本發(fā)明涉及糞便和土壤樣品處理中以代謝組學分析為目的的全代謝物提取和處理方法。尤其涉及一種用于糞便和土壤代謝組學研究的樣品制備處理方法。

背景技術(shù)：

代謝組學作為繼基因組學和蛋白質(zhì)組學后興起的新技術(shù)，是系統(tǒng)生物學的重要組成。代謝組學對某一時刻生物體內(nèi)所有生命活動所涉及代謝物的質(zhì)和量的變化情況進行綜合分析，從而揭示生物體所處的生理狀態(tài)。代謝組學具有高通量檢測和強大的數(shù)據(jù)模型分析能力，已經(jīng)廣泛應用于眾多研究領(lǐng)域，比如疾病診斷與機理、藥物研發(fā)、污染物毒理、營養(yǎng)食品科學、植物學及生態(tài)學等。利用代謝組學可以高通量地篩選暴露-效應標志物，標志物本身就是毒性機制中的關(guān)鍵分子，與其它分子指標結(jié)合通過聚類和關(guān)聯(lián)分析可發(fā)現(xiàn)重要毒性通路。

糞便是生物體最終的代謝產(chǎn)物集合體，富含大量的內(nèi)源性代謝物以及微生物代謝物的信息，對于我們認識生命活動的生物學過程具有重要意義。

生態(tài)代謝組近年來引起了科學界的廣泛關(guān)注，旨在研究生化因子影響與生態(tài)學現(xiàn)象之間的關(guān)系、生物群落中不同種群間的協(xié)同進化等等，在環(huán)境監(jiān)測、生態(tài)系統(tǒng)預警等應用生態(tài)學及物種進化、生態(tài)型鑒別等理論生態(tài)學研究中顯示出巨大潛力。生態(tài)代謝組研究涉及土壤樣品，通過定性和定量測定某種擾動情況(如溫度、濕度、環(huán)境污染等等)下土壤代謝組的變化，從而在代謝物層面表征對生態(tài)環(huán)境的影響。

糞便和土壤這類固體樣品成分非常復雜，代謝物質(zhì)種類繁多，物理性質(zhì)差異較大，且基質(zhì)干擾非常嚴重。目前常規(guī)的代謝組提取和處理方法過程繁瑣，提取和處理過程容易造成污染和不確定因素，且通常伴隨著代謝物質(zhì)組的變性，活性喪失和代謝物回收率低下。而且由于往往采用單一的提取液，造成代謝組提取不完整的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單、穩(wěn)定性強、全面的、回收率高的糞便和土壤代謝組學研究樣品的制備處理方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于糞便和土壤代謝組學研究的樣品制備處理方法，其特征在于，其經(jīng)過下列工藝步驟，

(1)樣品預處理：取適量在-80℃冰箱內(nèi)過夜預冷的糞便或土壤樣品，放入冷凍干燥機，干燥至衡重，低溫破碎，按照100mg樣品/1ml水溶性代謝物提取液的比例加入水溶性代謝物提取液，使其混勻，得到第一懸混液；(低溫可使酶失活并防止代謝物發(fā)生降解)

(2)震蕩破碎提?。喊凑?00-200mg糞便或土壤樣品/2顆鋼珠的比例加入鋼珠到所述第一懸混液，低溫下震蕩破碎得到破碎后的第一懸混液；

(3)超聲提取：將所述破碎后的第一懸混液在冰上進行超聲，進一步破碎樣品使代謝物質(zhì)溶出；離心，收集第一上清液和沉淀；

(4)將上述所得第一上清液放入旋轉(zhuǎn)濃縮儀中，濃縮至近干后，再按照100-200mg糞便或土壤樣品/200μl水溶性復溶液的比例加入水溶性復溶液，再按照100-200mg糞便或土壤樣品/1顆鋼珠的比例加入鋼珠，震蕩復溶；高速離心，所得第二上清液為水溶性代謝提取物，可直接上機分析；

