技術領域：
本發(fā)明涉及一種測定飲用水生物活性炭ttc-脫氫酶活性的方法。
背景技術：
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隨著飲用水處理技術的發(fā)展，常規(guī)處理工藝已經很難滿足日益提高的國家生活飲用水標準，越來越多的水廠開始采用生物活性炭深度處理工藝?；钚蕴勘旧砭哂袃?yōu)良的物理吸附性能，同時活性炭可以為微生物提供良好的載體，使其在降解cod、氨氮等污染物質中發(fā)揮生物降解作用，提高飲用水處理效果。
活性炭中的生物活性是評價活性炭生物處理能力的關鍵指標。目前常用的生物活性評價方法是氯化三苯基四氮唑(ttc)-脫氫酶(dha)活性法。該法以無色的ttc作為受體，與經微生物脫氫酶活化后的氫原子結合生成紅色的三苯甲基(tf)，然后根據tf的變色程度通過比色法做定量分析。目前該方法被較多應用于活性污泥和土壤的脫氫酶活性測定中，而對于飲用水生物活性炭處理工藝的應用較少。已有的對活性炭濾料的脫氫酶測定方法，大多需要對樣品進行預處理，包括超聲洗脫、振搖破碎和有機萃取劑吸附微生物，然后將制得的生物懸浮液作為測定樣本，將這種預處理活性炭后測定的方法稱為間接測定。但是實驗表明這種預處理方法不能有效測定活性炭的生物活性，其測定值經常出現空白吸光度值高于實驗組或實驗組吸光度值過小的情況。這是因為，與土壤和污泥對微生物的吸附不同，活性炭特殊的微孔結構使其對微生物所形成的生物膜具有較強的吸附性，尤其是水廠活性炭濾池中經過長時間生成的成熟穩(wěn)定的生物膜，其吸附性遠大于水對其吸附性，使用超聲波和振蕩器振蕩洗脫后，仍有大部分微生物附著在活性炭表面。此外，過強的超聲波對微生物細胞組織又具有一定的破壞作用，萃取混合液中的有機溶劑對微生物有一定的毒害作用，這些都會使微生物活性在從活性炭濾料轉移至溶液的過程中受損，導致在后續(xù)的測定中難以檢測到其生物活性，檢測線高，檢測生物量為105cfu/g活性炭。故對于飲用水生物活性炭濾料的脫氫酶活性測定，如何能最大限度地保存微生物活性的完整性成為該技術的關鍵。
技術實現要素：
本發(fā)明是為了解決目前間接測定飲用水生物活性炭ttc-脫氫酶活性的方法中有大部分微生物附著在活性炭表面、聲波對微生物細胞組織又具有一定的破壞作用，使微生物活性在從活性炭濾料轉移至溶液的過程中受損，導致在后續(xù)的測定中難以檢測到其生物活性的技術問題，而提供一種原位測定飲用水生物活性炭ttc-脫氫酶活性的方法。
本發(fā)明的原位測定飲用水生物活性炭ttc-脫氫酶活性的方法是按以下步驟進行的：
一、以吸光度值做橫坐標，以tf濃度做縱坐標，繪出tf標準曲線；
二、樣品處理：從水中取出待測的活性炭濾料，用蒸餾水反復洗滌3次～4次，然后將洗滌后的活性炭濾料按質量平均分成2份，分別放入兩支具塞比色管中；
三、向步驟二中的兩支具塞比色管中分別加入tris-hcl緩沖溶液、質量分數為0.36％的na2so3溶液、濃度為0.1mol/l的葡萄糖溶液和質量濃度為0.4％的ttc溶液至活性炭濾料完全浸沒，然后向其中一支具塞比色管中加入甲醛溶液終止酶反應作為空白組，另一支具塞比色管作為試驗組；所述的體積濃度為0.4％的ttc溶液和質量分數為0.36％的na2so3溶液的體積比為1:1；所述的體積濃度為0.4％的ttc溶液和濃度為0.1mol/l的葡萄糖溶液的體積比為1:1；所述的體積濃度為0.4％的ttc溶液和tris-hcl緩沖溶液的體積比為1:3；
四、樣品培養(yǎng)：將試驗組和空白組的具塞比色管均放入溫度為36℃～38℃的恒溫水浴振蕩器中培養(yǎng)20h～22h；
