本發(fā)明屬于化工領(lǐng)域，涉及檢測(cè)水樣中pcb77的方法，具體來(lái)說(shuō)是一種利用紫外光譜儀檢測(cè)pcb77的方法。

背景技術(shù)：

多氯聯(lián)苯是一類具有209種同系物的持久性有機(jī)污染物。20世紀(jì)以來(lái)，由于人類的不正當(dāng)使用，多氯聯(lián)苯的污染越來(lái)越嚴(yán)重，威脅著人類的健康。

近年來(lái)，很多研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)多氯聯(lián)苯具有三致作用(致癌性、致突變性、致死)，并且在自然界中很難降解。多氯聯(lián)苯能夠在生物體殘留蓄積，最終可以通過(guò)食物鏈在人體內(nèi)富集，即便少量的多氯聯(lián)苯，也會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生危害。pcb77(3，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯)是一種典型的多氯聯(lián)苯同系物，具有較強(qiáng)的毒性。目前，針對(duì)多氯聯(lián)苯的檢測(cè)多為傳統(tǒng)色譜學(xué)檢測(cè)法，比如液質(zhì)連用、氣質(zhì)聯(lián)用等，雖然具有較高的精確度和準(zhǔn)確度，但是這些方法操作時(shí)間較長(zhǎng)、必須使用大型儀器，而且耗材昂貴。免疫檢測(cè)法對(duì)多氯聯(lián)苯的檢測(cè)具有較強(qiáng)的特異性和較低的檢測(cè)限，但是，抗體的制備較為復(fù)雜，并且不易保存，有些情況下，檢測(cè)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗。因此，我們需要開發(fā)一種簡(jiǎn)單、快速的檢測(cè)體系實(shí)現(xiàn)對(duì)pcb77的實(shí)時(shí)檢測(cè)。

核酸適配體是一類具有特定生物功能的核酸分子序列，一般是一段dna或者rna，通過(guò)技術(shù)selex(指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù))篩選而來(lái)，它能特異性識(shí)別和結(jié)合靶物質(zhì)。近年來(lái)核酸適配體已被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)領(lǐng)域，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白質(zhì)、金屬離子以及小分子等進(jìn)行定量檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種利用紫外光譜儀檢測(cè)pcb77的方法，所述的這種利用紫外光譜儀檢測(cè)pcb77的方法要解決現(xiàn)有技術(shù)中采用色譜學(xué)方法和免疫學(xué)方法檢測(cè)多氯聯(lián)苯的過(guò)程操作復(fù)雜、周期較長(zhǎng)和假陽(yáng)性的技術(shù)問(wèn)題。

本發(fā)明提供了一種利用紫外光譜儀檢測(cè)pcb77的方法，包括以下步驟：

1)一個(gè)制備功能核酸適配體母液的步驟，所述的功能核酸適配體的核苷酸序列為：5'-ggcggggctacgaagtagtgattttttccgatggcccgtg-3'，所述的功能核酸適配體母液的濃度為2μmol/l；

2)一個(gè)建立已知pcb77濃度的檢測(cè)體系的步驟，取12支離心管，分別加入25μl2μmol/l的核酸適配體，加入濃度為10ppm不同體積的pcb77溶液，充分混勻后將離心管置于25℃條件下孵育20～30分鐘，在反應(yīng)液中加入200μl納米金溶液，充分混勻后再將離心管置于25℃條件下孵育20～30分鐘，在上述混合液中加入50μl、2mol/l的氯化鈉溶液，最后用丙磺酸緩沖液定容，使得檢測(cè)體系溶液總體積達(dá)到1000μl，留作以下測(cè)定用；

3)另取1支離心管將pcb77溶液用超純水替代，按照上述步驟(1)的方法處理后作為空白對(duì)照體系溶液；

4)分別取1000μl步驟(1)和步驟(2)制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對(duì)照液，置于石英熒光比色皿中，用紫外光譜儀進(jìn)行掃描測(cè)定信號(hào)，掃描波長(zhǎng)范圍為450nm到700nm，并且得到520nm和650nm處的波長(zhǎng)吸光度，pcb77和空白對(duì)照液的吸光度分別為a＝a650/a520和a0＝a650/a520，計(jì)算增強(qiáng)的吸光度δa＝a-a0；

5)以不同濃度pcb77(c)與對(duì)應(yīng)增強(qiáng)吸光度δa作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

6)制備樣品檢測(cè)體系：取10μl待測(cè)樣品，按照步驟1)的方法制備檢測(cè)體系離心管，按步驟4)方法測(cè)定吸光度比值并計(jì)算δa；

7)根據(jù)計(jì)算所得的δa值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以求得樣品中pcb77含量。

