本發(fā)明涉及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測尿液、血漿或血斑中甲基丙二酸、甲基枸櫞酸和/或同型半胱氨酸的方法。
背景技術(shù)：
：甲基丙二酸是纈氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、膽固醇和奇數(shù)鏈脂肪酸分解途徑中，甲基丙二酰輔酶a在異常代謝情況下的旁路產(chǎn)物，是由于基因突變導(dǎo)致的甲基丙二酰變位酶或甲基鈷胺素活性下降引起的甲基丙二酰輔酶a代謝受阻，造成甲基丙二酸，甲基枸櫞酸等代謝物異常蓄積，引起腦、肝、腎等多臟器損傷，以上狀況臨床歸為甲基丙二酸血癥。甲基丙二酸血癥是一種常染色體隱性遺傳疾病，根據(jù)酶缺陷的類型分為甲基丙二酰變位酶自身缺陷及其輔酶鈷胺素(維生素b12)代謝缺陷兩大類，依據(jù)異常指標(biāo)不同又分為單純性甲基丙二酸血癥與甲基丙二酸血癥合并同型半胱氨酸血癥，二者以同型半胱氨酸含量是否升高為判斷依據(jù)。甲基枸櫞酸是纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等支鏈氨基酸和奇數(shù)鏈脂肪酸分解中由于丙酰輔酶a羧化酶活性缺乏導(dǎo)致體內(nèi)蓄積的丙酸及其相關(guān)代謝產(chǎn)物中特異性的一種有機(jī)酸，以上代謝情況異常歸為丙酸血癥。同時(shí)在甲基丙二酸血癥中也伴有甲基枸櫞酸的特異性升高。丙酰輔酶a是纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸等支鏈氨基酸和奇數(shù)鏈脂肪酸和膽固醇的常見氧化降解產(chǎn)物，被丙酰輔酶a羧化酶催化可以轉(zhuǎn)化為甲基丙二酰輔酶a，后者最終轉(zhuǎn)化為琥珀酰輔酶a進(jìn)入三羧酸循環(huán)。所以，甲基丙二酸血癥和丙酸血癥是一條代謝通路上不同酶缺陷引起的不同癥狀，在血斑串聯(lián)篩查中統(tǒng)一提示血丙酰肉堿異常，需要進(jìn)行尿液有機(jī)酸或者基因突變位點(diǎn)的檢測來分辨診斷。目前一般采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測尿中的甲基丙二酸和甲基枸櫞酸，同型半胱氨酸則采用酶聯(lián)免疫試劑盒，液相色譜法或液相色譜質(zhì)譜法檢測血清或血漿中的含量。尿液，血漿的檢測常用100-200ul樣本，甚至更多，臨床嬰幼兒樣本采集量越大配合采集難度越高，采集質(zhì)量也越難控制。血斑由于含血量少，除了血液本身物質(zhì)的干擾，還存在采血濾紙生產(chǎn)過程中的物質(zhì)干擾，對于測定痕量物質(zhì)增加了難度。目前，面臨串聯(lián)篩查血丙酰肉堿異常時(shí)，如何尋找一種方便，快速，測定準(zhǔn)確，節(jié)省樣本的方法可以同時(shí)檢測甲基丙二酸，甲基枸櫞酸和同型半胱氨酸用以分辨甲基丙二酸血癥單純性，合并同型半胱氨酸型和丙酸血癥至關(guān)重要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中不能同時(shí)檢測甲基丙二酸，甲基枸櫞酸和同型半胱氨酸、檢測樣本用量大和檢測時(shí)間長等問題，提供一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測尿液，血漿或血斑中甲基丙二酸、甲基枸櫞酸和/或同型半胱氨酸的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測甲基丙二酸、甲基枸櫞酸和/或同型半胱氨酸的方法，檢測物質(zhì)為：同時(shí)檢測甲基丙二酸、甲基枸櫞酸和同型半胱氨酸中的兩種或三種，以及單獨(dú)檢測甲基丙二酸、甲基枸櫞酸或同型半胱氨酸；檢測方法包括樣品前處理、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