本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫檢測(cè)領(lǐng)域中檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
：小反芻獸疫(ppr)是oie法定報(bào)告的傳染病，也被我國(guó)政府列為一類動(dòng)物傳染病,其具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)，該疫情的發(fā)生不但將給發(fā)生國(guó)的畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還會(huì)對(duì)國(guó)際貿(mào)易產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，因此該病引起許多國(guó)家的高度重視。小反芻獸疫(pestedespetitsruminants,ppr)是由小反芻獸疫病毒(pestedespetitsruminantsvirus,pprv)引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病，具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)。疫病的控制和消滅，離不開(kāi)有效的疫苗和快速敏感的檢測(cè)手段作為技術(shù)支撐，因此加大快速有效，價(jià)格低廉的診斷檢測(cè)試劑的研發(fā)力度，加快推動(dòng)相關(guān)產(chǎn)品上市，能夠?yàn)槲覈?guó)的全國(guó)小反芻獸疫消滅計(jì)劃的實(shí)施提供有力的技術(shù)支撐。目前,尚無(wú)有效方法治療小反芻獸疫,只能釆取疫苗接種,疫情發(fā)生后撲殺及加強(qiáng)定期血清監(jiān)測(cè)的方法控制該病。國(guó)內(nèi)外最常見(jiàn)的報(bào)道是以純化后的pprvn、h蛋白(全長(zhǎng))或包含n蛋白主要抗原表位的部分重組n、h蛋白片段作為包被抗原,也有以濃縮的pprv全病毒作為包被抗原建立間接elisa方法檢測(cè)ppr血清抗體(邱文英,2011；balamuruganetal.,2007),但尚未見(jiàn)到以h-f串聯(lián)融合蛋白為包被抗原建立間接elisa方法的報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是如何檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括包被原，所述包被原為重組小反芻獸疫病毒h-f融合蛋白，所述重組小反芻獸疫病毒h-f融合蛋白為a)或b)的蛋白質(zhì)：a)由seqidno.2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將seqidno.2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的可溶性蛋白質(zhì)。上述酶聯(lián)免疫試劑盒中，a)的蛋白質(zhì)名稱為rmhf1-y(又稱rmhf1)，是重組串聯(lián)的pprvh-f蛋白。seqidno.2由1184個(gè)氨基酸殘基組成。上述酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述重組小反芻獸疫病毒h-f融合蛋白可按照包括如下步驟的方法制備：使所述重組小反芻獸疫病毒h-f融合蛋白的編碼基因在生物中進(jìn)行表達(dá)得到所述蛋白質(zhì)；所述生物為微生物、植物或非人動(dòng)物。上述酶聯(lián)免疫試劑盒中，使所述重組小反芻獸疫病毒h-f融合蛋白的編碼基因在生物中進(jìn)行表達(dá)包括將所述重組小反芻獸疫病毒h-f融合蛋白的編碼基因?qū)胧荏w微生物，得到表達(dá)所述重組小反芻獸疫病毒h-f融合蛋白的重組微生物，培養(yǎng)所述重組微生物，表達(dá)得到所述重組小反芻獸疫病毒h-f融合蛋白。上述酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述受體微生物可為c1)-c4)中的任一種:c1)原核微生物；c2)革蘭氏陰性細(xì)菌；c3)埃希氏菌屬細(xì)菌；c4)大腸桿菌bl21(de3)。上述酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述重組小反芻獸疫病毒h-f融合蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)或2)所示的dna分子：1)編碼序列是seqidno.1第4-3558位所示的dna分子；2)與1)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼rmhf1-y的dna分子。其中，seqidno.1由3564個(gè)核苷酸組成，seqidno.1第4-3558位為rmhf1-y基因的核苷酸序列，seqidno.1第4-3558位所示的rmhf1-y基因編碼氨基酸序列是seqidno.2的蛋白質(zhì)rmhf1-y。上述酶聯(lián)免疫試劑盒中，2)具體可為核苷酸序列與1)具有至少91％、92％、95％、96％、98％或99％的同一性的dna分子。上述酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述重組微生物可為將pet30a-rmhf1-y導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)得到的表達(dá)氨基酸序列是seqidno.2的蛋白質(zhì)的重組微生物，所述重組微生物命名為bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y，所述pet30a-rmhf1-y是用seqidno.1所示的dna替換pet30a(+)的ndei和xhoi識(shí)別位點(diǎn)間的片段(包括ndei識(shí)別位點(diǎn)和xhoi識(shí)別位點(diǎn)在內(nèi)的小片段)，保持pet30a(+)的其它序列不變，得到的rmhf1-y基因重組表達(dá)載體。