本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
中，一種檢測(cè)雙氫青蒿素的方法及所用半抗原、抗原、抗血清和抗體。
背景技術(shù)：
：青蒿素衍生物如青蒿琥酯、蒿甲醚、雙氫青蒿素等對(duì)治療腦型瘧疾和抗氯喹惡性瘧疾具有高效、低毒、速效、復(fù)燃率低等顯著療效。雙氫青蒿素(dihydroartemisinin，dha)是東南亞、非洲應(yīng)用較大的抗瘧疾藥物。假冒、劣質(zhì)以及不符合標(biāo)準(zhǔn)的青蒿素藥物對(duì)瘧疾病情的防控造成了重大威脅，而這種偽劣假冒現(xiàn)象在東南亞、非洲等落后地區(qū)尤為突出。因此急需建立一種快捷、可靠的針對(duì)青蒿素及其衍生物的定性定量分析方法。雙氫青蒿素的化學(xué)名為(3r,5as,6r,8as,9r,12s,12ar)-八氫-3,6,9-三甲基-3,12-橋氧-12h-吡喃并[4,3-j]-1,2-苯并二氧七環(huán)-10(3h)-醇，cas登記號(hào)為81496-81-3；71939-50-9；123930-80-3，分子式為c15h24o5，相對(duì)分子量為284.34806，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見式(ⅰ)。目前國內(nèi)外已發(fā)表的文獻(xiàn)中，雙氫青蒿素檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法(hplc)、液相色譜-質(zhì)譜法(lc-ms)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(lc-ms/ms)。這些方法都需要昂貴的儀器設(shè)備，檢測(cè)費(fèi)用高，操作時(shí)間長(zhǎng)，操作技術(shù)要求高且不能用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。另外，前人也曾制作出雙氫青蒿素相應(yīng)抗體，但起靈敏度一般在100-500ng/ml同時(shí)對(duì)青蒿素其他衍生物如青蒿琥酯有較高的較差反應(yīng)率，不能做到特異性檢測(cè)雙氫青蒿素。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)雙氫青蒿素的方法及所用半抗原、抗原、抗血清和抗體。本發(fā)明首先提供了雙氫青蒿素的檢測(cè)方法，所述方法包括利用抗血清或抗體實(shí)現(xiàn)雙氫青蒿素的檢測(cè)；所述抗血清和所述抗體分別為利用式(ⅱ)所示化合物與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原制備得到的抗血清和抗體；上述方法中，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白或卵清白蛋白。上述方法中，式(ⅱ)所示化合物與載體蛋白通過酰胺鍵連接。所述酰胺鍵是式(ⅱ)所示化合物的羧基通過活潑酯與載體蛋白上的氨基形成的。所述偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)式見式(ⅲ)。所述偶聯(lián)物的制備方法包括：在nhs和edc的作用下促使式(ⅱ)所示化合物與載體蛋白偶聯(lián)。制備所述偶聯(lián)物時(shí)，式(ⅱ)所示化合物、nhs和edc的摩爾比可為1：(1-5)：(1-5)。制備所述偶聯(lián)物時(shí)，所述反應(yīng)的條件可為：0-50℃反應(yīng)4-36小時(shí)。制備所述偶聯(lián)物時(shí)，式(ⅱ)所示化合物與所述載體蛋白的摩爾比可為(5-30)：1；具體可為(15-17)：1，更具體可為15：1。所述偶聯(lián)物的制備方法具體如下：將0.036mmol式(ⅱ)所示化合物、0.047mmolnhs和0.040mmoledc，用有機(jī)溶劑(如dmso)溶解，25℃攪拌反應(yīng)6小時(shí)，然后滴加入含0.0024mmol載體蛋白的載體蛋白溶液(載體蛋白溶液具體是將0.0024mmolova溶于5mlph7.5、0.1m的pbs緩沖液得到的)，4℃攪拌12小時(shí)。