菌，并且每年有800萬(wàn)新發(fā)感染病例，每年有200萬(wàn)人死于結(jié)核病。我國(guó)的結(jié)核疫情和結(jié)核分枝桿菌感染情況都相當(dāng)嚴(yán)重，是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，結(jié)核病人數(shù)位居世界第二。

所述的結(jié)核分枝桿菌感染，通常是指患有活動(dòng)性結(jié)核或潛伏性結(jié)核感染的人群，也可以是健康接觸者。機(jī)體在感染結(jié)核分枝桿菌后，有少數(shù)發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核，表現(xiàn)出相應(yīng)的臨床癥狀，如發(fā)熱、咳嗽、咳痰、胸片異常等。大多數(shù)人感染后無(wú)相應(yīng)的臨床癥狀，但是機(jī)體無(wú)法清除全部的結(jié)核分枝桿菌，即為潛伏性結(jié)核感染。潛伏性結(jié)核感染者在免疫力低下等情況下可發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病。

結(jié)核病的早期診斷對(duì)于有效控制結(jié)核病的進(jìn)展和結(jié)核分枝桿菌的傳播具有重要意義。目前診斷結(jié)核感染的方法有限，主要包括結(jié)核分枝桿菌素皮膚實(shí)驗(yàn)(tst)、痰涂片、痰細(xì)菌培養(yǎng)、放射性x光片、血清學(xué)抗體抗原免疫檢測(cè)以及pcr和核酸雜交法等。結(jié)核分枝桿菌感染引起的t細(xì)胞γ-干擾素(ifn-γ)釋放試驗(yàn)(interferon-gammareleaseassay，igra)是近年發(fā)展起來(lái)的新方法，可用于診斷活動(dòng)性結(jié)核病和結(jié)核潛伏感染。已經(jīng)得到美國(guó)fda批準(zhǔn)上市的t-spot.tb試劑盒(oxfordimmunoteclimited，aingdon，unitedkingdom)和quantiferon-tbgold試劑盒都是基于igra原理，以rd1區(qū)基因編碼的結(jié)核抗原特異性蛋白-6kd早期分泌靶向抗原(esat-6)和10kd培養(yǎng)濾過(guò)蛋白(cfp-10)為刺激源，通過(guò)檢測(cè)外周血中結(jié)核特異性釋放ifn-γ的t淋巴細(xì)胞來(lái)診斷結(jié)核感染，敏感度和特異性都較高。

目前診斷結(jié)核感染的傳統(tǒng)方法存在較多缺點(diǎn)和不足，結(jié)核分枝桿菌素皮膚實(shí)驗(yàn)(tst)所使用的結(jié)核分枝桿菌純蛋白衍生物(ppd)中含有許多分枝桿菌種類(lèi)(包括致病性分枝桿菌、環(huán)境分枝桿菌和bcg)所共有的抗原分子，因此ppd診斷結(jié)核病的特異性差，不能準(zhǔn)確區(qū)分ppd實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性究竟是因?yàn)閎cg接種、接觸環(huán)境中多種非結(jié)核分枝桿菌后的致敏還是真正的結(jié)核分枝桿菌感染所致。痰涂片方法雖然簡(jiǎn)單易行，但是很大一部分結(jié)核病人痰里面并不一定有結(jié)核分枝桿菌(所謂的“痰陰”結(jié)核)。所以，痰涂片培養(yǎng)辦法具有診斷陽(yáng)性率低、易漏檢、痰細(xì)菌培養(yǎng)周期長(zhǎng)、培養(yǎng)成功率低(只有80％左右)等缺點(diǎn)。痰標(biāo)本的核酸成分檢測(cè)不僅面臨“痰陰結(jié)核”的診斷困境而且程序復(fù)雜、容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。因此，免疫學(xué)技術(shù)就成了結(jié)核分枝桿菌感染診斷的重要方法。