上述酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述表達(dá)為誘導(dǎo)表達(dá)，所述誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mm的iptg在16℃誘導(dǎo)13-16小時(shí)或13-24小時(shí)或13小時(shí)或16小時(shí)。所述重組小反芻獸疫病毒h-f融合蛋白在制備檢測(cè)檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒在制備小反芻獸疫診斷試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒在制備小反芻獸疫監(jiān)測(cè)試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒建立的間接elisa檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體的方法具有較高的特異性、敏感性和良好的精確度,且能快速、簡(jiǎn)便的操作,有利于臨床上對(duì)小反芻獸疫的監(jiān)測(cè)。采用本發(fā)明的以rmhf1-y作為包被抗原的檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒建立的間接elisa檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體的方法與法國(guó)id-vet的小反芻獸疫抗體檢測(cè)試劑盒符合率為94.5％，而以重組pprvh蛋白rmh作為包被抗原建立的間接elisa檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體的方法與法國(guó)id-vet的小反芻獸疫抗體檢測(cè)試劑盒的符合率只有83.3％，以重組pprvf蛋白rmf作為包被抗原建立的間接elisa檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體的方法與法國(guó)id-vet的小反芻獸疫抗體檢測(cè)試劑盒的符合率只有72.6％。說(shuō)明將rmhf1-y作為包被抗原建立的間接elisa檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體的方法與法國(guó)id-vet的小反芻獸疫抗體檢測(cè)試劑盒的符合率顯著高于以重組pprvh蛋白rmh作為包被抗原建立的間接elisa檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體的方法和以重組pprvf蛋白rmf作為包被抗原建立的間接elisa檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體的方法。將rmhf1-y作為包被抗原建立的間接elisa檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體的方法的敏感性顯著高于以重組pprvh蛋白rmh作為包被抗原建立的間接elisa檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體的方法和以重組pprvf蛋白rmf作為包被抗原建立的間接elisa檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體的方法。本發(fā)明的檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒不僅可用于小反芻獸疫的診斷,而且可評(píng)價(jià)疫苗免疫效果,此外,還可快速準(zhǔn)確的檢測(cè)小反芻獸疫,有利于臨床上對(duì)小反芻獸疫的監(jiān)測(cè)，從而為我國(guó)更好的控制小反芻獸疫的傳播將會(huì)產(chǎn)生積極作用。附圖說(shuō)明圖1為各菌株表達(dá)蛋白的sds-page電泳圖譜。圖中，m為marker，從上到下分別為180kda、150kda、130kda、92kda、62kda、43kda、26kda、10kda；1、誘導(dǎo)表達(dá)的受體菌全菌蛋白液體，2、誘導(dǎo)表達(dá)的bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y含蛋白上清液，3、誘導(dǎo)表達(dá)的bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y含蛋白沉淀，4、誘導(dǎo)表達(dá)的bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y的全菌蛋白液體，5、鎳柱純化后的上清可溶性蛋白，6、分子篩純化后的上清可溶性蛋白，7、誘導(dǎo)表達(dá)的bl21(de3)/pet30a-rmhf1-w全菌蛋白液體，8、誘導(dǎo)表達(dá)的bl21(de3)/pet30a-rmhf2-y全菌蛋白液體。圖2為重組蛋白rmhf1-y的分子篩純化鑒定與結(jié)構(gòu)鑒定。箭頭所指的為純化的目的蛋白峰。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。pet30a(+)為novagen公司產(chǎn)品。pet28a(+)為novagen公司產(chǎn)品。實(shí)施例1、可溶性表達(dá)rmhf11、合成基因本申請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)了3種小反芻獸疫病毒h和f蛋白融合基因，分別為seqidno.1第4-3558位所示的rmhf1-y基因、seqidno.3第1-3684位所示的rmhf2-y基因和seqidno.5第4-3558位所示的rmhf1-w基因。rmhf1-y基因和rmhf2-y基因在核苷酸序列上的區(qū)別僅在于5'端不同，seqidno.1第24-3564位和seqidno.3的第150-3690位核苷酸相同。rmhf1-y基因和rmhf1-w基因均編碼seqidno.2所示的蛋白質(zhì)rmhf1，rmhf2-y基因編碼seqidno.3所示的蛋白質(zhì)rmhf2。rmhf1和rmhf2在氨基酸序列上的區(qū)別僅在于氨基端不同，seqidno.2第8-1184位和seqidno.3第51-1227位氨基酸殘基相同。