所述偶聯(lián)物的制備方法包括如下步驟：在nhs和edc的作用下促使式(ⅱ)所示化合物與載體蛋白偶聯(lián)。制備所述偶聯(lián)物時(shí)，式(ⅱ)所示化合物、nhs和edc的摩爾比可為1：(1-5)：(1-5)。制備所述偶聯(lián)物時(shí)，所述反應(yīng)的條件可為：0-50℃反應(yīng)4-36小時(shí)。制備所述偶聯(lián)物時(shí)，式(ⅱ)所示化合物與所述載體蛋白的摩爾比可為(5-30)：1；具體可為(15-17)：1，更具體可為15：1。所述偶聯(lián)物的制備方法具體如下：將0.04mmol式(ⅱ)所示化合物、0.052mmolnhs和0.044mmoledc，用有機(jī)溶劑(如dmso)溶解，25℃攪拌反應(yīng)6小時(shí)，離心(離心參數(shù)具體可為：8000rpm離心5分鐘)收集上清液，然后滴加入含0.0024mmol載體蛋白的載體蛋白溶液(載體蛋白溶液具體是將0.0024mmolova溶于5mlph7.5、0.1m的pbs緩沖液得到的)，4℃攪拌12小時(shí)。上述方法中，所述抗血清和所述抗體分別可為利用所述偶聯(lián)物免疫動(dòng)物得到的抗血清和抗體。所述動(dòng)物具體可為哺乳動(dòng)物，如小鼠。上述方法中，所述雙氫青蒿素的檢測(cè)方法可采用酶聯(lián)免疫吸附方法(elisa)進(jìn)行。本發(fā)明還提供了下述p1)-p4)中任一所述產(chǎn)品：p1)式(ⅱ)所示化合物；p2)所述偶聯(lián)物；p3)所述抗血清；p4)所述抗體。本發(fā)明還提供了(ⅱ)所示化合物的制備方法，所述方法包括：將式(ⅶ)所示化合物和硼氫化鉀反應(yīng)，獲得(ⅱ)所示化合物；制備式(ⅱ)所示化合物時(shí)，所述反應(yīng)的條件可為：0-6℃反應(yīng)。式(ⅱ)所示化合物的制備方法具體如下：在三口燒瓶中加入4.15mmol式(ⅶ)所示化合物和12.9ml無水甲醇，于室溫下邊攪拌邊加入1.41mmol無水氯化鈣作為催化劑，于0℃-5℃溫度條件下分三批次加入5.02mmol硼氫化鉀，反應(yīng)進(jìn)行情況由tlc薄層層析進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，反應(yīng)結(jié)束后使用32％(w/w)鹽酸水溶液終止，蒸餾水洗滌減壓脫溶后得白色粉末，即為產(chǎn)物。即為式(ⅱ)所示化合物。本發(fā)明還提供了所述偶聯(lián)物在制備抗血清或抗體中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了式(ⅱ)所示化合物在作為半抗原中的應(yīng)用；本發(fā)明還提供了所述偶聯(lián)物在作為免疫原中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了下述任一應(yīng)用：x1、所述產(chǎn)品在檢測(cè)雙氫青蒿素中的應(yīng)用；x2、所述產(chǎn)品在制備用于檢測(cè)雙氫青蒿素的試劑盒中的應(yīng)用；x3、所述產(chǎn)品在制備用于檢測(cè)雙氫青蒿素的免疫親和色譜柱中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，所述試劑盒可為酶聯(lián)免疫吸附試劑盒。待檢樣本可為水體、藥品、食品或土壤。本發(fā)明提供了一種化合物，即式(ⅱ)所示化合物，該化合物可以作為半抗原，該半抗原與載體蛋白偶聯(lián)后可以得到抗原，用抗原免疫動(dòng)物，可以得到特異性針對(duì)雙氫青蒿素抗原的抗體，且靈敏度高，雙氫青蒿素檢測(cè)ic50值可達(dá)1.16ng/ml。本發(fā)明還提供了所述化合物的制備方法，步驟簡(jiǎn)潔、成本低廉。用本發(fā)明方法制備的抗體的特異性好(與雙氫青蒿素結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率低)、靈敏度高。本發(fā)明可用于雙氫青蒿素藥物的大規(guī)模檢測(cè)與質(zhì)量控制，在雙氫青蒿素的快速免疫檢測(cè)應(yīng)用中將有廣闊的前景。附圖說明圖1為制備式(ⅱ)所示化合物的流程示意圖。圖2為制備偶聯(lián)物的流程示意圖。