測；樣品前處理：1)血斑樣品前處理：取1/4～3/4直徑8mm的血斑樣本，加入含有內(nèi)標(biāo)物的萃取劑，振蕩孵育，然后吹干，殘余物進(jìn)行衍生反應(yīng)，干燥后復(fù)溶，得到待測樣品；2)血漿和尿液樣品前處理：取20-40ul檢測樣本，加入含有內(nèi)標(biāo)物的蛋白沉淀劑，離心沉淀蛋白；上清液干燥后進(jìn)行衍生反應(yīng)，干燥后復(fù)溶，得到待測樣品；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測：對所述待測樣品用液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜進(jìn)行檢測；采用正離子模式，掃描方式采用多反應(yīng)檢測mrm。進(jìn)一步地，所述方法還包括定性判斷或定量計(jì)算：定性判斷依據(jù)甲基丙二酸、甲基枸櫞酸和同型半胱氨酸的相對保留時(shí)間，以及甲基丙二酸定量離子對、甲基枸櫞酸定量離子對和同型半胱氨酸定量離子對的豐度比；定量計(jì)算依據(jù)甲基丙二酸、甲基枸櫞酸和同型半胱氨酸與對應(yīng)內(nèi)標(biāo)物在內(nèi)標(biāo)曲線上的峰面積比值計(jì)算，定量計(jì)算時(shí)采用定值質(zhì)控品的測值作為測定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制，測值不能超過定值的±20％。進(jìn)一步地，所述的甲基丙二酸，甲基枸櫞酸和同型半胱氨酸的對應(yīng)內(nèi)標(biāo)物包括3d-甲基丙二酸、3d-甲基枸櫞酸和8d-同型半胱氨酸。進(jìn)一步地，所述萃取劑為乙腈：水：甲酸為3：2：0.02比例配制的含內(nèi)標(biāo)物和dtt的溶液；所述衍生反應(yīng)為與鹽酸正丁醇的衍生反應(yīng)；所述萃取劑、鹽酸正丁醇和復(fù)溶劑的體積比為3：2：2。進(jìn)一步地，所述蛋白沉淀劑為乙醇：水：甲酸為8:3:0.3比例配制的含內(nèi)標(biāo)物和dtt的溶液；所述衍生反應(yīng)為與鹽酸正丁醇的衍生反應(yīng)；所述樣本、蛋白沉淀劑、鹽酸正丁醇和復(fù)溶劑的體積比為3：10：5：8。進(jìn)一步地，所述液相色譜分離參數(shù)包括：色譜柱：1.7μm或2.6μmc18，3.0*30-100mm或4.6*100-150mm，色譜柱柱溫：35-45℃，進(jìn)樣量:8-12μl，流速：0.4-0.6ml/min，流動(dòng)相：a相：含0.1％甲酸和2mmol甲酸胺的水；b相：含0.1％甲酸和2mmol甲酸胺的80％乙腈；流動(dòng)相梯度：0-1分鐘，a相90％，b相10％；1.0-2.5分鐘，a相90％-60％，b相10％-40％；2.5-2.6分鐘，a相60％-40％，b相40％-60％；2.6-5分鐘，a相40％-15％，b相60％-85％；5.0-5.1分鐘，a相15％-5％，b相85％-95％；5.1-5.8分鐘，a相5％，，b相95％；5.8-6.5分鐘，a相5％-0％，b相95％-100％；6.5-6.6分鐘，a相0％-90％，b相100％-10％；6.6-7.5分鐘，a相90％，b相10％。進(jìn)一步地，所述質(zhì)譜采集參數(shù)包括：電離源:電噴霧電離esi源；離子源加熱溫度：135～165℃；去溶劑氣：700～900l/hr；去溶劑氣溫度：350～450℃；錐孔吹氣：40～60l/hr；毛細(xì)管電壓2.3～2.7kv；出口電壓90-210v；入口電壓0.13-0.2v；錐孔電壓20-25v；碰撞電壓10-15v。進(jìn)一步地，所述定值質(zhì)控品，其中血斑定值質(zhì)控品的配制方法為：用0.8％-0.9％生理鹽水清洗商品化牛全血的血紅細(xì)胞得紅細(xì)胞懸液，0.8％-0.9％生理鹽水配制3％-5％牛血清蛋白溶液，所述紅細(xì)胞懸液與所述3％-5％牛血清蛋白溶液按體積比1：1等量混合，添加甲基丙二酸、甲基枸櫞酸和同型半胱氨酸的標(biāo)準(zhǔn)品得到。