2、重組表達(dá)載體和重組菌的構(gòu)建用seqidno.1所示的dna替換pet30a(+)的ndei和xhoi識(shí)別位點(diǎn)間的片段(包括ndei識(shí)別位點(diǎn)和xhoi識(shí)別位點(diǎn)在內(nèi)的小片段)，保持pet30a(+)的其它序列不變，得到rmhf1-y基因重組表達(dá)載體，命名為pet30a-rmhf1-y。pet30a-rmhf1-y含有rmhf1-y基因，rmhf1-y基因的核苷酸序列是seqidno.1的第4-3558位核苷酸，rmhf1-y基因編碼seqidno.2所示的蛋白質(zhì)rmhf1。用seqidno.5所示的dna替換pet30a(+)的ndei和xhoi識(shí)別位點(diǎn)間的片段(包括ndei識(shí)別位點(diǎn)和xhoi識(shí)別位點(diǎn)在內(nèi)的小片段)，保持pet30a(+)的其它序列不變，得到rmhf1-w基因重組表達(dá)載體，命名為pet30a-rmhf1-w。pet30a-rmhf1-w含有rmhf1-w基因，rmhf1-w基因的核苷酸序列是seqidno.5的第4-3558位核苷酸，rmhf1-w基因編碼seqidno.2所示的蛋白質(zhì)rmhf1。用seqidno.3第145-3690位所示的dna替換pet30a(+)的bamhi和xhoi識(shí)別位點(diǎn)間的片段(包括bamhi識(shí)別位點(diǎn)和xhoi識(shí)別位點(diǎn)在內(nèi)的小片段)，保持pet30a(+)的其它序列不變，得到rmhf2-y基因重組表達(dá)載體，命名為pet30a-rmhf2-y。pet30a-rmhf2-y含有rmhf2-y基因，rmhf2-y基因的核苷酸序列是seqidno.3的第1-3684位核苷酸，rmhf2-y基因編碼seqidno.4所示的蛋白質(zhì)rmhf2。將pet30a-rmhf1-y、pet30a-rmhf1-w和pet30a-rmhf2-y分別單獨(dú)轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞。將其均勻涂布于含卡那霉素的lb平板上，37℃培養(yǎng)16小時(shí)。單菌落振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果表明含有pet30a-rmhf1-y的重組大腸桿菌命名為bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y，將測(cè)序結(jié)果表明含有pet30a-rmhf1-w的重組大腸桿菌命名為bl21(de3)/pet30a-rmhf1-w，將測(cè)序結(jié)果表明含有pet30a-rmhf2-y的重組大腸桿菌命名為bl21(de3)/pet30a-rmhf2-y。3、蛋白表達(dá)形式的分析與鑒定將bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y、bl21(de3)/pet30a-rmhf1-w、bl21(de3)/pet30a-rmhf2-y和大腸桿菌bl21(de3)(簡(jiǎn)稱受體菌)這四個(gè)菌株分別單獨(dú)接種于含50μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基(在lb液體培養(yǎng)基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養(yǎng)基)中，37℃，采用thermomaxq6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養(yǎng)至0d600值(以含50μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照)達(dá)到0.6時(shí)，加入異丙基硫代-β-d-半乳糖苷(iptg)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。上述四株菌的誘導(dǎo)表達(dá)均是用0.75mm的iptg在16℃誘導(dǎo)16小時(shí)(該誘導(dǎo)表達(dá)條件是經(jīng)過(guò)對(duì)溫度、時(shí)間、iptg濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化得到的高效可溶性誘導(dǎo)表達(dá)條件)。取誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)酵液用于蛋白表達(dá)形式分析。具體步驟為，取1ml發(fā)酵液置于1.5ml離心管中，做好標(biāo)記，4℃條件下8500rpm/min離心45min，棄掉上清液，收集菌體沉淀。加入1mlpbs重懸沉淀，8000rpm/min離心5min，棄掉上清液。向洗滌好的菌體沉淀中加入200μlpbs，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再粘稠，得到全菌蛋白液體。將全菌蛋白液體于4℃離心機(jī)中18000rpm/min離心45min，分別收集上清液(命名為含蛋白上清液)和沉淀(命名為含蛋白沉淀)，向含蛋白沉淀中加入50μlpbs重懸洗滌沉淀。向全菌蛋白液體、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中加入10μl5×sds-pageloadingbuffer，充分混勻后，置沸水浴中煮沸5min，待樣品冷卻后，用掌式離心機(jī)瞬離。取6μl用于sds-page電泳分析，并且結(jié)合蛋白灰度分析軟件初步分析蛋白含量。將電泳后的凝膠轉(zhuǎn)印于nc膜，以抗his標(biāo)簽的羊抗鼠抗體為結(jié)合抗體dab顯色，進(jìn)行western-blot鑒定。將上述全菌蛋白液體和含蛋白上清液用0.22μm濾膜過(guò)濾后上樣至預(yù)先用溶液1(溶質(zhì)及其濃度如下：20mmtris、150mmnacl，溶劑是水，ph8.0的溶液)平衡好的鎳柱。將鎳柱接入akta機(jī)器上，分別用10個(gè)柱體積的溶液1與10個(gè)柱體積的溶液2(溶質(zhì)及其濃度如下：20mmtris、150mmnacl、50mm咪唑，溶劑是水，ph8.0的溶液)清洗鎳柱中的雜質(zhì)蛋白，并在akta機(jī)器上監(jiān)測(cè)蛋白峰。用溶液3(溶質(zhì)及其濃度如下：20mmtris、150mmnacl、300mm咪唑，溶劑是水，ph8.0的溶液)沖洗掛在鎳柱上的目的蛋白，并使用akta收集出現(xiàn)目的蛋白峰的洗脫樣品，將該樣品稱為鎳柱純化目的蛋白樣品。