圖3為雙氫青蒿素直接elisa法標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑、儀器等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。硼氫化鉀、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc)、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、牛血清白蛋白(bsa，分子量68kda)和卵清白蛋白(ova，分子量為44kda)均為sigma公司產(chǎn)品。羊抗小鼠igg-hrp為jackson公司產(chǎn)品。鄰苯二胺(opd)、氨基乙酸、氨基丙酸等其余常規(guī)試劑均為北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品。雙氫青蒿素：阿拉丁試劑(上海)有限公司，貨號(hào)為71963-77-4。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見式(ⅴ)。n-羥基琥珀酰亞胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見式(ⅵ)。ph7.5、0.1m的pbs緩沖液的制備方法：稱量4.0gnacl、0.1gkh2po4、1.48gna2hpo4·12h2o，用蒸餾水定容至500ml。實(shí)施例1、半抗原的制備一、化合物的制備1、式(ⅶ)所示化合物的制備式(ⅶ)所示化合物的制備方法如下：材料：雅致小克銀漢霉(cunninghamellaelegans，atcc9245，美國菌種保藏中心)、pda培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，硅膠柱(青島海洋化工有限公司)。將雅致小克銀漢霉(atcc9245)接種于pda培養(yǎng)基中28℃160rpm培養(yǎng)3天后，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(20g葡萄糖，15g蔗糖，10g蛋白胨，1l蒸餾水)中，28℃160rpm培養(yǎng)。1天后加入青蒿素使其濃度為1mg/ml，同樣條件下連續(xù)培養(yǎng)14天，得到發(fā)酵液。將發(fā)酵液離心，棄菌體沉淀，收集上清液，將上清液用乙酸乙酯萃取三次，每次均取乙酸乙酯相，最后一次萃取后，向乙酸乙酯相中加入無水硫酸鈉除水，靜置24h以上。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀與35℃下蒸干，得到乙酸乙酯萃取物。將乙酸乙酯萃取物用硅膠柱分離純化，所用硅膠柱的規(guī)格為內(nèi)徑19mm外徑24mm、100-200目，所用洗脫劑為石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯(石油醚與乙酸乙酯的體積比為5:2)，收集洗脫液。通過薄層層析硅膠板檢測(cè)所得物質(zhì)，用1％香草醛溶液(該溶液由香草醛和濃硫酸組成，二者的配比為0.1g：10ml)作為顯色液，展開劑成分配比與洗脫劑相同。同時(shí)對(duì)原材料青蒿素及收集到的洗脫液進(jìn)行展開，條帶位置不同即表明青蒿素已被轉(zhuǎn)化為目的化合物。將0.9mmol所得目的化合物和25ml有機(jī)溶劑(二氯甲烷)室溫混合后邊攪拌邊加入2mmol丁二酸酐，冰浴冷卻后于0℃-5℃溫度條件下加入0.9mmol4-二甲氨基吡啶并冰浴反應(yīng)30min，然后自然升至室溫并反應(yīng)1h，加入等體積的水，用鹽酸調(diào)ph至3，分液后取有機(jī)相，用水洗滌后用無水mgso4干燥,減壓脫溶后得白色粉末，即為式(ⅶ)所示化合物。2、式(ⅱ)所示化合物的制備合成路線圖如圖1所示。在三口燒瓶中加入4.15mmol式(ⅶ)所示化合物和12.9ml無水甲醇，于室溫下邊攪拌邊加入1.41mmol無水氯化鈣作為催化劑，于0℃-5℃溫度條件下分三批次加入5.02mmol硼氫化鉀，待反應(yīng)10min無氣泡產(chǎn)生時(shí)，取樣進(jìn)行tlc薄層層析(展開劑為乙酸乙酯和石油醚的混合物；結(jié)果表明，式(ⅶ)所示化合物都生成了目標(biāo)產(chǎn)物)；當(dāng)溫度變化為-2至+8攝氏度時(shí)，30min內(nèi)使用0.4ml32％(w/w)鹽酸水溶液調(diào)ph至7-8，用10ml水洗滌(每次加入3ml水，洗滌三次),減壓脫溶后得白色粉末，即為產(chǎn)物。