五、終止酶反應：向試驗組的具塞比色管中加入甲醛溶液終止酶反應，混合均勻，然后和空白組一起在轉速為4000rpm～4500rpm的條件下離心5min～8min，棄去上清液；
六、比色分析：向步驟五的試驗組和空白組的具塞比色管中分別加入質量分數為80％的丙酮溶液，分別將兩支具塞比色管底部的沉積物攪拌混合均勻，然后放入溫度為36℃～38℃的恒溫水浴振蕩器萃取10min，然后分別將兩支具塞比色管在轉速為4000rpm～4500rpm的條件下離心5min～8min，將試驗組的下層沉積物在溫度為75℃～80℃的條件下烘干6h～6.5h，稱量干重m，分別對離心后的試驗組和空白組的上層清液在紫外可見分光光度計上于485nm處測量吸光度a1和a2，a1為試驗組的吸光度，a2為空白組的吸光度；所述的質量分數為80％的丙酮溶液的體積是步驟二中tris-hcl緩沖溶液、質量分數為0.36％的na2so3溶液、濃度為0.1mol/l的葡萄糖溶液和體積濃度為0.4％的ttc溶液體積之和的1.5倍；
七、計算ttc-脫氫酶活性：將步驟六得到的a1和a2做差，即a1-a2得到的差值代入步驟一的tf標準曲線中得到tf濃度y，根據如下公式計算ttc-脫氫酶活性c，
c＝y(tǒng)×h/m×d，
式中的h為步驟六中加入的質量分數為80％的丙酮溶液的體積，單位是ml，
c的單位是μg/(gdw·h)，
y的單位是μg/ml，
m為步驟六中試驗組的下層沉積物的干重，單位是g，
d是步驟四中的培養(yǎng)時間，單位是h。
本發(fā)明中加入的甲醛溶液為分析純，100％。
本發(fā)明用單位時間、單位干重的活性炭表面上反應生成的tf量表示ttc-脫氫酶活性。
本發(fā)明的技術原理：
在測定ttc-dha活性時，其反應實質為高濃度ttc離子在溶液中游離運動，與脫氫酶活化的氫原子結合發(fā)生氧化還原反應生成紅色物質tf，該種物質可被有機溶劑萃取出來。由于高濃度ttc離子具有穿透活性炭表面生物膜的功能，因此，本發(fā)明在進行活性炭的ttc-脫氫酶測定時，沒有將活性炭表面的生物膜剝落，而且不對測定結果造成影響，適當延長反應時間，即可測得活性炭表面微生物的ttc-脫氫酶活性，這種測定方法稱為原位測定。
發(fā)明優(yōu)點：
與其他飲用水生物活性炭脫氫酶活性測定方法相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
1.根據實驗表明，相比于將生物膜從活性炭表面剝離下來的方法相比，本發(fā)明的原位測定方法更容易檢測到活性炭的ttc-脫氫酶活性，解決了其檢測線高和低基質濃度條件下ttc-脫氫酶活性不易檢測的問題，其可以檢測生物量為4.0×104cfu/g活性炭；
2.本發(fā)明方法省略了對活性炭樣品預處理的步驟，操作工序更為簡便；
3.本發(fā)明方法在普通微生物實驗室即可完成，無需借助超聲波、振蕩器、有機溶劑等設備和試劑，操作成本更為低廉；
4.本發(fā)明方法也適用于飲用水生物處理工藝中的其他固體填料(如無煙煤)的ttc-脫氫酶活性測定，操作方法簡便，具有普適性，應用前景廣泛。
附圖說明
圖1為試驗一中的tf標準曲線。
具體實施方式
具體實施方式一：本實施方式為一種原位測定飲用水生物活性炭ttc-脫氫酶活性的方法是按以下步驟進行的：
一、以吸光度值做橫坐標，以tf濃度做縱坐標，繪出tf標準曲線；
二、樣品處理：從水中取出待測的活性炭濾料，用蒸餾水反復洗滌3次～4次，然后將洗滌后的活性炭濾料按質量平均分成2份，分別放入兩支具塞比色管中；