將鎳柱純化的目的蛋白樣品用ge公司生產(chǎn)的superdex200凝膠柱通過(guò)分子篩進(jìn)一步純化。流動(dòng)相使用溶液1。通過(guò)分子篩純化后可以除去樣品中的含有的大量咪唑，收集洗脫峰，得到分子篩純化的目的蛋白樣品，使用nanodrop2000超微量分光光度計(jì)(nd2000)對(duì)得到的分子篩純化的目的蛋白樣品中蛋白(即可溶性目的蛋白)的含量進(jìn)行定量分析。并用nanodrop2000超微量分光光度計(jì)(nd2000)測(cè)定全菌蛋白液體中的蛋白質(zhì)含量，得到菌體總蛋白含量。將含蛋白沉淀用尿素溶解后，用nanodrop2000超微量分光光度計(jì)(nd2000)測(cè)定含蛋白沉淀中的蛋白質(zhì)的含量。結(jié)果表明誘導(dǎo)表達(dá)的bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y的全菌蛋白液體、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中均含有大小為131kda的目的蛋白rmhf1；誘導(dǎo)表達(dá)的bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y的全菌蛋白液體中的目的蛋白rmhf1占菌體總蛋白(全菌總蛋白)的45％，誘導(dǎo)表達(dá)的bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y的含蛋白上清液中的目的蛋白rmhf1占誘導(dǎo)表達(dá)的bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y的全菌蛋白液體中目的蛋白hf-his的63％，該63％的目的蛋白rmhf1為可溶性蛋白；誘導(dǎo)表達(dá)的bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y的含蛋白沉淀中的目的蛋白rmhf1占誘導(dǎo)表達(dá)的bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y的全菌蛋白液體中目的蛋白rmhf1的37％，該37％的目的蛋白rmhf1為不溶性包涵體蛋白；說(shuō)明誘導(dǎo)表達(dá)的bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y的目的蛋白rmhf1占菌體總蛋白的45％，bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y表達(dá)的目的蛋白rmhf1中63％為可溶性蛋白，37％為不溶性包涵體蛋白。誘導(dǎo)表達(dá)的bl21(de3)/pet30a-rmhf1-w的全菌蛋白液體中不含有大小為131kd的目的蛋白rmhf1，說(shuō)明bl21(de3)/pet30a-rmhf1-w沒(méi)有表達(dá)目的蛋白rmhf1。誘導(dǎo)表達(dá)的bl21(de3)/pet30a-rmhf2-y的全菌蛋白液體中不含有大小為131kd的目的蛋白rmhf2，說(shuō)明bl21(de3)/pet30a-rmhf2-y沒(méi)有表達(dá)目的蛋白rmhf2。誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌bl21(de3)的全菌蛋白液體不含有大小為131kd的目的蛋白rmhf1和大小為131kd的目的蛋白rmhf2；說(shuō)明大腸桿菌bl21(de3)沒(méi)有表達(dá)目的蛋白rmhf1和rmhf2(圖1)?？梢?jiàn)，雖然采用同一種表達(dá)載體pet30a(+)和同一種宿主菌大腸桿菌bl21(de3)，不同的外源目的基因的表達(dá)情況相差很大，將rmhf1-y基因通過(guò)pet30a(+)導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)可獲得rmhf1-y基因的高效可溶性表達(dá)，將rmhf1-w基因通過(guò)pet30a(+)導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)中，rmhf1-w基因卻沒(méi)有表達(dá)，將rmhf2-y基因通過(guò)pet30a(+)導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)中，rmhf2-y基因也沒(méi)有表達(dá)。另外，按照上述方法，將pet28a(+)的限制性內(nèi)切酶nhei和noti位點(diǎn)之間的序列替換為seqidno.1第4-3558位所示的rmhf1-y基因，保持pet28a(+)的其它序列不變，得到含有rmhf1-y基因的重組表達(dá)載體，將該重組表達(dá)載體命名為pet28a-rmhf1-y。將pet28a-rmhf1-y轉(zhuǎn)入大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞，將得到的重組大腸桿菌命名為bl21(de3)/pet28a-rmhf1-y。將bl21(de3)/pet28a-rmhf1-y接種于含50μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基(在lb液體培養(yǎng)基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養(yǎng)基)中，37℃，采用thermomaxq6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養(yǎng)至0d600值(以含50μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照)達(dá)到0.6時(shí)，加入異丙基硫代-β-d-半乳糖苷(iptg)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。該誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mm的iptg在16℃誘導(dǎo)16小時(shí)。取誘導(dǎo)表達(dá)的發(fā)酵液按照上述方法進(jìn)行蛋白表達(dá)形式分析。