二、化合物的表征質(zhì)譜檢測(cè)步驟一得到的產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，結(jié)果如表1所示，步驟一得到的產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)式如式(ⅱ)所示。表1、質(zhì)譜結(jié)果sampleno.formula(m)ionformulameasuredm/zcalcm/zqhs-h1c19h28o9c19h28nao9423.1624423.1626實(shí)施例2、抗原的制備一、雙氫青蒿素-卵清白蛋白的偶聯(lián)物的制備1、取0.036mmol式(ⅱ)所示化合物、0.047mmolnhs和0.040mmoledc，用1mldmso溶解，25℃攪拌反應(yīng)6小時(shí)，得到式(ⅷ)所示化合物。2、取完成步驟1的整個(gè)反應(yīng)液(按照所有式(ⅱ)所示化合物都生成了式(ⅷ)所示化合物計(jì)，反應(yīng)液中含有0.036mmol式(ⅷ)所示化合物)，緩慢滴加入載體蛋白溶液中(載體蛋白溶液是將0.0024mmolova溶于5mlph7.5、0.1m的pbs緩沖液得到的)，4℃攪拌12小時(shí)。3、取完成步驟2的整個(gè)反應(yīng)液(按照所有載體蛋白均與式(ⅷ)所示化合物偶聯(lián)計(jì))，用ph7.5、0.1m的pbs緩沖液透析三天(透析的作用在于去除未反應(yīng)的雙氫青蒿素半抗原或其它小分子)，然后用ph7.5、0.1m的pbs緩沖液稀釋得到雙氫青蒿素-卵清白蛋白溶液(以ova計(jì)，濃度為1mg/ml)，-40℃凍存待用。雙氫青蒿素-卵清白蛋白又稱雙氫青蒿素-ova。二、雙氫青蒿素-牛血清白蛋白的偶聯(lián)物的制備1、同步驟一的1。2、取完成步驟1的整個(gè)反應(yīng)液(按照所有式(ⅱ)所示化合物都生成了式(ⅷ)所示化合物計(jì)，反應(yīng)液中含有0.036mmol式(ⅷ)所示化合物)，緩慢滴加入載體蛋白溶液中(載體蛋白溶液是將0.0024mmolbsa溶于10mlph7.5、0.1m的pbs緩沖液得到的)，4℃攪拌12小時(shí)。3、取完成步驟2的整個(gè)反應(yīng)液(按照所有載體蛋白均與式(ⅷ)所示化合物偶聯(lián)計(jì))，用ph7.5、0.1m的pbs緩沖液透析三天(透析的作用在于去除未反應(yīng)的雙氫青蒿素半抗原或其它小分子)，然后用ph7.5、0.1m的pbs緩沖液稀釋得到雙氫青蒿素-牛血清白蛋白溶液(以bsa計(jì)，濃度為1mg/ml)，-40℃凍存待用。雙氫青蒿素-牛血清白蛋白又稱雙氫青蒿素-bsa。實(shí)施例3、抗體的制備及其在檢測(cè)雙氫青蒿素中的應(yīng)用一、利用雙氫青蒿素-bsa作為抗原制備抗體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為8-10周齡的balb/c小鼠(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重23-25g。1、基礎(chǔ)免疫將實(shí)施例2的步驟二制備的雙氫青蒿素-bsa溶液(以bsa計(jì)，濃度為1mg/ml)用無菌過濾器過濾后與等體積弗氏完全佐劑混合，用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?，直到滴入水中不擴(kuò)散，得到乳化好的完全抗原。取乳化好的完全抗原，腹腔及背部皮下多點(diǎn)注射balb/c小鼠，每只小鼠的注射劑量為0.1mg(以bsa計(jì))。2、加強(qiáng)免疫將實(shí)施例2的步驟二制備的雙氫青蒿素-bsa溶液(以bsa計(jì)，濃度為1mg/ml)用無菌過濾器過濾后與等體積弗氏不完全佐劑混合，用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?