t-spot.tb試劑盒和quantiferon-tbgold試劑盒成份復(fù)雜、價(jià)格昂貴、成本極高，嚴(yán)重制約了其用于數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的活動(dòng)性結(jié)核患者以及數(shù)以?xún)|計(jì)的結(jié)核潛伏感染人群進(jìn)行大規(guī)模結(jié)核篩查與診斷。另外，這些試劑盒中包含的抗原肽極為復(fù)雜而且并非主要根據(jù)中國(guó)人的主要組織相容性抗原進(jìn)行抗原肽的設(shè)計(jì)、篩查與驗(yàn)證，所以適用性與使用效果需要更進(jìn)一步提升。公開(kāi)號(hào)為cn102516356a的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)從抗原rv3615c篩選出8-11個(gè)連續(xù)的多肽片段作為刺激源，采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(elispot)診斷結(jié)核感染，但是其靈敏度只有64％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到商品化試劑盒的要求。公開(kāi)號(hào)為cn102297968a的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)采用的抗原刺激物是結(jié)核分枝桿菌esat-6抗原和cfp-10抗原的9條多肽的組合，并且使用了ifn-γ、tnf-α、il-2、mig和ip-10五種抗體包裹的磁珠，同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清的五種細(xì)胞因子，這就造成了其檢測(cè)方法和結(jié)果分析的復(fù)雜性，并且需要使用流式細(xì)胞儀，增加了檢測(cè)的成本，限制了其推廣使用。公開(kāi)號(hào)為cn103604933a的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)是基于tnf-α細(xì)胞因子elisa檢測(cè)活動(dòng)性結(jié)核病的試劑盒，該試劑盒使用的抗原刺激物是esat-6和cfp-10整條蛋白，然而由于整條蛋白的空間構(gòu)象可能會(huì)阻礙有效的抗原表位與t淋巴細(xì)胞表面的識(shí)別分子結(jié)合，并且其含有其他的抗原表位可能會(huì)產(chǎn)生負(fù)向調(diào)節(jié)，影響細(xì)胞因子的分泌，造成該試劑盒對(duì)潛伏感染結(jié)核的診斷效果較差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于結(jié)核分枝桿菌感染檢測(cè)的抗原刺激物、及含有該抗原刺激物的試劑盒。本發(fā)明所提供的抗原刺激物能夠有效刺激結(jié)核感染患者的外周血t淋巴細(xì)胞產(chǎn)生ifn-γ，從而能夠高靈敏和高特異的診斷結(jié)核感染，并且不受bcg接種或者其他基礎(chǔ)性疾病的影響。

本發(fā)明為達(dá)到其目的，采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明第一方面提供一種用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的抗原刺激物，其包含如序列表中序列1～11所示的多肽中的至少一種多肽或其類(lèi)似物。氨基酸序列如序列1～11所示的多肽，序列如下：

seqidno.1：agieaaasaiqgnvtsi

seqidno.2：yqgvqqkwdatatelnnalqnl

seqidno.3：rtiseagqamastegnvtgmfa

seqidno.4：maemktdaatlaqeagnf

seqidno.5：gaagtaaqaavvrfqeaa

seqidno.6：vvrfqeaankqkqeldei

seqidno.7：yqgvqqkwdatatelnnalq

seqidno.8：iseagqamastegnvtgmfa

seqidno.9：maemktdaatlaqea

seqidno.10：aagtaaqaavvrfqe

seqidno.11：vrfqeaankqkqeld

其中，seqidno.1～3、及seqidno.7～8來(lái)源于結(jié)核特異性抗原多肽esat-6，seqidno.4～6及seqidno.9～11來(lái)源于結(jié)核特異性抗原多肽cfp-10。

優(yōu)選的，所述抗原刺激物由序列表中序列1及序列7～8所示的多肽或其類(lèi)似物組成；或者，所示抗原刺激物由序列表中序列9～11所示的多肽或其類(lèi)似物組成。

最為優(yōu)選的，所述抗原刺激物由序列表中序列1～3所示的多肽或其類(lèi)似物組成；或者，所述抗原刺激物由序列表中序列4～6所示的多肽或其類(lèi)似物組成。采用這種優(yōu)選方式，其檢測(cè)效果最佳，檢測(cè)靈敏度最佳，對(duì)結(jié)核感染疑似標(biāo)本的檢測(cè)陽(yáng)性符合率高達(dá)89％，陰性符合率高達(dá)100％。采用優(yōu)選的抗原刺激物，對(duì)大范圍志愿者的標(biāo)本進(jìn)行測(cè)試，可以有效避免其他非結(jié)核分枝桿菌導(dǎo)致的肺部感染對(duì)結(jié)果的干擾，從而有效識(shí)別結(jié)核分枝桿菌感染，因此具有高度的靈敏性與特異性。另外，我們的試劑盒陽(yáng)性符合率(靈敏性與特異性)明顯高過(guò)現(xiàn)有專(zhuān)利技術(shù)，現(xiàn)有的一些專(zhuān)利技術(shù)的靈敏度大致是60％左右(這樣的靈敏度在臨床上難正常使用)。另外，本專(zhuān)利試劑盒可以對(duì)大規(guī)模未知人群進(jìn)行結(jié)核篩查，從實(shí)施例4(圖5、圖6)可以看出，可以從37個(gè)未知人中篩查出1個(gè)結(jié)核患者，排除腫瘤、其他肺部感染、流感等疾病的干擾，具有高度的特異性與靈敏性，從而可以適用于大規(guī)模人群普查，該特點(diǎn)對(duì)于在中國(guó)進(jìn)行結(jié)核患者篩查顯得尤為重要，且其診斷靈敏性與特異性顯著優(yōu)于現(xiàn)有專(zhuān)利技術(shù)。