結(jié)果表明，誘導(dǎo)表達(dá)的bl21(de3)/pet28a-rmhf1-y全菌蛋白液體中沒(méi)有目的蛋白的表達(dá)。可見(jiàn)，雖然采用同一種外源目的基因(rmhf1-y基因)和同一種宿主菌大腸桿菌bl21(de3)，在不同的bl21(de3)表達(dá)載體-pet28a(+)和pet30a(+)中，外源目的基因的表達(dá)情況相差很大，將rmhf1-y基因通過(guò)pet30a(+)導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)可獲得rmhf1-y基因的高效可溶性表達(dá)，將rmhf1-y基因通過(guò)pet28a(+)導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)中，rmhf1-y基因卻沒(méi)有表達(dá)。4、rmhf1的可溶性表達(dá)及純化將bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y接種于含50μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基(在lb液體培養(yǎng)基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養(yǎng)基)中，37℃，采用thermomaxq6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養(yǎng)至0d600值(以含50μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照)達(dá)到0.6時(shí)，加入iptg進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。該誘導(dǎo)表達(dá)用0.75mm的iptg在16℃誘導(dǎo)16h。取iptg誘導(dǎo)表達(dá)16h后的發(fā)酵液收集菌體沉淀。加入pbs重懸沉淀，8000rpm/min離心5min，棄掉上清液。向洗滌好的菌體沉淀中加入pbs，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再粘稠，于4℃離心機(jī)中16000rpm/min離心30min，收集上清液(命名為含蛋白上清液)，棄沉淀。將含蛋白上清液用0.22μm濾膜過(guò)濾后上樣至預(yù)先用溶液1(溶質(zhì)及其濃度如下：20mmtris、150mmnacl，溶劑是水，ph8.0的溶液)平衡好的鎳柱。將鎳柱接入akta機(jī)器上，分別用10個(gè)柱體積的溶液1與10個(gè)柱體積的溶液2(溶質(zhì)及其濃度如下：20mmtris、150mmnacl、50mm咪唑，溶劑是水，ph8.0的溶液)清洗鎳柱中的雜質(zhì)蛋白，并在akta機(jī)器上監(jiān)測(cè)蛋白峰。用溶液3(溶質(zhì)及其濃度如下：20mmtris、150mmnacl、300mm咪唑，溶劑是水，ph8.0的溶液)沖洗鎳柱掛在鎳柱上的目的蛋白，并使用akta收集出現(xiàn)目的蛋白峰的洗脫樣品，將該樣品稱為鎳柱純化的rmhf1蛋白(鎳柱純化目的蛋白樣品)。將鎳柱純化的rmhf1蛋白用ge公司生產(chǎn)的superdex200凝膠柱通過(guò)分子篩進(jìn)一步純化，得到分子篩純化的rmhf1蛋白。該分子篩純化中的流動(dòng)相使用上述溶液1。通過(guò)分子篩純化后可以除去樣品中的含有的大量咪唑，rmhf1蛋白的結(jié)構(gòu)為單體結(jié)構(gòu)(圖2)。收集單體結(jié)構(gòu)的洗脫峰，得到分子篩純化的rmhf1蛋白(分子篩純化目的蛋白樣品)，使用nanodrop2000超微量分光光度計(jì)(nd2000)對(duì)得到的蛋白的純度進(jìn)行定量分析。將分子篩純化的rmhf1蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析其氨基酸序列，結(jié)果表明rmhf1的氨基酸序列如seqidno.2所示。實(shí)施例2、以rmhf1蛋白為包被抗原間接elisa方法檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體本實(shí)施例中的相關(guān)溶液如下：濃度為0.01m，ph值為7.4的pbs緩沖液的配制：8.5gnacl、0.2gkcl、2.9gna2hpo4·12h2o、0.59gnah2po4·2h2o，1l去離子水。包被緩沖液：0.05mol/l的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液(ph9.6)，溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下：na2co31.59g/l和nahco32.93g/l。洗滌液:0.5％吐溫洗滌液。0.5％吐溫洗滌液按照如下方法配制：在濃度為0.01m，ph值為7.4的pbs緩沖液中加入吐溫20和疊氮化鈉至疊氮化鈉的含量為5g/l、吐溫20的含量為5ml/l，得到0.5％吐溫洗滌液。封閉液：1％bsa封閉液。1％bsa封閉液按照如下方法配制：在濃度為0.01m，ph值為7.4的pbs緩沖液中加10％的bsa溶液，稀釋至1％(體積百分含量)，得到1％bsa封閉液。二抗稀釋液：在濃度為0.01m，ph值為7.4的pbs緩沖液中加入bsa至bsa的含量為1％(體積百分含量)，得到二抗稀釋液。1、間接elisa反應(yīng)條件的建立與優(yōu)化采用棋盤方陣滴定法確定實(shí)施例1中分子篩純化的rmhf1蛋白(以下簡(jiǎn)稱rmhf1蛋白)最適包被濃度和最佳血清稀釋度，以不同濃度的bsa封閉酶標(biāo)板確定最佳封閉液濃度，確定血清和酶標(biāo)二抗最佳工作時(shí)間，優(yōu)化酶標(biāo)二抗工作濃度，判定標(biāo)準(zhǔn)為：陽(yáng)性血清與陰性血清的od450比值(p/n)最大的孔所對(duì)應(yīng)的反應(yīng)條件為elisa方法的最佳反應(yīng)條件。將實(shí)施例1中分子篩純化的rmhf1蛋白梯度稀釋后包被酶標(biāo)板，采用棋盤方陣滴定法確定rmhf1蛋白的包被量和血清稀釋度；并在抗原最佳包被濃度和血清稀釋度基礎(chǔ)上優(yōu)化elisa檢測(cè)條件。結(jié)果如表1所示，rmhf1蛋白的質(zhì)量濃度為1.0μg/ml，待測(cè)血清稀釋倍數(shù)為1:20時(shí)，p/n值最大，因此確定抗原(rmhf1蛋白)的最佳包被濃度為1.0μg/ml，待測(cè)血清稀釋倍數(shù)為1:20。