三、向步驟二中的兩支具塞比色管中分別加入tris-hcl緩沖溶液、質量分數為0.36％的na2so3溶液、濃度為0.1mol/l的葡萄糖溶液和質量濃度為0.4％的ttc溶液至活性炭濾料完全浸沒，然后向其中一支具塞比色管中加入甲醛溶液終止酶反應作為空白組，另一支具塞比色管作為試驗組；所述的質量濃度為0.4％的ttc溶液和質量分數為0.36％的na2so3溶液的體積比為1:1；所述的質量濃度為0.4％的ttc溶液和濃度為0.1mol/l的葡萄糖溶液的體積比為1:1；所述的質量濃度為0.4％的ttc溶液和tris-hcl緩沖溶液的體積比為1:3；
四、樣品培養(yǎng)：將試驗組和空白組的具塞比色管均放入溫度為36℃～38℃的恒溫水浴振蕩器中培養(yǎng)20h～22h；
五、終止酶反應：向試驗組的具塞比色管中加入甲醛溶液終止酶反應，混合均勻，然后和空白組一起在轉速為4000rpm～4500rpm的條件下離心5min～8min，棄去上清液；
六、比色分析：向步驟五的試驗組和空白組的具塞比色管中分別加入質量分數為80％的丙酮溶液，分別將兩支具塞比色管底部的沉積物攪拌混合均勻，然后放入溫度為36℃～38℃的恒溫水浴振蕩器萃取10min，然后分別將兩支具塞比色管在轉速為4000rpm～4500rpm的條件下離心5min～8min，將試驗組的下層沉積物在溫度為75℃～80℃的條件下烘干6h～6.5h，稱量干重m，分別對離心后的試驗組和空白組的上層清液在紫外可見分光光度計上于485nm處測量吸光度a1和a2，a1為試驗組的吸光度，a2為空白組的吸光度；所述的質量分數為80％的丙酮溶液的體積是步驟二中tris-hcl緩沖溶液、質量分數為0.36％的na2so3溶液、濃度為0.1mol/l的葡萄糖溶液和體積濃度為0.4％的ttc溶液體積之和的1.5倍；
七、計算ttc-脫氫酶活性：將步驟六得到的a1和a2做差，即a1-a2得到的差值代入步驟一的tf標準曲線中得到tf濃度y，根據如下公式計算ttc-脫氫酶活性c，
c＝y(tǒng)×h/m×d，
式中的h為步驟六中加入的質量分數為80％的丙酮溶液的體積，單位是ml，
c的單位是μg/(gdw·h)，
y的單位是μg/ml，
m為步驟六中試驗組的下層沉積物的干重，單位是g，
d是步驟四中的培養(yǎng)時間，單位是h。
具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一的不同點是：步驟一中繪制tf標準曲線是按以下步驟進行的：
1)分別吸取1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml的ttc標準使用液放入6個50ml容量瓶中，用水定容，分別配置成20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml和120μg/ml的ttc溶液；所述的ttc標準使用液的制備方法為：稱取100mgttc固體，溶解定容至100m中容量瓶，得到ttc標準使用液；
2)取7支試管，分別加入2ml的tris-hcl緩沖液，再向其中的6支試管中分別加入1ml步驟(1)中不同濃度的ttc溶液，第7支試管加入1ml無氧水作為對照，然后向7支試管中加入1ml的質量分數為10％的硫化鈉溶液，將7支試管置入37℃恒溫搖床中振蕩30min，使ttc全部還原生成紅色的tf；所述的無氧水的制備方法為：取0.36g亞硫酸鈉溶解于水，然后定容至100ml的容量瓶中，得到無氧水；