，直到滴入水中不擴(kuò)散，得到乳化好的不完全抗原?；A(chǔ)免疫2周后，取乳化好的不完全抗原，腹腔及背部皮下多點(diǎn)注射balb/c小鼠，每只小鼠的注射劑量為0.1mg(以bsa計(jì))，之后每隔15天按相同的方法加強(qiáng)免疫一次。從第三次加強(qiáng)免疫開始，每次免疫后第3-5天，從小鼠眼眶采血，測(cè)定抗體效價(jià)。測(cè)定抗體效價(jià)時(shí)，采用實(shí)施例2中制備的1mg/ml雙氫青蒿素-ova溶液(以ova計(jì)，濃度為1mg/ml)的500倍稀釋液(用ph7.5、0.1m的pbs緩沖液進(jìn)行稀釋)作為包被原。待效價(jià)大于1：8000后(效價(jià)定義為零孔顯色值為1時(shí)，血清的稀釋倍數(shù)；第三次加強(qiáng)免疫后已經(jīng)達(dá)到了該效價(jià))，眼球摘除采血，血液室溫靜置1小時(shí)，再4℃靜置2小時(shí)，然后于離心機(jī)中8000r/min離心5分鐘，分離血清，即為雙氫青蒿素-bsa抗血清。二、制備抗血清效果檢測(cè)時(shí)所用的各種緩沖液包被緩沖液：ph9.6、0.05m的碳酸鹽緩沖液。樣品稀釋液：由0.5ml吐溫20、0.5g明膠和500mlph9.6、0.1m的pbs緩沖液混合得到。檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(ph5.5)：由檸檬酸三鈉、na2hpo4和水組成，檸檬酸三鈉的濃度為0.01m，na2hpo4的濃度為0.03m。底物緩沖液：將20.0mg鄰苯二胺(opd)溶解于10.0ml檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液中，然后加入4μl體積百分含量為30％的h2o2水溶液。終止液：2.0m硫酸水溶液。洗滌液：由nacl、kh2po4、na2hpo4·12h2o、tween-20和水組成，nacl的濃度為8.0g/l，kh2po4的濃度為0.2g/l，na2hpo4·12h2o的濃度為2.96g/l，tween-20的體積百分含量為1：1000。三、雙氫青蒿素-bsa抗血清對(duì)雙氫青蒿素的檢測(cè)效果1、雙氫青蒿素-ova稀釋液的配制將實(shí)施例2的步驟二制備雙氫青蒿素-ova溶液(以ova計(jì)，濃度為1mg/ml)完全解凍后，用包被緩沖液分別按1：100、1：300、1：900和1：2700進(jìn)行梯度稀釋，得到不同濃度的雙氫青蒿素-ova稀釋液，作為包被原。2、雙氫青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制(1)稱取5mg雙氫青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品，充分溶解于5ml乙腈中，得到1mg/ml雙氫青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。(2)用樣品稀釋液將1mg/ml雙氫青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品溶液配成1000ng/ml的雙氫青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。3、雙氫青蒿素-bsa抗血清稀釋液的配制將步驟一制備的雙氫青蒿素-bsa抗血清用樣品稀釋液分別按1:100、1:300、1:900和1:2700進(jìn)行梯度稀釋，得到不同濃度的雙氫青蒿素-bsa抗血清稀釋液。4、抗原、抗血清的棋盤格實(shí)驗(yàn)包被：在96孔酶標(biāo)板中每孔加入100μl雙氫青蒿素-ova稀釋液，4℃包被6小時(shí)，用洗滌液洗滌4次，甩干。直接競(jìng)爭(zhēng)：零孔每孔加50μl樣品稀釋液，抑制孔每孔加50μl步驟2的(2)制備的雙氫青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品溶液；加入步驟3的雙氫青蒿素-bsa抗血清稀釋液(50μl/孔)；置濕盒中常溫放置30min，用洗滌液洗滌4次，甩干。顯色：將底物緩沖液加入酶標(biāo)板中，每孔100μl，避光顯色10min。