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)確定hrp標(biāo)記的兔抗山羊igg按1:20000的比例稀釋，37℃作用0.5h，加入tmb顯色液10min后od值最佳。表1、elisa檢測(cè)方法的反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果包被的抗原封閉條件待測(cè)血清二抗igg-hrp優(yōu)化稀釋度1.0μg/ml1％bsa1:201:20000反應(yīng)條件4℃/16h37℃/2h37℃/1h37℃/0.5h該步驟確定的以rmhf1蛋白為包被抗原間接elisa方法檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法(以下簡(jiǎn)稱重組rmhf1優(yōu)化間接elisa方法)如下：1.1包被：用包被緩沖液稀釋實(shí)施例1中分子篩純化的rmhf1蛋白(以下簡(jiǎn)稱rmhf1蛋白)至rmhf1蛋白的濃度為1.0μg/ml，得到包被原溶液，用該包被原溶液包被實(shí)驗(yàn)孔，100μl/孔加至酶標(biāo)板，4℃孵育16h。1.2洗滌：傾去孔內(nèi)包被原溶液，用0.5％吐溫洗滌液洗滌5次，每次3min；拍干。1.3封閉：加入1％bsa封閉液，100ul/孔，37℃孵育2h。1.4加樣：1.4.1樣品孔用包被緩沖液將pprv陽(yáng)性血清稀釋20倍，得到待測(cè)血清。將100μl待測(cè)血清加到酶標(biāo)板上，37℃反應(yīng)1h，傾去孔內(nèi)液體，然后用洗滌液洗滌5次，每次3min。其中，陽(yáng)性血清為法國(guó)id-vet的小反芻獸疫抗體檢測(cè)試劑盒(idpprcompetition小反芻獸疫抗體檢測(cè)試劑盒，產(chǎn)品編號(hào)為pprc-4p)檢測(cè)為pprv抗體陽(yáng)性的羊血清。1.4.2空白對(duì)照孔與1.4.1的區(qū)別僅在于將待測(cè)血清替換為等體積的高純水，其它步驟不變。1.5加酶標(biāo)二抗：加入用二抗稀釋液進(jìn)行1:20000稀釋的hrp標(biāo)記兔抗山羊igg，100ul/孔，37℃30min。1.6顯色：加入tmb，100ul/孔，反應(yīng)10min。1.7終止：加入0.2mol/lh2so4溶液終止反應(yīng)，100ul/孔。1.8測(cè)定：用酶標(biāo)儀讀取各孔o(hù)d450nm數(shù)值。2、elisa陰陽(yáng)性臨界值的確定將中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心草食動(dòng)物與人畜共患病室保存的1000份經(jīng)法國(guó)id-vet的小反芻獸疫抗體檢測(cè)試劑盒(idpprcompetition小反芻獸疫抗體檢測(cè)試劑盒，產(chǎn)品編號(hào)為pprc-4p)檢測(cè)為pprv陰性的羊血清采用步驟1的重組rmhf1優(yōu)化間接elisa方法(將1.4.1中的pprv陽(yáng)性血清分別替換為該1000份pprv陰性血清，其它操作相同)進(jìn)行間接elisa檢測(cè)，計(jì)算該1000份pprv陰性血清的平均值(x)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(sd)。判為陽(yáng)性；判為陰性。結(jié)果表明，該1000份pprv陰性血清平均值為0.162，sd為0.053，因此陰陽(yáng)性臨界值為0.321。3、特異性試驗(yàn)利用步驟1的重組rmhf1優(yōu)化間接elisa方法對(duì)10份羊副結(jié)核病、羊布病、結(jié)核病、產(chǎn)氣莢膜梭菌病和口蹄疫陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，觀察與其它疾病有無(wú)交叉反應(yīng)。其中，將1.4.1中的pprv陽(yáng)性血清分別替換為上述血清，其它操作相同。結(jié)果表明該重組rmhf1優(yōu)化間接elisa方法對(duì)幾種羊源的病原(羊副結(jié)核病、羊布病、結(jié)核病、產(chǎn)氣莢膜梭菌病和口蹄疫陽(yáng)性血清)陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，其od450值分別為：0.169、0.171、0.122、0.194、0.226，均小于臨界值0.321，表明rmhf1蛋白與羊副結(jié)核病、羊布病、結(jié)核病、產(chǎn)氣莢膜梭菌病和口蹄疫陽(yáng)性血清均無(wú)交叉反應(yīng)，步驟1的重組rmhf1優(yōu)化間接elisa方法具有良好的特異性。4、敏感性試驗(yàn)將步驟1的優(yōu)化間接elisa方法中的rmhf1替換為重組h蛋白rmh，其它操作不變，建立重組h蛋白rmh優(yōu)化間接elisa方法。將步驟1的優(yōu)化間接elisa方法中的rmhf1替換為重組f蛋白rmf，其它操作不變，建立重組f蛋白rmf優(yōu)化間接elisa方法。其中，上述重組h蛋白rmh按照實(shí)施例1步驟4中rmhf1的可溶性表達(dá)及純化方法制備，區(qū)別僅在于將進(jìn)行可溶性誘導(dǎo)表達(dá)的重組大腸桿菌由重組大腸桿菌bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y替換為重組大腸桿菌bl21(de3)/pet30a-rmh-y。重組大腸桿菌bl21(de3)/pet30a-rmh-y是將pet30a-rmh-y導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)得到的重組菌。pet30a-rmh-y是用rmh-y替換pet30a(+)的ndei和xhoi識(shí)別位點(diǎn)間的片段(包括ndei識(shí)別位點(diǎn)和xhoi識(shí)別位點(diǎn)在內(nèi)的小片段)，保持pet30a(+)的其它序列不變，得到的rmh-y基因重組表達(dá)載體，命名為pet30a-rmh-y。pet30a-rmh-y含有rmh-y基因，rmh-y基因是將seqidno.1第1852-3555位核苷酸缺失，其它核苷酸不變得到的dna，rmh-y基因編碼蛋白質(zhì)rmh。