3)再向7支試管中加入6ml的丙酮溶液，穩(wěn)定5分鐘，然后將上述7種溶液直接在波長為485nm處測吸光度，取吸光度值做橫坐標，tf濃度做縱坐標，繪出tf標準曲線。其他與具體實施方式一相同。
具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一的不同點是：步驟四中將試驗組和空白組的具塞比色管均放入溫度為37℃的恒溫水浴振蕩器中培養(yǎng)20h。其他與具體實施方式一相同。
具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式一的不同點是：步驟五中向試驗組的具塞比色管中加入甲醛溶液終止酶反應，混合均勻，然后和空白組一起在轉速為4000rpm的條件下離心5min，棄去上清液。其他與具體實施方式一相同。
具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式一的不同點是：步驟六中向步驟五的試驗組和空白組的具塞比色管中分別加入質量分數為80％的丙酮溶液，分別將兩支具塞比色管底部的沉積物攪拌混合均勻，然后放入溫度為37℃的恒溫水浴振蕩器萃取10min，然后分別將兩支具塞比色管在轉速為4000rpm的條件下離心5min，將試驗組的下層沉積物在溫度為75℃的條件下烘干6h，稱量干重m。其他與具體實施方式一相同。
通過以下試驗驗證本發(fā)明效果：
以海拉爾區(qū)某水廠濾池中的生物活性炭濾料為研究對象，通過控制不同的實驗條件，對比本發(fā)明的原位測定方法與超聲波振蕩預處理或有機溶劑萃取振蕩預處理后再測定的方法。
該水廠水源為淺層地下水，設計規(guī)模為8萬噸/天，水廠采用兩級過濾工藝，一級過濾前采用二級跌水曝氣，濾池濾料為無煙煤，一級濾池共6格；二級過濾前采用多孔道鼓風曝氣，濾池濾料為活性炭，二級濾池共16格。經過5個月，該工藝運行穩(wěn)定，各項出水指標均達標，進入試驗階段。
試驗一：本試驗為原位測定飲用水生物活性炭ttc-脫氫酶活性的方法是按以下步驟進行的：
一、以吸光度值做橫坐標，以tf濃度做縱坐標，繪出tf標準曲線；
二、樣品處理：取其中一個活性炭濾池濾層表面下30公分處的濾料，稱量10g濕炭料，，用蒸餾水反復洗滌3次，然后將洗滌后的活性炭濾料按質量平均分成2份，分別放入兩支具塞比色管中；
三、向步驟二中的兩支具塞比色管中分別加入3ml的tris-hcl緩沖溶液、1ml質量分數為0.36％的na2so3溶液、1ml濃度為0.1mol/l的葡萄糖溶液和1ml質量濃度為0.4％的ttc溶液，然后向其中一支具塞比色管中加入2ml甲醛溶液終止酶反應作為空白組，另一支具塞比色管作為試驗組；
四、樣品培養(yǎng)：將試驗組和空白組的具塞比色管均放入溫度為37℃的恒溫水浴振蕩器中培養(yǎng)20h；
五、終止酶反應：向試驗組的具塞比色管中加入2ml的甲醛溶液終止酶反應，混合均勻，然后和空白組一起在轉速為4000rpm的條件下離心5min，棄去上清液；
六、比色分析：向步驟五的試驗組和空白組的具塞比色管中分別加入12ml質量分數為80％的丙酮溶液，分別將兩支具塞比色管底部的沉積物攪拌混合均勻，然后放入溫度為37℃的恒溫水浴振蕩器萃取10min，然后分別將兩支具塞比色管在轉速為4000rpm的條件下離心5min，將試驗組的下層沉積物在溫度為75℃的條件下烘干6h，稱量干重m，分別對離心后的試驗組和空白組的上層清液在紫外可見分光光度計上于485nm處測量吸光度a1和a2，a1為試驗組的吸光度，a2為空白組的吸光度；