本發(fā)明提供的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測血斑中甲基丙二酸、甲基枸櫞酸和/或同型半胱氨酸的方法，應(yīng)用液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，可以同時(shí)或分別檢測出樣品中的甲基丙二酸，甲基枸櫞酸和同型半胱氨酸3種極性差異大的物質(zhì)，檢測時(shí)間短，通量高，檢測精密度高，物質(zhì)覆蓋性廣，成本低廉。前處理衍生反應(yīng)適用于血斑、血漿和尿液3種樣本的處理，樣本用量少，節(jié)約了樣本量，通過萃取劑萃取血斑、蛋白沉淀劑離心血漿和尿液，然后經(jīng)鹽酸正丁醇衍生，復(fù)溶后便可以用液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，前處理操作和反應(yīng)清晰，并有效去除基質(zhì)干擾，特異性，抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)。附圖說明圖1為本發(fā)明實(shí)施例1提供的一種液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法檢測人血斑中的甲基丙二酸，甲基枸櫞酸和同型半胱氨酸的方法流程圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明實(shí)施例提供一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測尿液、血漿或血斑中甲基丙二酸、甲基枸櫞酸和/或同型半胱氨酸的方法。檢測物質(zhì)為：同時(shí)檢測甲基丙二酸、甲基枸櫞酸和同型半胱氨酸中的兩種或三種，以及單獨(dú)檢測甲基丙二酸、甲基枸櫞酸或同型半胱氨酸；具體方法如下：(一)樣本前處理方法血漿和尿液的處理方法：取20-40ul血漿或尿液樣本，加入含有內(nèi)標(biāo)物和dtt的蛋白沉淀劑，離心沉淀蛋白。移取上清液至96孔版吹干，加入鹽酸正丁醇衍生反應(yīng)，然后吹干反應(yīng)物，添加復(fù)溶液待測。血斑的處理方法：取1/4～3/4直徑8mm的血斑樣本，加入含有內(nèi)標(biāo)物和dtt的萃取劑，振蕩孵育，然后吹干，加入鹽酸正丁醇衍生反應(yīng)，然后吹干反應(yīng)物，添加復(fù)溶液待測。所述甲基丙二酸、甲基枸櫞酸和同型半胱氨酸的對應(yīng)內(nèi)標(biāo)物包括3d-甲基丙二酸，3d-甲基枸櫞酸和8d-同型半胱氨酸。所述復(fù)溶劑為乙腈和水的混合物，其中，乙腈和水的體積并為30：70。所述蛋白沉淀劑為乙醇：水：甲酸為8:3:0.3比例配制的含內(nèi)標(biāo)物和dtt的溶液；所述樣本、蛋白沉淀劑、鹽酸正丁醇和復(fù)溶劑的體積比為3：10：5：8。所述萃取劑為乙腈：水：甲酸為3：2：0.02比例配制的含內(nèi)標(biāo)物和dtt的溶液；所述萃取劑、鹽酸正丁醇和復(fù)溶劑的體積比為3：2：2。(二)儀器檢測方法對所述待測樣品用液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測；所述檢測采用正離子模式，掃描方式采用多反應(yīng)檢測mrm。