所述類(lèi)似物，是指其特性與所述多肽相同，包括其同樣可以與抗體特異性地結(jié)合，這種同源肽通常具有至少70％的同源性，優(yōu)選至少90％、95％的同源性。其不同一般來(lái)自于氨基酸殘基的替換、插入、缺失和修飾，可發(fā)生在序列的n端、c端或其他任何位置上。

本發(fā)明所述的多肽可以通過(guò)現(xiàn)有的化學(xué)合成法合成，也可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的基因工程技術(shù)制備得到，一種具有代表性的方法是用固相合成法制得上述多肽，其基本原理是：先將所要合成肽鏈的羥末端氨基酸的羥基以共價(jià)鍵的結(jié)構(gòu)同一個(gè)不溶性的高分子樹(shù)脂相連，然后以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份經(jīng)過(guò)脫去氨基保護(hù)基并同過(guò)量的活化羧基組分反應(yīng)，接長(zhǎng)肽鏈。重復(fù)(縮合→洗滌→去保護(hù)→中和及洗滌→下一輪縮合)操作，達(dá)到所要合成的肽鏈長(zhǎng)度，最后將肽鏈從樹(shù)脂上裂解下來(lái)，經(jīng)過(guò)純化等處理，即得所要的多肽。其中α-氨基用boc(叔丁氧羰基)保護(hù)的稱(chēng)為boc固相合成法，α-氨基用fmoc(9-芴甲氧羰基)保護(hù)的稱(chēng)為fmoc固相合成法。

本發(fā)明提供的抗原刺激物可應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌感染的檢測(cè)，其基本檢測(cè)原理是：通過(guò)本發(fā)明提供的抗原刺激物，刺激結(jié)核分枝桿菌宿主的t細(xì)胞，然后檢測(cè)t細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子，以確定t細(xì)胞是否識(shí)別這些多肽或類(lèi)似物，從而間接的反映宿主是否感染過(guò)結(jié)核分枝桿菌。

本發(fā)明提供的抗原刺激物可在制備用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的試劑中進(jìn)行應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的試劑盒，其包含如上文所述的抗原刺激物，及捕獲抗體、檢測(cè)抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素和3-氨基-9-乙基咔唑(aec)顯色底物。

進(jìn)一步的，所述捕獲抗體為抗人ifn-γ的單克隆抗體，所述檢測(cè)抗體為生物素標(biāo)記的抗人ifn-γ的抗體。

試劑盒中還包括陽(yáng)性對(duì)照刺激物和陰性對(duì)照試劑，陽(yáng)性對(duì)照所選用的抗原對(duì)絕大多數(shù)個(gè)體的t細(xì)胞均能產(chǎn)生應(yīng)答，如市售的pha(植物血凝素)，陰性對(duì)照不加入抗原成分，選用培養(yǎng)基或其他緩沖液。

本發(fā)明另一方面提供一種體外檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的方法，將前文所述的抗原刺激物和結(jié)核分枝桿菌宿主的t細(xì)胞相接觸，通過(guò)檢測(cè)t細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，確定t細(xì)胞是否識(shí)別所述抗原刺激物，從而間接的反映宿主是否感染過(guò)結(jié)核分枝桿菌。

所述宿主是指人或其他哺乳動(dòng)物，所述其他哺乳動(dòng)物如靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，牛、羊、豬、小鼠和大鼠等嚙齒動(dòng)物。