(5)按照100mg糞便或土壤樣品/1ml脂溶性代謝物提取液的比例加入向上述所得沉淀中加入脂溶性代謝物提取液，使其混勻，得第二懸混液；

(5)震蕩破碎提?。簩⑺玫诙一煲涸?～4℃下震蕩破碎得到破碎后的第二懸混液；

(6)超聲提?。簩⑺闷扑楹蟮牡诙一煲涸诒线M行超聲，進一步破碎樣品使代謝物質(zhì)溶出；離心，收集下層溶液，得到脂溶性代謝物溶液；

(7)使用氮吹的方法將上述所得下層溶液吹干，按照100-200mg糞便或土壤樣品/200μl脂溶性復溶液的比例加入200μl脂溶性復溶液，再按照100-200mg糞便或土壤樣品/1顆鋼珠的比例加入1顆鋼珠，震蕩復溶；高速離心，所得第三上清液為脂溶性代謝提取物，可直接上機分析；

進一步的，所述步驟(1)中的糞便為各種動物以及人類的糞便排泄物。

進一步的，所述步驟(1)中的低溫破碎為液氮研磨破碎或其他可以保持破碎環(huán)境為零度以下低溫破碎裝置；

任選的，所述步驟(1)中水溶性代謝物提取液的配方為：甲醇、乙腈、乙酸和水按照體積比為1:1:0.1:2形成的混合液。

進一步的，所述步驟(2)、步驟(4)和步驟(8)中所使用的鋼珠直徑為1-3mm，為除去鋼珠表面所吸附的外源性污染物，鋼珠使用前經(jīng)過清洗和400℃高溫烘烤2小時。

進一步的，所述步驟(2)和步驟(6)中的震蕩破碎、步驟(4)和和步驟(8)中的震蕩復溶，使用的頻率為80-120hz，時間為60-120s。

進一步的，所述步驟(3)、步驟(7)中所述的超聲，其使用的超聲破碎儀功率為80～100w，超聲30s，關(guān)閉30s，超聲破碎時間為5～10min；

任選的，所述步驟(3)、步驟(7)中離心的條件為溫度4℃，轉(zhuǎn)速10000rpm，離心10min。

進一步的，所述步驟(4)中水溶性復溶液為甲醇、乙酸和水按照體積比1:0.05:1混合得到的混合液；

任選的，所述步驟(4)、步驟(8)中高速離心的條件為溫度4℃，轉(zhuǎn)速14000rpm，離心15min。

進一步的，所述步驟(5)中脂溶性代謝物提取液的配方為：-20℃的三氯甲烷、異丙醇和甲醇按照體積比1:1:1混合得到的混合液。

進一步的，所述步驟(8)中脂溶性復溶液的配方為：異丙醇、乙腈和水按照體積比10:4:1混合得到的混合物。

進一步的，所述步驟(4)、步驟(8)中所述上機檢測是指利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜或者經(jīng)過衍生化后利用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進行定性定量檢測。

本發(fā)明所述土壤不受限制，為各種可采集到的土壤。

本發(fā)明所述糞便不受限制，為各種可采集到的糞便。

本發(fā)明所提供的用于糞便和土壤代謝組學研究樣品的制備處理方法，其是將糞便或土壤樣品經(jīng)過冷凍干燥和低溫破碎后，加入水溶性代謝物提取液后混勻，低溫震蕩破碎，低溫超聲提取，取上清液和沉淀；上清液為水溶性代謝物提取液，濃縮至干后復溶，可以利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜或者經(jīng)過衍生化后利用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進行定性定量檢測；沉淀中加入脂溶性代謝物提取液后混勻，低溫震蕩破碎，低溫超聲提取，下層溶液為脂溶性代謝物提取液，氮吹至干后復溶，可以利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜或者經(jīng)過衍生化后利用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進行定性定量檢測。本發(fā)明采用新的水溶性/脂溶性提取液和復溶液配方，結(jié)合低溫震蕩破碎和低溫超聲提取的方法，同時對脂溶性和水溶性兩種類型的代謝物組進行了提取，能夠?qū)崿F(xiàn)對糞便和土壤樣品代謝組的高回收率、全覆蓋的提取，并且能夠有效避免外源性污染的引入，確保了提取效率和樣品的純度，操作簡便易行且穩(wěn)定，可以實現(xiàn)大批樣品的高效制備。本發(fā)明提取的最終產(chǎn)物可以直接進行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析或者經(jīng)過衍生化后利用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進行定性定量檢測；本發(fā)明工藝合理，操作可靠易行，制備科學，應用范圍廣，在保證代謝物提取效率的情況下最大限度地回收代謝物質(zhì)，簡化了操作步驟，對大量開展糞便和土壤代謝組學的相關(guān)研究具有較為重大的意義。