包括3個(gè)部分：1)液相色譜分離參數(shù)方法：所述液相色譜采用梯度洗脫模式洗脫，液相色譜條件包括：色譜柱：1.7μm或2.6μmc18，3.0*30-100mm或4.6*100-150mm；色譜柱柱溫：35-45℃；進(jìn)樣量:8-12μl；流速：0.4-0.6ml/min；流動(dòng)相：a相：含0.1％甲酸和2mmol甲酸胺的水；b相：含0.1％甲酸和2mmol甲酸胺的80％乙腈；流動(dòng)相梯度：0-1.0分鐘，a相90％，b相10％；1.0-2.5分鐘，a相90％-60％，b相10％-40％；2.5-2.6分鐘，a相60％-40％，b相40％-60％；2.6-5分鐘，a相40％-15％，b相60％-85％；5.0-5.1分鐘，a相15％-5％，b相85％-95％；5.1-5.8分鐘，a相5％，，b相95％；5.8-6.5分鐘，a相5％-0％，b相95％-100％；6.5-6.6分鐘，a相0％-90％，b相100％-10％；6.6-7.5分鐘，a相90％，b相10％。甲基丙二酸的的保留時(shí)間為4.4min左右，甲基丙二酸的同分異構(gòu)體琥珀酸的保留時(shí)間為4.2min左右，甲基枸櫞酸的保留時(shí)間為5.3min左右，同型半胱氨酸的保留時(shí)間為2.1min左右。3d-甲基丙二酸保留時(shí)間為4.4min左右，3d-甲基枸櫞酸保留時(shí)間為5.3min左右，8d-同型半胱氨酸的保留時(shí)間為2.0min左右。流動(dòng)相對比實(shí)驗(yàn)：對比流動(dòng)相1：a相為0.1％甲酸的水；b相為0.1％甲酸的80％乙腈；對比流動(dòng)相2：a相為0.1％甲酸的水；b相為0.1％甲酸的甲醇；對比流動(dòng)相3：a相為5mmol甲酸胺的水；b相為5mmol甲酸胺的80％乙腈；對比流動(dòng)相4：a相為5mmol甲酸胺的水；b相為5mmol甲酸胺的乙腈；以上條件對比梯度都采用了文獻(xiàn)描述的如下最短程序：0-8min，0％b-10％b；8.0-8.1min，10％b-60％b；8.1-13.0min，60％b-75％b；13.0-13.5min，75％b-100％b；13.5-14.5min，100％b；14.5-14.6min，100％b-0％b；14.6min-15.6min，0％b；共計(jì)15.6min。對比流動(dòng)相2，4均出現(xiàn)分離效果不佳，對比流動(dòng)相3峰形不佳，對比流動(dòng)相1在能夠分離物質(zhì)的情況下，梯度運(yùn)行時(shí)間更長的問題。本發(fā)明的流動(dòng)相優(yōu)點(diǎn)突出在：短時(shí)間內(nèi)7.5min分離了3個(gè)物質(zhì)，分離度更佳，而且還分離了甲基丙二酸的同分異構(gòu)體琥珀酸。2)質(zhì)譜采集參數(shù)方法儀器型號：watersacquitytqd或者ab4000性能同等的其它品牌和型號；電離源:電噴霧電離esi源；離子源加熱溫度：135～165℃；去溶劑氣：700～900l/hr；去溶劑氣溫度：350～450℃；錐孔吹氣：40～60l/hr；毛細(xì)管電壓2.3～2.7kv；出口電壓90-210v；入口電壓0.13-0.2v；錐孔電壓：20-25v；碰撞電壓：10-15v。目標(biāo)定量離子對包括甲基丙二酸定量離子對，甲基枸櫞酸定量離子對和同型半胱氨酸定量離子對；目標(biāo)定量離子的多反應(yīng)監(jiān)測離子掃描mrm的條件包括：甲基丙二酸的母離子的質(zhì)/荷比為230.9～231.9，對應(yīng)的子離子的質(zhì)/核比為119.1～120.1；甲基枸櫞酸的母離子的質(zhì)/荷比為375.0～376.0，對應(yīng)的子離子的質(zhì)/核比為199.0～200.0；同型半胱氨酸的母離子的質(zhì)/荷比為192.0～193.0，對應(yīng)的子離子的質(zhì)/核比為118.0～119.0。