所述的t細(xì)胞通常在體內(nèi)被來(lái)自結(jié)核分枝桿菌的抗原預(yù)先致敏，這些被抗原致敏的t細(xì)胞通常存在于宿主的外周血液中，也可存在于肺泡灌洗液、胸水、腦脊液、淋巴結(jié)或其他包含t細(xì)胞的組織部位。此t細(xì)胞可以是cd4⁺t細(xì)胞，也可以是cd8⁺t細(xì)胞。在所述方法中，可使t細(xì)胞在體外或在體內(nèi)與肽(抗原刺激物)接觸，并可在體外或體內(nèi)確定t細(xì)胞是否識(shí)別肽。通常，通過(guò)測(cè)定t細(xì)胞在肽的存在下的狀態(tài)變化或測(cè)定t細(xì)胞是否與肽結(jié)合，來(lái)確定t細(xì)胞是否識(shí)別該肽。t細(xì)胞的狀態(tài)變化可以是t細(xì)胞開(kāi)始分泌物質(zhì)或分泌增加，如細(xì)胞因子，特別是ifn-γ、il-2或tnf-α。優(yōu)選測(cè)定ifn-γ的分泌。通常可通過(guò)使這些物質(zhì)與特異性的結(jié)合作用物結(jié)合并檢測(cè)該結(jié)合物與這些物質(zhì)的復(fù)合體的存在，來(lái)檢測(cè)所述的物質(zhì)。特異性結(jié)合作用物一般是抗體，比如單克隆抗體或者多克隆抗體，一般可從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)或者使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。測(cè)定細(xì)胞因子的方法通常是領(lǐng)域內(nèi)常用的方法，如elisa(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))、elispot(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn))、immunobloting(免疫印跡法)、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色、t細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)等。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，采用elispot方法來(lái)檢測(cè)t細(xì)胞分泌ifn-γ。預(yù)先包被在固相載體上的ifn-γ單克隆抗體先與ifn-γ結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物再與生物素標(biāo)記的第二ifn-γ抗體結(jié)合，然后辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素與生物素特異性結(jié)合，最后通過(guò)酶和底物的顯色反應(yīng)形成斑點(diǎn)，從而反映出被激活的t細(xì)胞數(shù)量。方法中所述t細(xì)胞可以是體外分離的，當(dāng)然，也可以是未加工過(guò)的或者是體內(nèi)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，從外周血或其他樣本中分離單核細(xì)胞，將包括t細(xì)胞和apc(抗原遞呈細(xì)胞)，apc是一種能將肽遞呈到t細(xì)胞的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，將肽本身直接加入包含了t細(xì)胞和apc的實(shí)驗(yàn)中。在這樣的試驗(yàn)中，apc可將肽遞呈給t細(xì)胞。當(dāng)使用被t細(xì)胞識(shí)別而無(wú)需由apc遞呈的肽時(shí)，apc不是必需的。

肽與t細(xì)胞接觸的時(shí)間長(zhǎng)短可以根據(jù)用于測(cè)定肽識(shí)別的方法而變化。具有代表性的是，在各實(shí)驗(yàn)中加入10⁵～10⁷的外周血單核細(xì)胞(pbmc)，優(yōu)選2.5×10⁵～10⁶。當(dāng)將肽直接加入實(shí)驗(yàn)中時(shí)，其濃度是0.1～100μg/ml，優(yōu)選1～10μg/ml。t細(xì)胞與肽一起孵育的典型時(shí)間是16～36小時(shí)。

本發(fā)明提供的抗原刺激物及含有這種特定抗原刺激物的試劑盒，可以有效地在體外檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染，而不受接種bcg(卡介苗)的影響，具有較高的敏感性和特異性，既適用于結(jié)核分枝桿菌感染臨床診斷也適用于大規(guī)模人群的結(jié)核分枝桿菌感染篩查。本發(fā)明提供的試劑盒根據(jù)中國(guó)人主要組織相容性復(fù)合體設(shè)計(jì)、篩查驗(yàn)證結(jié)核分枝桿菌優(yōu)勢(shì)抗原多肽，在中國(guó)地區(qū)使用效果更理想，具有高特異性與高靈敏度，此外本發(fā)明與國(guó)外試劑盒相比，價(jià)格低廉，更適合于在中國(guó)及發(fā)展中國(guó)家推廣。

本發(fā)明提供的ifn-γ-elispot試劑盒在臨床應(yīng)用中，經(jīng)檢測(cè)55例結(jié)核分枝桿菌高度疑似感染者血液標(biāo)本，診斷為結(jié)核分枝桿菌感染的病人41例，而經(jīng)痰涂片、痰細(xì)菌培養(yǎng)、胸片以及臨床癥狀被綜合確診為結(jié)核病的病人46例，其陽(yáng)性符合率達(dá)89.1％；用本發(fā)明的ifn-γ-elispot試劑盒診斷為非結(jié)核病的患者9例，經(jīng)痰涂片、痰細(xì)菌培養(yǎng)、胸片結(jié)果以及臨床癥狀診斷全部為陰性結(jié)果，其陰性符合率達(dá)到100％。本發(fā)明提供的試劑盒在結(jié)核診斷中的具有很好的臨床適用性，且特異性好、靈敏性高，與其他診斷技術(shù)的符合率高。