rmh是將seqidno.3的第617-1184位氨基酸殘基缺失其它氨基酸殘基不變得到的蛋白質(zhì)。上述重組f蛋白rmf按照實(shí)施例1步驟4中rmhf1的可溶性表達(dá)及純化方法制備，區(qū)別僅在于將進(jìn)行可溶性誘導(dǎo)表達(dá)的重組大腸桿菌由重組大腸桿菌bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y替換為重組大腸桿菌bl21(de3)/pet30a-rmf-y。重組大腸桿菌bl21(de3)/pet30a-rmf-y是將pet30a-rmf-y導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)得到的重組菌。pet30a-rmf-y是用rmf-y替換pet30a(+)的ndei和xhoi識(shí)別位點(diǎn)間的片段(包括ndei識(shí)別位點(diǎn)和xhoi識(shí)別位點(diǎn)在內(nèi)的小片段)，保持pet30a(+)的其它序列不變，得到的rmf-y基因重組表達(dá)載體，命名為pet30a-rmf-y。pet30a-rmf-y含有rmf-y基因，rmf-y基因是將seqidno.1第25-1896位核苷酸缺失，其它核苷酸不變得到的dna，rmf-y基因編碼蛋白質(zhì)rmf。rmf是將seqidno.3的第8-631位氨基酸殘基缺失其它氨基酸殘基不變得到的蛋白質(zhì)。將經(jīng)法國(guó)id-vet的小反芻獸疫抗體檢測(cè)試劑盒(idpprcompetition小反芻獸疫抗體檢測(cè)試劑盒，產(chǎn)品編號(hào)為pprc-4p)檢測(cè)為pprv陽(yáng)性的羊血清進(jìn)行倍比稀釋，采用步驟1的重組rmhf1優(yōu)化間接elisa方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用重組h蛋白rmh優(yōu)化間接elisa方法、重組f蛋白rmf優(yōu)化間接elisa方法和該法國(guó)id-vet的小反芻獸疫抗體檢測(cè)試劑盒作對(duì)比，得出陽(yáng)性臨界值時(shí)的最大稀釋度。結(jié)果表明將pprv陽(yáng)性的羊血清從1：25開(kāi)始進(jìn)行倍比稀釋，采用步驟1的重組rmhf1優(yōu)化間接elisa方法進(jìn)行檢測(cè)，pprv陽(yáng)性的羊血清的稀釋度為1∶1600時(shí)仍呈陽(yáng)性；采用重組h蛋白rmh優(yōu)化間接elisa方法進(jìn)行檢測(cè)，pprv陽(yáng)性的羊血清的最大稀釋度為1:800；采用重組f蛋白rmf優(yōu)化間接elisa方法進(jìn)行檢測(cè)，pprv陽(yáng)性的羊血清的最大稀釋度為1:800；表明步驟1的重組rmhf1優(yōu)化間接elisa方法敏感性較好，明顯高于重組h蛋白rmh和重組f蛋白rmf作為包被抗原時(shí)檢測(cè)方法的敏感性。5、重復(fù)性試驗(yàn)采用步驟1的重組rmhf1優(yōu)化間接elisa方法對(duì)6份羊血清在同批次板和不同批次板上分別進(jìn)行檢測(cè)，平行測(cè)定5次，計(jì)算批內(nèi)、批間變異系數(shù)(cv)。結(jié)果顯示，批內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)在2％～8％之間，批間重復(fù)變異系數(shù)小于9％(表2)。結(jié)果表明，步驟1的重組rmhf1優(yōu)化間接elisa方法具有良好的重復(fù)性。表2步驟1的重組rmhf1優(yōu)化間接elisa方法重復(fù)性試驗(yàn)6、符合性試驗(yàn)采用步驟1的重組rmhf1優(yōu)化間接elisa方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用步驟4的重組h蛋白rmh優(yōu)化間接elisa方法、步驟4的重組f蛋白rmf優(yōu)化間接elisa方法和法國(guó)id-vet的小反芻獸疫抗體檢測(cè)試劑盒(idpprcompetition小反芻獸疫抗體檢測(cè)試劑盒，產(chǎn)品編號(hào)為pprc-4p)對(duì)中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心草食動(dòng)物與人畜共患病室保存的500份羊血清進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算前三者與法國(guó)id-vet的小反芻獸疫抗體檢測(cè)試劑盒的符合率。結(jié)果表明采用步驟1的重組rmhf1優(yōu)化間接elisa方法檢測(cè)該500份羊血清的陽(yáng)性率為44.19％；法國(guó)id-vet的小反芻獸疫抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性率為42.25％，步驟1的重組rmhf1優(yōu)化間接elisa方法與法國(guó)id-vet的小反芻獸疫抗體檢測(cè)試劑盒符合率為94.5％。而步驟4的重組h蛋白rmh優(yōu)化間接elisa方法與法國(guó)id-vet的小反芻獸疫抗體檢測(cè)試劑盒的符合率只有83.3％，步驟4的重組f蛋白rmf優(yōu)化間接elisa方法與法國(guó)id-vet的小反芻獸疫抗體檢測(cè)試劑盒的符合率只有72.6％。說(shuō)明將rmhf1-y作為包被抗原建立的間接elisa檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體的方法與法國(guó)id-vet的小反芻獸疫抗體檢測(cè)試劑盒的符合率顯著高于以重組pprvh蛋白rmh作為包被抗原建立的間接elisa檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體的方法和以重組pprvf蛋白rmf作為包被抗原建立的間接elisa檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體的方法。<110>中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>3564<212>dna<213>人工序列<220><221>cds<222>(4)..