內(nèi)標(biāo)定量離子對包括3d-甲基丙二酸，3d-甲基枸櫞酸和/或8d-同型半胱氨酸的離子對；內(nèi)標(biāo)定量離子對的多反應(yīng)監(jiān)測離子掃描mrm的條件包括：3d-甲基丙二酸母離子的質(zhì)/荷比為233.9～234.9，對應(yīng)的子離子的質(zhì)/核比為122.1～123.1；3d-甲基枸櫞酸母離子的質(zhì)/荷比為378.0～379.0，對應(yīng)的子離子的質(zhì)/核比為202.0～203.0；8d-同型半胱氨酸母離子的質(zhì)/荷比為195.7～196.7，對應(yīng)的子離子的質(zhì)/核比為93.5～94.5。3)定性判斷和定量檢測方法定性判斷依據(jù)甲基丙二酸、甲基枸櫞酸和同型半胱氨酸的相對保留時(shí)間，以及甲基丙二酸定量離子對、甲基枸櫞酸定量離子對和同型半胱氨酸定量離子對的豐度比。具體而言，當(dāng)檢測甲基丙二酸時(shí)，依據(jù)甲基丙二酸的相對保留時(shí)間和甲基丙二酸定量離子對的豐度比判斷甲基丙二酸的存在。當(dāng)檢測甲基枸櫞酸時(shí)，依據(jù)甲基枸櫞酸的相對保留時(shí)間和甲基枸櫞酸定量離子對的豐度比判斷甲基枸櫞酸的存在。當(dāng)檢測同型半胱氨酸時(shí)，依據(jù)同型半胱氨酸的相對保留時(shí)間和同型半胱氨酸定量離子對的豐度比判斷同型半胱氨酸的存在。當(dāng)檢測甲基丙二酸、甲基枸櫞酸和同型半胱氨酸時(shí)，依據(jù)甲基丙二酸、甲基枸櫞酸和同型半胱氨酸的相對保留時(shí)間及甲基丙二酸定量離子對、甲基枸櫞酸定量離子對和同型半胱氨酸定量離子對的豐度比判斷甲基丙二酸、甲基枸櫞酸和同型半胱氨酸的存在。定量計(jì)算依據(jù)甲基丙二酸、甲基枸櫞酸和同型半胱氨酸與對應(yīng)內(nèi)標(biāo)物在內(nèi)標(biāo)曲線上的峰面積比值計(jì)算，定量計(jì)算時(shí)采用定值質(zhì)控品的測值作為測定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制，測值不能超過定值的±20％。具體而言，當(dāng)檢測甲基丙二酸時(shí)，依據(jù)甲基丙二酸與對應(yīng)內(nèi)標(biāo)物在內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線上的峰面積比值，計(jì)算人血斑樣品中的甲基丙二酸的含量。當(dāng)檢測甲基枸櫞酸時(shí)，依據(jù)甲基枸櫞酸與對應(yīng)內(nèi)標(biāo)物在內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線上的峰面積比值，計(jì)算人血斑樣品中的甲基枸櫞酸的含量。當(dāng)檢測同型半胱氨酸時(shí)，依據(jù)同型半胱氨酸與對應(yīng)內(nèi)標(biāo)物在內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線上的峰面積比值，計(jì)算人血斑樣品中的同型半胱氨酸的含量。當(dāng)檢測甲基丙二酸、甲基枸櫞酸和同型半胱氨酸時(shí)，依據(jù)甲基丙二酸和甲基枸櫞酸和同型半胱氨酸與對應(yīng)內(nèi)標(biāo)物在內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線上的峰面積比值，計(jì)算人血斑樣品中的甲基丙二酸和甲基枸櫞酸和同型半胱氨酸的含量。用標(biāo)準(zhǔn)品制作校正線，商品化采購內(nèi)標(biāo)，同時(shí)我們設(shè)計(jì)了質(zhì)控血斑作為檢測準(zhǔn)確性的考量。血斑質(zhì)控品的配制：1)對商品化牛全血離心去掉上層血漿，剩余用0.87％生理鹽水清洗商品化牛全血的血紅細(xì)胞得紅細(xì)胞懸液，0.87％生理鹽水配制5％牛血清蛋白溶液，所述紅細(xì)胞懸液與所述5％牛血清蛋白溶液按體積比1：1等量混合，渦旋混勻后過濾離心，得紅細(xì)胞懸液作為血斑基質(zhì)。2)在上述血斑基質(zhì)中加入設(shè)計(jì)賦值濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別為高，中，低3個(gè)濃度。