附圖說(shuō)明

圖1：為本發(fā)明ifn-γ-elispot結(jié)核診斷試劑盒的優(yōu)勢(shì)多肽驗(yàn)證結(jié)果：(a)本試劑盒結(jié)核特異性多肽抗原肽seqidno.1～3刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為123)；(b)本試劑盒結(jié)核特異性多肽抗原肽seqidno.4～6刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為62)；(c)陰性對(duì)照(斑點(diǎn)數(shù)為0)；(d)陽(yáng)性(pha)對(duì)照(斑點(diǎn)數(shù)為801)；(e)是不加細(xì)胞的背景對(duì)照。

圖2：為本發(fā)明ifn-γ-elispot結(jié)核診斷試劑盒的優(yōu)選多肽驗(yàn)證結(jié)果：圖2中a為多肽抗原seqidno.1與seqidno.7～8聯(lián)合刺激結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為160)，b為本產(chǎn)品本試劑盒結(jié)核特異性多肽抗原肽seqidno.9～11刺激細(xì)胞后結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為146)，c為陰性對(duì)照(斑點(diǎn)數(shù)為0)，d為陽(yáng)性對(duì)照(pha)刺激結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為783)，e為不加細(xì)胞的背景對(duì)照(斑點(diǎn)數(shù)為0)。

圖3：為一例結(jié)核疑似患者的本ifn-γ-elispot試劑盒診斷結(jié)果：(a)陰性對(duì)照(斑點(diǎn)數(shù)為1)；(b)esat-6非免疫優(yōu)勢(shì)多肽刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為5)；(c)結(jié)核特異性多肽抗原肽seqidno.1～3刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為22)；(d)本產(chǎn)品結(jié)核特異性多肽抗原肽seqidno.4～6刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為19)；(e)pha陽(yáng)性對(duì)照刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為475)。

圖4：所示為一例結(jié)核疑似患者的本ifn-γ-elispot試劑盒多肽序列1、7～11的診斷結(jié)果。圖4中(a)為陰性對(duì)照(斑點(diǎn)數(shù)為1)，圖4(b)是esat-6非免疫優(yōu)勢(shì)多肽刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為4)，圖4(c)是結(jié)核特異性多肽抗原肽seqidno.1與seqidno.7～8刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為38)，圖4(d)是本產(chǎn)品結(jié)核特異性多肽抗原肽seqidno.9～11刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為43)，圖4(e)是pha陽(yáng)性對(duì)照刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為330)。

圖5：為利用本發(fā)明ifn-γ-elispot試劑盒對(duì)37個(gè)志愿者進(jìn)行結(jié)核篩查的結(jié)果。

圖6：為圖5中紅色框所顯示為其中一例ifn-γ-elispot結(jié)核檢測(cè)提示為結(jié)核陽(yáng)性的結(jié)果：(a)陰性對(duì)照(斑點(diǎn)數(shù)為1)；(b)esat-6非免疫優(yōu)勢(shì)多肽刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為6)；(c)結(jié)核特異性多肽抗原肽seqidno.1～3刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為17)；(d)本產(chǎn)品結(jié)核特異性多肽抗原肽seqidno.4～6刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為9)；(e)pha陽(yáng)性對(duì)照刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為466)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說(shuō)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為本技術(shù)領(lǐng)域的常規(guī)方法。實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市售常規(guī)生化試劑，實(shí)施例中的％，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。

實(shí)施例1：結(jié)核特異性t細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位多肽的制備及ifn-γ-elispot結(jié)核分枝桿菌感染診斷試劑盒的開(kāi)發(fā)

通過(guò)生物信息學(xué)分析，以及體外檢測(cè)t細(xì)胞免疫反應(yīng)來(lái)設(shè)計(jì)和篩選t細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位，包括以下步驟：

(1)通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)及相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)如propred、macvestor、preotean等，對(duì)rd1區(qū)編碼的蛋白esat-6和cfp-10的t細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，同時(shí)分析其與不同hla分型之間的識(shí)別關(guān)系。

(2)結(jié)合生物學(xué)分析結(jié)果，以overlap(重疊序列)方法設(shè)計(jì)并優(yōu)選出9條esat-6多肽和11條cfp-10多肽，每一條多肽包含9～22個(gè)氨基酸。