進(jìn)一步的，所述的納米金溶液通過(guò)以下方法制備：在100ml煮沸的質(zhì)量百分比濃度為0.01％的氯金酸溶液中，加入3.5ml質(zhì)量百分比濃度為1％的檸檬酸三鈉溶液，攪拌20～40分鐘，移除加熱裝置后繼續(xù)攪拌混合物5～15分鐘，最后，使溶液達(dá)到室溫并且使用0.2μm超濾膜過(guò)濾，然后儲(chǔ)存在恒溫為4℃的棕色玻璃瓶中備用。

進(jìn)一步的，上述步驟2)中，檢測(cè)體系中核酸適配體的最終濃度為50nmol/l，檢測(cè)體系中氯化鈉的最終濃度為100mmol/l。

進(jìn)一步的，所述的丙磺酸緩沖液的濃度為10mm，ph＝10。

進(jìn)一步的，在步驟4)中，利用紫外光譜儀測(cè)定520nm和650nm處的波長(zhǎng)。

納米金是一種傳到信號(hào)的優(yōu)良材料，分散時(shí)呈紅色，聚集時(shí)呈藍(lán)色，本方法基于適配體和納米金，利用紫外光譜儀建立了一種比色傳感檢測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)了pcb77的定量檢測(cè)。

本發(fā)明所述實(shí)驗(yàn)方法的原理在于：當(dāng)反應(yīng)體系中存在靶物質(zhì)pcb77時(shí)，核酸適配體則跟pcb77特異性結(jié)合形成復(fù)合物，加入納米金溶液，則納米金處于分散狀態(tài)，再加入氯化鈉溶液，納米金則產(chǎn)生聚集，溶液顏色呈藍(lán)色；當(dāng)反應(yīng)體系中不存在pcb77時(shí)，核酸適配體則跟加入的納米金溶液靜電結(jié)合，加入的氯化鈉溶液不能使納米金產(chǎn)生聚集，溶液呈紅色。使用紫外光譜儀測(cè)定溶液的吸光度，本方法通過(guò)反應(yīng)體系吸光度的變化與pcb77在不同濃度下的線性關(guān)系來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)pcb77的定量檢測(cè)。

本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)進(jìn)步是積極和明顯的。本發(fā)明提供了一種操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、成本低且高效的pcb77的檢測(cè)方法。本發(fā)明的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、成本低、檢測(cè)靈敏度高，特異性好，操作簡(jiǎn)便快捷且不依賴大型儀器設(shè)備，可用于水溶液中pcb77的定量檢測(cè)。采用本發(fā)明的方法測(cè)定水樣中pcb77的濃度范圍為0-1500ppb，線性區(qū)間為0-200ppb，線性擬合直線方程y＝1.08×10^-4x+1.21×10^-3，最低檢測(cè)限為10.1ppb。

附圖說(shuō)明

圖1顯示了本發(fā)明的原理示意圖。

圖2顯示了實(shí)施例中氯化鈉濃度優(yōu)化示意圖。

圖3顯示了實(shí)施例中適配體濃度優(yōu)化示意圖。

圖4顯示了靶物質(zhì)以及干擾物加入檢測(cè)體系后增強(qiáng)的吸光度比值示意圖。

圖5顯示了實(shí)施例中不同濃度的pcb77與增強(qiáng)的吸光度比值關(guān)系示意圖。

具體實(shí)施方式

以下將結(jié)合附圖1-5對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

本發(fā)明下述所提供的實(shí)施例是為了進(jìn)一步描述并證明本發(fā)明的實(shí)施例，這些實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)解釋為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

實(shí)施例1

氯化鈉濃度優(yōu)化

在1.5ml離心管中加入200μl納米金溶液，再分別加入(800，790，780，770，760，750，740，730)μl的丙磺酸緩沖液(濃度為10mmol/l、ph為7.0)，混勻，依次加入濃度為0，20，40，60，80，100，120，140mmol/l的氯化鈉溶液，使得體系總體積達(dá)到1000μl，然后取1000μl反應(yīng)液于石英比色皿中，利用紫外光譜儀測(cè)定520nm和650nm處的吸光度，計(jì)算比值a＝a650/a520(空白組為a0)，計(jì)算差值△a＝a-a0繪制曲線，峰值最高對(duì)應(yīng)的氯化鈉濃度為100mmol/l，如圖2所示。