七、計算ttc-脫氫酶活性：將步驟六得到的a1和a2做差，即a1-a2得到的差值代入步驟一的tf標準曲線中得到tf濃度y，根據如下公式計算ttc-脫氫酶活性c，
c＝y(tǒng)×h/m×d，
式中的h為步驟六中加入的質量分數為80％的丙酮溶液的體積，單位是ml，
c的單位是μg/(gdw·h)，
y的單位是μg/ml，
m為步驟六中試驗組的下層沉積物的干重，單位是g，
d是步驟四中的培養(yǎng)時間，單位是h。
取水廠其他不同的2格二級濾池濾料，重復以上實驗，得出平均值。
試驗一的標準曲線為y＝229.53x-0.0516，r2＝0.9995，y為tf濃度，x為吸光度，如圖1所示。
試驗二、本試驗為間接測定活性炭ttc-脫氫酶活性的方法：
取與試驗一相同濾池活性炭濾層表面下30公分處濾料，稱量10g濕炭料，用蒸餾水反復洗滌3遍，分別將5g活性炭放入2支25ml具塞比色管中，向2支比色管中分別加入2ml丙酮，4ml甲醇，2ml葡萄糖的萃取混合液，充分混合均勻，于40khz超聲波頻率、60w/l超聲波功率強度條件下振蕩30min。
分別吸取振蕩后的細菌懸浮液4ml加入2支試管中，分別依次加入3ml的tris-hcl緩沖溶液、1ml質量分數為0.36％的na2so3溶液、1ml濃度為0.1mol/l的葡萄糖溶液和1ml質量濃度為0.4％的ttc溶液，并向其中一支具塞比色管中加入2.0ml甲醛終止酶反應以做樣品空白對照，充分混合均勻，另一支試管做試驗組；
將試驗組和空白組的具塞比色管均放入溫度為37℃的恒溫水浴振蕩器中培養(yǎng)20h；
向試驗組的具塞比色管中加入2ml的甲醛溶液終止酶反應，混合均勻，然后和空白組一起在轉速為4000rpm的條件下離心5min，棄去上清液；
向試驗組和空白組的具塞比色管中分別加入12ml質量分數為80％的丙酮溶液，分別將兩支具塞比色管底部的沉積物攪拌混合均勻，然后放入溫度為37℃的恒溫水浴振蕩器萃取10min，然后分別將兩支具塞比色管在轉速為4000rpm的條件下離心5min，將試驗組的下層沉積物在溫度為75℃的條件下烘干6h，稱量干重m，分別對離心后的試驗組和空白組的上層清液在紫外可見分光光度計上于485nm處測量吸光度a1和a2，a1為試驗組的吸光度，a2為空白組的吸光度；
將步驟六得到的a1和a2做差，即a1-a2得到的差值代入步驟一的tf標準曲線中得到tf濃度y，根據如下公式計算ttc-脫氫酶活性c，
c＝y(tǒng)×h/m×d，
式中的h為步驟六中加入的質量分數為80％的丙酮溶液的體積，單位是ml，
c的單位是μg/(gdw·h)，
y的單位是μg/ml，
m為步驟六中試驗組的下層沉積物的干重，單位是g，
d是步驟四中的培養(yǎng)時間，單位是h。
取水廠其他不同的2格二級濾池濾料，重復以上實驗，得出平均值。
試驗二的測定值經常出現空白組的吸光度值高于試驗組或試驗組吸光度值過小的情況，表明間接測定方法不能有效測定活性炭的生物活性。
試驗一(原位測定)與試驗二的方法(間接測定)結果對比如下表：
原位測定1號的計算過程如下：
a1為0.072，a2為0.005，差值為0.067，代入標準曲線，求得tf濃度為0.067×229.5-0.0516＝15.325μg/ml，步驟六中試驗組的下層沉積物的干重m為1.8g，
根據如下公式計算ttc-脫氫酶活性c，
c＝y(tǒng)×h/m×d，
式中的h為步驟六中加入的質量分數為80％的丙酮溶液的體積12ml，
y為15.325μg/ml，
d是步驟四中的培養(yǎng)時間20h，
15.325×12/(20×1.8)＝5.11μg/(gdw·h)。