(3558)<223><400>1catatgcaccatcaccaccatcacatgagcgcacaacgcgaacgcatcaacgcgttctac60aaagacaacctgcacaacaaaacccatcgcgttatcctggatcgcgaacgtctgaccatt120gaacgtccgtatatcctgctgggggttctgctggttatgtttctgagcctgatcggtctg180ctggcaattgctggtattcgtctgcatcgcgcaaccgttggtaccgcagaaattcaaagc240cgtctgaacaccaacatcgaactgaccgaaagcatcgaccatcagaccaaagacgttctg300accccgctgtttaaaatcatcggcgacgaagtcggcattcgtattccgcagaaattcagc360gacctggtcaaattcatcagcgacaaaatcaaattcctgaacccggaccgcgaatacgat420tttcgcgatctgcgttggtgtatgaatccgccggaacgcgtcaaaatcaacttcgaccag480ttctgcgaatacaaagcggcggttaaaagcgtcgaacacatcttcgaaagcagcctgaac540cgttctgaacgtctgcgtctgctgaccctgggtccgggtaccggttgtctgggtcgtacc600gttacccgtgcacaatttagcgaactgaccctgaccctgatggatctggacctggagatg660aaacataacgtcagcagcgtctttaccgttgtggaagaaggtctgtttggccgtacctat720accgtttggcgttctgataccggtaaaccgagtaccagtccgggtattggtcattttctg780cgcgtcttcgaaattggtctggttcgcgatctggaactgggcgctccgatttttcacatg840accaactacctgaccgtcaacatgagcgacgattaccgttcttgtctgctggcagttggc900gaactgaaactgaccgcactgtgtaccccgtctgaaaccgttaccctgtctgaatctggc960gttccgaaacgcgaaccgctggttgtcgttattctgaatctggcaggtccgaccctgggc1020ggcgaactgtattctgttctgccgaccaccgatccgaccgttgaaaaactgtatctgagc1080agccatcgcggtatcatcaaagacaacgaagcgaattgggttgttccgtctaccgacgtt1140cgtgatctgcaaaacaaaggcgagtgcctggttgaagcttgtaaaacccgtccgccgagc1200ttttgtaacggtaccggtattggtccgtggtctgaaggtcgtattccggcttacggcgtt1260attcgcgtttctctggatctggcatctgatccgggcgtagttattaccagcgtttttggt1320ccgctgattccgcatctgtctggcatggacctgtataataatccgtttagccgcgcggct1380tggctggcagttccgccgtacgaacagtcttttctgggcatgatcaacaccattggtttt1440ccggatcgcgctgaagttatgccgcatattctgaccaccgaaattcgcggtccgcgcggt1500cgttgtcatgttccgattgaactgagcagccgtatcgacgacgacatcaaaatcggcagc1560aacatggttgtcctgccgaccaaagatctgcgttatatcaccgcgacctacgacgtttct1620cgtagcgaacacgcgatcgtctactacatctacgataccggccgtagcagcagctatttt1680tacccggttcgtctgaactttcgcggtaatccgctgtctctgcgtattgagtgctttccg1740tggtaccacaaagtctggtgttaccacgactgcctgatctacaacaccatcaccaacgaa1800gaagtgcatacccgcggtctgaccggtattgaagtcacctgcaacccggttggtggcggt1860ggaatcggaggtggtggaagcggaggaggtggaagcatgcaccatcaccaccatcacatg1920acccgcgttgcgaccctggtctttctgtttctgttcccgaacaccgttacctgtcagatt1980cattggggcaacctgagcaaaatcggcattgttggtaccggtagcgcttcctacaaagtt2040atgacccgtccgagtcatcagaccctggttatcaaactgatgccgaacatcaccgcgatt2100gataactgcaccaaaagcgagatcagcgagtacaaacgtctgctgatcaccgttctgaaa2160ccggttgaagacgcactgagcgtcatcaccaaaaacgtccgtccgattcaaaccctgacc2220ccgggtcgtcgtacccgtcgttttgtaggcgctgttctggcaggtgttgcactgggcgtt2280gcaaccgcagcacaaattaccgcaggcgttgcactgcatcagtctctgatgaacagccag2340gcgattgaaagcctgaaaaccagcctggagaaaagcaaccaggcaattgaagaaatccgt2400ctggcgaacaaagaaaccatcctggcagttcagggcgtccaggattacatcaacaacgag2460ctggtcccgtctgttcatcgtatgagctgcgaactggtcggtcataaactgagcctgaaa2520ctgctgcgctactacaccgagatcctgagcatctttggtccgagtctgcgcgatccgatt2580gcagcggaaattagcattcaggcgctgagttacgcgctgggcggcgatattaacaaaatc2640ctggacaaactgggctattctggcg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