高值濃度約為正常范圍的3倍濃度，中值濃度為正常范圍的高限定值，低值為正常人群的均值或陽性截?cái)嘀档牡拖?。質(zhì)控品采用在混合全血中添加標(biāo)準(zhǔn)品的設(shè)計(jì)完成。表1各物質(zhì)理論添加量單位:μmol/l低濃度中濃度高濃度甲基丙二酸1515甲基枸櫞酸1315同型半胱氨酸21540配制過程：a)低濃度l：11.8μl(甲基丙二酸mma：1mg/ml)+20.6μl(甲基枸櫞酸mca：1mg/ml)+27μl(同型半胱氨酸hcy：1mg/ml)+190.6μl超純水，充分混勻后，取10μl加入血斑基質(zhì)中，上下顛倒采血管，混勻備用。b)中濃度m:23.6μl(甲基丙二酸mma：1mg/ml)+24.7μl(甲基枸櫞酸mca：1mg/ml)+8.1μl(同型半胱氨酸hcy：10mg/ml)+43.6μl超純水，充分混勻后，取10μl加入血斑基質(zhì)中，上下顛倒采血管，混勻備用。c)高濃度h：7.1μl(甲基丙二酸mma：10mg/ml)+12.4μl(甲基枸櫞酸mca：10mg/ml)+21.6μl(同型半胱氨酸hcy：10mg/ml)+58.9μl超純水，充分混勻后，取10μl加入血斑基質(zhì)中，上下顛倒采血管，混勻備用。然后將血斑放置在陰涼處過夜干燥，確定血斑干燥后，放入鋁箔袋加入干燥劑放置在-20℃保存。每次檢測取用一定檢測量同樣本一起檢測。定量計(jì)算時(shí)采用血斑定值質(zhì)控品的測值作為該次測定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制，測值不能超過定值的±20％?，F(xiàn)有技術(shù)中不存在可以適用于檢測尿液、血漿和血斑中3種物質(zhì)的同種方法，也沒有8分鐘內(nèi)能同時(shí)測定尿液，血漿和血斑樣本類型中甲基丙二酸，甲基枸櫞酸和同型半胱氨酸含量的檢測方法。實(shí)施例1液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測血斑中甲基丙二酸、甲基枸櫞酸和同型半胱氨酸的方法參見圖1，實(shí)施例1提供了一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜用于檢測血斑中甲基丙二酸、甲基枸櫞酸和同型半胱氨酸的具體實(shí)現(xiàn)過程。(一)前處理-衍生反應(yīng)選取96孔板1個(gè)孔位，打4顆小直徑3mm的小血斑。加入150ul萃取劑溶液(含3d-甲基丙二酸、3d-甲基枸櫞酸和8d-同型半胱氨酸的dtt溶液)，在恒溫45℃，600rpm/min條件下，進(jìn)行孵育振蕩0.5小時(shí)，靜置1min。將液體轉(zhuǎn)移到另外干凈的新96孔板上，40℃氮?dú)獯蹈?。加?00μl鹽酸正丁醇，在恒溫65℃，600rpm/min條件下振蕩，反應(yīng)15mins。靜置3mins，40℃下氮?dú)獯蹈?。加?00μl的30％乙腈水復(fù)溶，在35℃，600rpm/min條件下，振蕩5mins，混勻后轉(zhuǎn)移至96孔板上，加載至液相色譜自動(dòng)進(jìn)樣器中。(二)檢測液相色譜自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)將樣品加載到液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀分析器lc-ms/ms。lc/ms/ms采用具有電噴霧電離源(esi)的watersacquitytqd串聯(lián)質(zhì)譜分析儀作為檢測器進(jìn)行分析。其中，電離源:電噴霧電離esi源；離子源加熱溫度：150℃；去溶劑氣：800l/hr；去溶劑氣溫度：400℃；錐孔吹氣：50l/hr。