附圖說明

圖1是實施例1中采用不同提取方法從老鼠糞便中提取代謝物種類的數(shù)量比較圖。

圖2是實施例2中采用不同提取方法從土壤中提取代謝物種類的數(shù)量比較圖。

圖3是實施例3中采用不同提取方法從新生兒胎便中提取代謝物種類的數(shù)量比較圖。

具體實施方式

下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。本發(fā)明的描述中，“第一”、“第二”為指代或描述方便，不能理解為有順序關(guān)系或者有相對重要性指示，除非另有說明，“多個”、“多組”、“多重”的含義是兩個(組或重)或兩個(組或重)以上。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1：一種用于老鼠糞便代謝組學研究樣品的制備處理方法

(1)樣品預處理：利用代謝籠收集大鼠糞便顆粒，-80℃冰箱冷凍過夜后，放入冷凍干燥機，干燥至衡重，加液氮研磨破碎，過100目篩子，稱取100mg糞便粉末，加入1ml-20℃(-20℃是為了防止樣品中代謝物發(fā)生生物降解)水溶性代謝物提取液，使用移液槍吹打糞便，使其混勻，得到第一混懸液；所述水溶性代謝物提取液為甲醇、乙腈、乙酸和水按照體積比1:1:0.1:2混合得到的混合液。

(2)震蕩破碎提取：將2顆經(jīng)過清洗和400℃烘烤后直徑為3mm的鋼珠加入步驟(1)中得到的第一懸混液，低溫下震蕩破碎，震蕩頻率為80hz，時間為120s；

(3)超聲提?。簩⑺玫谝粦一煲喝芤涸诒线M行超聲，進一步破碎糞便使代謝物質(zhì)溶出，超聲破碎儀功率80w，超聲30s，關(guān)閉30s，超聲破碎時間為10min；4℃下，轉(zhuǎn)速10000rpm，離心10min，收集第一上清液和沉淀；

(4)將步驟(3)中所得第一上清液放入旋轉(zhuǎn)濃縮儀中，濃縮至近干。加入200μl水溶性復溶液(甲醇、乙酸和水按照體積比1:0.05:1混合得到的混合液)，加入一顆經(jīng)過清洗和400℃烘烤后直徑為3mm的鋼珠，震蕩復溶，震蕩頻率為60hz，時間為30s；高速離心，離心條件為溫度4℃，轉(zhuǎn)速14000rpm，離心15min，所得第二上清液為糞便水溶性代謝提取物，可直接上機分析；

(5)向步驟(3)所得沉淀中加入1ml-20℃的脂溶性代謝物提取液(三氯甲烷、異丙醇和甲醇按照體積比1:1:1混合得到的混合液)，使用移液槍吹打，使其混勻，得第二懸混液；

(6)震蕩破碎提取：0～4℃下震蕩破碎，震蕩頻率為90hz，時間為60s，得到破碎后的第二懸混液；

(7)超聲提?。簩⒉襟E(6)中得到的破碎后的第二懸混液溶液在冰上進行超聲，進一步破碎糞便使代謝物質(zhì)溶出，超聲破碎儀功率60w，超聲30s，關(guān)閉30s，超聲破碎時間為5min；4℃下，轉(zhuǎn)速10000rpm，離心10min，收集下層溶液，得到脂溶性代謝物溶液；