(3)收集結(jié)核病人血液標(biāo)本，每份2～5ml。結(jié)核病人入選標(biāo)準(zhǔn)為：有咳嗽、咳痰癥狀，胸片結(jié)果異常，痰涂片或痰細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性，且接受結(jié)核治療時(shí)間小于三周，hiv檢測(cè)陰性。

(4)用ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單核細(xì)胞(pbmc)，pbmc經(jīng)5～10mlpbs或prmi1640洗滌2次后，重懸于含10％胎牛血清(fbs，life公司)的rpmi1640培養(yǎng)基(life公司)，并計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。

(5)elispot法檢測(cè)t細(xì)胞接受刺激后釋放的ifn-γ，具體步驟為：在帶pvdf膜的96孔板(millipore公司)上包被人ifn-γ單克隆抗體(ebioscience公司)過(guò)夜，rpmi1640+10％fbs封閉后每孔加入2.5×10⁵個(gè)細(xì)胞及多肽，陽(yáng)性對(duì)照組加入植物血凝素(pha)，陰性對(duì)照組加入培養(yǎng)基或用于溶解多肽的溶解試劑，另外一組不加細(xì)胞作為背景對(duì)照。培養(yǎng)箱中孵育22小時(shí)，洗板后依次加入生物素標(biāo)記的抗人ifn-γ抗體，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，3-氨基-9-乙基咔唑(aec)底物顯色，在pvdf膜上形成肉眼可見(jiàn)的紅色斑點(diǎn)。結(jié)果在elispot讀板機(jī)上讀取。結(jié)果判定：斑點(diǎn)數(shù)≥10個(gè)，且大于2倍陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)判斷為陽(yáng)性結(jié)果；斑點(diǎn)數(shù)＜10個(gè)，或小于2倍陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)判斷為陰性結(jié)果。

(6)結(jié)果分析：根據(jù)多肽對(duì)結(jié)核病人刺激反應(yīng)后陽(yáng)性結(jié)果的頻率，最終篩選得到3條esat-6優(yōu)勢(shì)抗原表位多肽seqidno.1～3(其氨基酸序列可參見(jiàn)序列表中序列1～3)，2條esat-6優(yōu)選抗原表位多肽seqidno.7～8(其氨基酸序列可參見(jiàn)序列表中序列7～8)，3條cfp-10優(yōu)勢(shì)抗原表位多肽seqidno.4～6(其氨基酸序列可參見(jiàn)序列表中序列4～6)，3條cfp-10優(yōu)選抗原表位多肽seqidno.9～11(其氨基酸序列可參見(jiàn)序列表中序列9～11)。圖1為多肽1～6篩查的一個(gè)典型的ifn-γ-elispot結(jié)果。其中圖1(a)為本試劑盒結(jié)核特異性多肽抗原肽seqidno.1～3聯(lián)合刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為123)，圖1(b)為本試劑盒結(jié)核特異性多肽抗原肽seqidno.4～6聯(lián)合刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為62)，圖1(c)為陰性對(duì)照(斑點(diǎn)數(shù)為0)，圖1(d)為陽(yáng)性(pha)對(duì)照(斑點(diǎn)數(shù)為801)，圖1(e)是不加細(xì)胞的背景對(duì)照。圖2為序列1、7～11的多肽篩查的一個(gè)典型的ifn-γ-elispot結(jié)果。圖2a為多肽抗原肽seqidno.1與seqidno.7～8聯(lián)合刺激結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為160)，圖2b為本產(chǎn)品本試劑盒結(jié)核特異性多肽抗原肽seqidno.9～11聯(lián)合刺激細(xì)胞后結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為146)，圖2c為陰性對(duì)照(斑點(diǎn)數(shù)為0)，圖2d為陽(yáng)性對(duì)照(pha)刺激結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為783)，圖2e為不加細(xì)胞的背景對(duì)照(斑點(diǎn)數(shù)為0)。

實(shí)施例2：本發(fā)明所開(kāi)發(fā)的ifn-γ-elispot結(jié)核分枝桿菌感染診斷試劑盒，包含：

(1)、抗原刺激物，為實(shí)施例1中所篩選出的氨基酸序列如序列表中序列1-11所示的多肽中一種或者兩種以上多肽的組合，也可以為這些多肽的類(lèi)似物；

(2)、捕獲抗體，為抗人ifn-γ的單克隆抗體，可購(gòu)自ebioscience公司；

(3)、檢測(cè)抗體，為生物素標(biāo)記的抗人ifn-γ的抗體；

(4)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素；

(5)、3-氨基-9-乙基咔唑(aec)顯色底物；

(6)、陽(yáng)性對(duì)照刺激物，為植物血凝素(pha)；

(7)、陰性對(duì)照物，為培養(yǎng)基(例如rpmi1640+10％fbs)或用于溶解多肽的溶解試劑(例如dmso)。

實(shí)施例3：本發(fā)明的ifn-γ-elispot試劑盒應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌感染疑似患者的臨床診斷