表2多反應(yīng)監(jiān)測離子掃描mrm的條件色譜柱：2.6μmxb-c18，3.0*50mm；色譜柱柱溫：40℃；進(jìn)樣量:10μl；流速：0.5ml/min。梯度洗脫包括：a相為含0.1％甲酸和2mmol甲酸胺的水；以及含0.1％甲酸和2mmol甲酸胺的80％乙腈。表3梯度洗脫流動(dòng)相時(shí)間(min)a相比例(％)b相比例(％)090101.090102.560402.640605.015855.15955.85956.501006.690107.59010采用上述流動(dòng)相，在梯度洗脫中，甲基丙二酸的的保留時(shí)間為4.41min，甲基枸櫞酸的保留時(shí)間為5.34min，同型半胱氨酸的保留時(shí)間為2.06min。樣品隨流動(dòng)相排出色譜柱出口后，在壓力的作用下進(jìn)入質(zhì)譜儀離子源或廢液，由六通閥控制進(jìn)入離子源的樣品通道，和進(jìn)入切換時(shí)間。在離子源內(nèi)液體樣品被汽化并且電離為帶電分子，帶電分子在電壓和真空作用下，進(jìn)入q1，q2和q3，其中q1和q3為質(zhì)量過濾器，只允許根據(jù)甲基丙二酸、甲基枸櫞酸和同型半胱氨酸和對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)3d-甲基丙二酸、3d-甲基枸櫞酸和8d-同型半胱氨酸質(zhì)核比選擇的母離子和子離子通過，q2位碰撞單元，母離子在此處與惰性氣體原子碰撞，產(chǎn)生特定的離子碎片。質(zhì)譜儀的第一個(gè)四級q1選擇具有甲基丙二酸、甲基枸櫞酸和同型半胱氨酸和對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)3d-甲基丙二酸、3d-甲基枸櫞酸和8d-同型半胱氨酸的特定質(zhì)核比m/z的離子，具有這些m/z的離子被允許進(jìn)入q2碰撞產(chǎn)生離子碎片，進(jìn)入q3，其中只有甲基丙二酸、甲基枸櫞酸和同型半胱氨酸和對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)3d-甲基丙二酸、3d-甲基枸櫞酸和8d-同型半胱氨酸的特定質(zhì)核比m/z的子離子被選擇通過，其他碎片離子被摒棄。參見下表5給出了被用于鑒別和定量的母離子和子離子。表4被用于鑒別和定量的母離子和子離子被分析物parent(m/z)daughter(m/z)同型半胱氨酸192.04118.018d-同型半胱氨酸195.9894.06甲基丙二酸230.98119.13d-甲基丙二酸233.98122.02甲基枸櫞酸375.14199.153d-甲基枸櫞酸378.15202.16隨著離子與檢測器碰撞，它們將捕獲到的離子數(shù)轉(zhuǎn)化成數(shù)字信號的電子脈沖。所獲得的數(shù)據(jù)被傳遞到計(jì)算機(jī)上，將所收集到的離子數(shù)目對時(shí)間做圖，即得到質(zhì)量層析譜圖。血斑標(biāo)準(zhǔn)物中的分析物和內(nèi)標(biāo)的峰面積的比值被用于構(gòu)建內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后該曲線被用于計(jì)算樣品或質(zhì)量控制物中分析物濃度。采用實(shí)施例1的方法進(jìn)行了2000例的人血斑中甲基丙二酸、甲基枸櫞酸和同型半胱氨酸檢測，檢測質(zhì)控物質(zhì)結(jié)果準(zhǔn)確，檢測方法校正線斜率穩(wěn)定，精密度rsd＜10％，檢測用時(shí)短，通量高，說明本方法準(zhǔn)確可靠，效率高。最后所應(yīng)說明的是，以上具體實(shí)施方式僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照實(shí)例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。當(dāng)前第1頁12