終止：每孔加入50μl終止液，用酶標(biāo)儀450nm處測(cè)定各孔的od值。結(jié)果如表2所示。表2、抗原、抗血清的棋盤格實(shí)驗(yàn)結(jié)果(od450nm值)注：i表示抑制孔，c表示零孔。結(jié)果表明，實(shí)施例2制備的雙氫青蒿素-bsa可以作為免疫原制備出檢測(cè)雙氫青蒿素的抗血清和抗體。四、雙氫青蒿素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立1、稱取5mg雙氫青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品，充分溶解于5ml乙腈中，得到1mg/ml雙氫青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。將雙氫青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品溶液用樣品稀釋液分別稀釋成如下不同的濃度：10ng/ml、3.33ng/ml、1.16ng/ml、0.37ng/ml、0.123ng/ml和0ng/ml。2、將實(shí)施例2的步驟一制備的雙氫青蒿素-ova溶液(以ova計(jì)，濃度為1mg/ml)用包被緩沖液1:1000稀釋后加入到96孔酶標(biāo)板中，每孔100μl，37℃包被3小時(shí)；用洗滌液洗滌4次，甩干。3、在步驟2的酶標(biāo)板中加入不同濃度的雙氫青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(實(shí)驗(yàn)孔)，每孔50μl，用50μl樣品稀釋液代替雙氫青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液作為對(duì)照孔。4、將步驟一制備的雙氫青蒿素-bsa抗血清用樣品稀釋液1:1000稀釋后加入步驟3的酶標(biāo)板中，每孔50μl；37℃溫育30分鐘；用洗滌液洗滌4次，甩干。5、每孔加入100μl底物緩沖液，避光顯色10min。6、每孔加入50μl終止液，用酶標(biāo)儀492nm處測(cè)定各孔的od值。以雙氫青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的濃度(ng/ml)作為x軸，以吸光度值的比值(b/b0×100％，其中，b為試驗(yàn)孔的平均吸光度值，b0為對(duì)照孔的平均吸光度值)作為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖3(實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，取三次平均值)。檢測(cè)雙氫青蒿素的ic50(即b/b0為50％時(shí)對(duì)應(yīng)的雙氫青蒿素濃度)為1.16ng/ml。結(jié)果表明，用實(shí)施例1制備的雙氫青蒿素-bsa作為抗原免疫小鼠得到的抗血清具有很好的效果。五、抗血清特異性檢測(cè)1、雙氫青蒿素類似物標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制分別用青蒿琥酯(中國食品藥品檢定研究院，貨號(hào)為100200)和蒿甲醚(中國食品藥品檢定研究院，貨號(hào)為100184)兩種結(jié)構(gòu)類似物代替雙氫青蒿素進(jìn)行步驟三的1，其它步驟均同步驟三中的相應(yīng)步驟。交叉反應(yīng)率(％)＝(雙氫青蒿素的ic50)/(雙氫青蒿素的類似物的ic50)×100％。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，取三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，結(jié)果如表3所示。表3、由雙氫青蒿素-bsa制備的抗血清的特異性檢測(cè)分析物ic50(ng/ml)交叉反應(yīng)率(％)雙氫青蒿素1.16100青蒿琥酯70.41.6蒿甲醚>20000<0.02結(jié)果表明，上述由雙氫青蒿素-bsa制備得到的抗血清與其類似物青蒿素的交叉反應(yīng)率很小，說明用雙氫青蒿素-bsa制備的抗血清對(duì)雙氫青蒿素具有很好的特異性。當(dāng)前第1頁12