實(shí)施例2

核酸適配體濃度優(yōu)化

將收到的核酸適配體樣品配制成2μmol/l的母液，然后分別設(shè)置八組濃度(0，10，20，30，40，50，60，70nmol/l)適配體，每組中加入200μl納米金溶液和(750,745,740,735,730,725,720,715)μl的丙磺酸緩沖液，充分混勻后再將離心管置于25℃條件下孵育20min，加入實(shí)施例1中優(yōu)化好的氯化鈉溶液，混勻，使得檢測(cè)體系溶液總體積達(dá)到1000μl，利用紫外光譜儀測(cè)定520nm和650nm處的吸光度，計(jì)算比值a＝a650/a520(空白組為a0)，計(jì)算差值△a＝a-a0，繪制曲線，峰值最高處對(duì)應(yīng)的適配體濃度為50nmol/l，如圖3。

上述核酸適配體的核苷酸序列為：5'-ggcggggctacgaagtagtgattttttccgatggcccgtg-3'，購(gòu)于上海生工。

實(shí)施例3

特異性實(shí)驗(yàn)

取5支分別加入25μl，2μmol/l適配體的離心管，設(shè)置空白組，其余四組分別加入100μl，10ppm的pcb77(3，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯)、pcb28(2，4，4′-三氯聯(lián)苯)、pcb52(2，2′，5，5′-四氯聯(lián)苯)、pcb118(2，3′，4，4′，5-五氯聯(lián)苯)溶液，充分混勻后再將離心管置于25℃條件下孵育20min，在上述混合液中加入200μl納米金溶液和630μl的丙磺酸緩沖液，充分混勻置于25℃條件下孵育20min，在上述混合液中加入50μl、2mol/l氯化鈉溶液，使得檢測(cè)體系溶液總體積達(dá)到1000μl，分別取上述反應(yīng)液1000μl于石英比色皿中，利用紫外光譜儀測(cè)定520nm和650nm處的吸光度，計(jì)算比值a＝a650/a520(空白組為a0)，計(jì)算差值△a＝a-a0，繪制柱狀圖，如圖4所示，pcb77具有較好的特異性。

實(shí)施例4

靈敏度實(shí)驗(yàn)

本實(shí)施例提供一種利用紫外光譜儀檢測(cè)pcb77(3，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯)的方法(如圖5所示)，具體包括如下步驟：

(1)建立已知pcb77濃度的檢測(cè)體系的步驟，取12支分別加入25μl，2μmol/l核酸適配體的離心管，加入濃度為10ppm不同體積的pcb77溶液，充分混勻后將離心管置于25℃條件下孵育20分鐘，在反應(yīng)液中加入200μl納米金溶液和相應(yīng)體積(475～625μl)的丙磺酸緩沖液，充分混勻后再將離心管置于25℃條件下孵育20分鐘，在上述混合液中加入50μl、2mol/l的氯化鈉溶液，使得檢測(cè)體系溶液總體積達(dá)到1000μl，留作以下測(cè)定用；

(2)另取1支離心管將pcb77溶液用超純水替代，按照上述步驟(1)的方法處理后作為空白對(duì)照體系溶液；

(3)分別取1000μl步驟(1)和步驟(2)制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對(duì)照液，置于石英熒光比色皿中，用紫外光譜儀進(jìn)行掃描測(cè)定信號(hào)，掃描波長(zhǎng)范圍為450nm到700nm，并且得到520nm和650nm處的波長(zhǎng)吸光度，pcb77和空白對(duì)照液的吸光度分別為a＝a650/a520和a0＝a650/a520，計(jì)算增強(qiáng)的吸光度δa＝a-a0；

(4)以不同濃度pcb77(c)與對(duì)應(yīng)增強(qiáng)吸光度δa作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(5)制備樣品檢測(cè)體系：取10μl待測(cè)樣品，加入到步驟(1)方法制備的檢測(cè)體系離心管中，充分混勻后再將離心管置于25℃條件下孵育20min后，在混合液中加入50μl、2mol/l的氯化鈉溶液，混勻，使檢測(cè)體系總體積達(dá)到1000μl，按步驟(3)方法測(cè)定吸光度比值并計(jì)算δa。

(6)根據(jù)計(jì)算所得的δa值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以求得樣品中pcb77含量。

(7)驗(yàn)證：用本發(fā)明方法測(cè)定含pcb77濃度分別為100ppb、500ppb和1000ppb的水樣各一份，得到的平均回收率分別為104.6％，87.0％和111.4％，從而證明了本方法的可靠性。

(8)采用本發(fā)明的方法測(cè)定水樣中pcb77的濃度范圍為0-1500ppb，線性區(qū)間為0-200ppb，線性擬合直線方程為y＝1.08×10^-4x+1.21×10^-3，最低檢測(cè)限為10.1ppb。

序列表

<110>上海市環(huán)境科學(xué)研究院

<120>一種利用紫外光譜儀檢測(cè)pcb77的方法

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>40

<212>dna

<213>功能核酸適配體

<400>1

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