目的：檢驗(yàn)本發(fā)明的ifn-γ-elispot結(jié)核分枝桿菌感染診斷試劑盒在結(jié)核診斷中的臨床適用性、特異性、靈敏性及與其他診斷技術(shù)的符合率。

(1)收集55例結(jié)核分枝桿菌高度疑似感染者血液標(biāo)本，每份2～5ml。

(2)用ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單核細(xì)胞(pbmc)，pbmc經(jīng)5～10mlpbs或prmi1640洗滌2次后，重懸于含10％胎牛血清(fbs)的rpmi1640培養(yǎng)基，并計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。

(3)elispot法檢測(cè)t細(xì)胞接受刺激后釋放的ifn-γ，具體步驟為：在帶pvdf膜的96孔板上包被人ifn-γ單克隆抗體過(guò)夜，rpmi1640+10％fbs封閉后每孔加入2.5×10⁵個(gè)細(xì)胞及多肽seqid1～3多肽(或者優(yōu)選多肽組合，為seqidno.1多肽與seqidno.7～8多肽的組合)或多肽seqid4～6(或者優(yōu)選多肽seqidno.9～11的組合)，陽(yáng)性對(duì)照組加入植物血凝素(pha)，陰性對(duì)照組加入10％fbs/1640培養(yǎng)基或溶解多肽的溶解試劑dmso，另外一組不加細(xì)胞作為背景對(duì)照。培養(yǎng)箱中孵育22小時(shí)，洗板后依次加入生物素標(biāo)記的抗人ifn-γ抗體，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，3-氨基-9-乙基咔唑(aec)底物顯色，在pvdf膜上形成肉眼可見(jiàn)的紅色斑點(diǎn)。結(jié)果在elispot讀板機(jī)上讀取。結(jié)果判定：斑點(diǎn)數(shù)≥10個(gè)，且大于2倍陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)判斷為陽(yáng)性結(jié)果；斑點(diǎn)數(shù)＜10個(gè)，或小于2倍陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)判斷為陰性結(jié)果。

(4)結(jié)果分析：55例疑似結(jié)核分枝桿菌感染患者中，經(jīng)痰涂片、痰細(xì)菌培養(yǎng)、胸片以及臨床癥狀被綜合確診為結(jié)核病的病人46例，用本發(fā)明的ifn-γ-elispot試劑盒診斷為結(jié)核分枝桿菌感染的病人41例，因此陽(yáng)性符合率為89.1％；用本ifn-γ-elispot試劑盒診斷為非結(jié)核病的患者9例，經(jīng)痰涂片、痰細(xì)菌培養(yǎng)、胸片結(jié)果以及臨床癥狀診斷全部為陰性結(jié)果，因此陰性符合率達(dá)到100％。圖3所示為一例結(jié)核疑似患者的本ifn-γ-elispot試劑盒診斷結(jié)果(該檢測(cè)結(jié)果其所用試劑盒含有的抗原刺激物為多肽seqidno.1～3、或多肽seqidno.4～6)。圖3(a)為陰性對(duì)照(斑點(diǎn)數(shù)為1)，圖3(b)是esat-6非免疫優(yōu)勢(shì)多肽刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為5)，圖3(c)是結(jié)核特異性多肽抗原肽seqidno.1～3聯(lián)合刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為22)，圖3(d)是本產(chǎn)品結(jié)核特異性多肽抗原肽seqidno.4～6聯(lián)合刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為19)，圖3(e)是pha陽(yáng)性對(duì)照刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為475)。圖4所示為一例結(jié)核疑似患者的優(yōu)選ifn-γ-elispot試劑盒的診斷結(jié)果(該檢測(cè)結(jié)果其所用試劑盒含有的抗原刺激物為多肽seqidno.1與seqidno.7～8組合而成、或多肽seqidno.9～11組合而成)。圖4(a)為陰性對(duì)照(斑點(diǎn)數(shù)為1)，圖4(b)是esat-6非免疫優(yōu)勢(shì)多肽刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為4)，圖4(c)是結(jié)核特異性多肽seqidno.1與seqidno.7～8聯(lián)合刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為38)，圖4(d)是本產(chǎn)品結(jié)核特異性多肽抗原肽seqidno.9～11聯(lián)合刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為43)，圖4(e)是pha陽(yáng)性對(duì)照刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為330)。

實(shí)施例4：本發(fā)明的ifn-γ-elispot試劑盒在未知人群結(jié)核篩查中的適用性

目的：檢驗(yàn)本發(fā)明ifn-γ-elispot結(jié)核分枝桿菌感染診斷試劑盒(該實(shí)施例所用的試劑盒，其含有的抗原刺激物為多肽seqidno.1～3的組合、或多肽seqidno.4～6的組合)在大規(guī)模人群結(jié)核篩查中的適用性、特異性與靈敏性。

(1)收集37例hiv檢測(cè)陰性的志愿者血液標(biāo)本，每份2～3ml。這些人均接種過(guò)bcg疫苗。

(2)用ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單核細(xì)胞(pbmc)，pbmc經(jīng)5～10mlpbs或prmi1640洗滌2次后，重懸于含10％胎牛血清(fbs)的rpmi1640培養(yǎng)基，并計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。

(3)elispot法檢測(cè)t細(xì)胞接受刺激后釋放的ifn-γ，具體步驟為：在帶pvdf膜的96孔板上包被人ifn-γ單克隆抗體過(guò)夜，rpmi1640+10％fbs封閉后每孔加入2.5×10⁵個(gè)細(xì)胞及序列1～3多肽或序列4～6多肽，陽(yáng)性對(duì)照組加入植物血凝素(pha)，陰性對(duì)照組加入培養(yǎng)基或溶解多肽的溶解試劑，另外一組不加細(xì)胞作為背景對(duì)照。培養(yǎng)箱中孵育22小時(shí)，洗板后依次加入生物素標(biāo)記的抗人ifn-γ抗體，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，3-氨基-9-乙基咔唑(aec)底物顯色，在pvdf膜上形成肉眼可見(jiàn)的紅色斑點(diǎn)。結(jié)果在elispot讀板機(jī)上讀取。結(jié)果判定：斑點(diǎn)數(shù)≥10個(gè)，且大于2倍陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)判斷為陽(yáng)性結(jié)果；斑點(diǎn)數(shù)＜10個(gè)，或小于2倍陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)判斷為陰性結(jié)果。

(4)結(jié)果分析：圖5是本ifn-γ-elispot試劑盒應(yīng)用于未知人群的結(jié)核檢測(cè)部分結(jié)果，圖5中紅色框所顯示為其中一例ifn-γ-elispot結(jié)核檢測(cè)提示為陽(yáng)性的結(jié)果(可見(jiàn)圖6)，其中圖6(a)為陰性對(duì)照(斑點(diǎn)數(shù)為1)，圖6(b)為esat-6非免疫優(yōu)勢(shì)多肽刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為6)，圖6(c)為結(jié)核特異性多肽抗原肽seqidno.1～3聯(lián)合刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為17)，圖6(d)為本產(chǎn)品結(jié)核特異性多肽抗原肽seqidno.4～6聯(lián)合刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為9)，圖6(e)為pha陽(yáng)性對(duì)照刺激細(xì)胞后的ifn-γ-elispot結(jié)果(斑點(diǎn)數(shù)為466)，該結(jié)果提示該志愿者ifn-γ-elispot結(jié)核檢測(cè)陽(yáng)性，也說(shuō)明37例志愿者標(biāo)本中有1例呈ifn-γ-elispot結(jié)核檢測(cè)陽(yáng)性，后該志愿者經(jīng)過(guò)進(jìn)一步檢測(cè)，證實(shí)為活動(dòng)性結(jié)核分枝桿菌感染，說(shuō)明本發(fā)明開(kāi)發(fā)的ifn-γ-elispot試劑盒可適用于大規(guī)模人群結(jié)核普查且不受bcg疫苗接種或其他基礎(chǔ)性疾病等的影響。另外，對(duì)優(yōu)選多肽序列7～11對(duì)類(lèi)似的未知人群也進(jìn)行了大規(guī)模的結(jié)核篩查實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)優(yōu)選多肽序列7～11具有類(lèi)似于多肽序列1～6對(duì)大規(guī)模人群進(jìn)行結(jié)核篩查的特異性與靈敏性，在此不再贅述。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明做任何形式上的限制，故凡未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。