(8)使用氮吹的方法將步驟(7)中所得下層溶液吹干。加入200μl脂溶性復溶液(異丙醇、乙腈和水按照體積比10:4:1混合得到的的混合物)，加入一顆經(jīng)過清洗和400℃烘烤后直徑為3mm的鋼珠，震蕩復溶，震蕩頻率為60hz，時間為30s；高速離心，離心條件為溫度4℃，轉(zhuǎn)速14000rpm，離心15min，所得第三上清液為糞便脂溶性代謝提取物，可直接上機分析；

對比例1(方法1)：

(1)利用代謝籠收集大鼠糞便顆粒，-80℃冰箱冷凍過夜后，放入冷凍干燥機，干燥至衡重，研碎，稱取100mg糞便粉末，加入1ml-20℃甲醇，渦旋震蕩，靜置30min。

(2)4℃下，轉(zhuǎn)速10000rpm，離心10min，收集第一上清液和沉淀；

(3)將步驟(2)中所得第一上清液放入旋轉(zhuǎn)濃縮儀中，濃縮至近干。加入200μl甲醇，渦旋，靜置10min；高速離心，離心條件為溫度4℃，轉(zhuǎn)速14000rpm，離心15min，所得第二上清液為糞便水溶性代謝提取物，可直接上機分析；

(4)向步驟(2)所得沉淀中加入1ml-20℃三氯甲烷，使用移液槍吹打，使其混勻，得第一懸混液，渦旋，靜置30min；

(5)4℃下，轉(zhuǎn)速10000rpm，離心10min，收集下層溶液，得到脂溶性代謝物溶液；

(6)使用氮吹的方法將步驟(5)中所得下層溶液吹干。加入200μl乙腈，渦旋，靜置10min；高速離心，離心條件為溫度4℃，轉(zhuǎn)速14000rpm，離心15min，所得第三上清液為糞便脂溶性代謝提取物，可直接上機分析；

對比例2(方法2)：

(1)利用代謝籠收集大鼠糞便顆粒，-80℃冰箱冷凍過夜后，放入冷凍干燥機，干燥至衡重，研碎，稱取100mg糞便粉末，加入1ml-20℃甲醇，渦旋震蕩，靜置30min，得到混懸液。

(2)將所得懸混液進行超聲，超聲破碎儀功率60w，超聲30s，關(guān)閉30s，超聲破碎時間為5min；4℃下，轉(zhuǎn)速10000rpm，離心10min，收集第一上清液和沉淀；

(3)將步驟(2)中所得第一上清液放入旋轉(zhuǎn)濃縮儀中，濃縮至近干。加入200μl甲醇，渦旋，靜置10min；高速離心，離心條件為溫度4℃，轉(zhuǎn)速14000rpm，離心15min，所得第二上清液為糞便水溶性代謝提取物，可直接上機分析；

對比例3(方法3)：

(1)利用代謝籠收集大鼠糞便顆粒，-80℃冰箱冷凍過夜后，放入冷凍干燥機，干燥至衡重，研碎，稱取100mg糞便粉末，加入1ml-20℃三氯甲烷，渦旋震蕩，靜置30min，得到第一混懸液。

(2)將三顆經(jīng)過清洗和400℃烘烤后直徑為3mm的鋼珠加入步驟(1)中得到的第一懸混液，低溫下震蕩破碎，震蕩頻率為90hz，時間為60s；

(3)4℃下，轉(zhuǎn)速10000rpm，離心10min，收集下層溶液，得到脂溶性代謝物溶液；

(4)使用氮吹的方法將步驟(3)中所得下層溶液吹干。加入200μl乙腈，渦旋，靜置10min；高速離心，離心條件為溫度4℃，轉(zhuǎn)速14000rpm，離心15min，所得清液為糞便脂溶性代謝提取物，可直接上機分析；

實驗結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，采用本發(fā)明的方法，其脂溶性提取物和水溶性提取物的提取量遠遠高于對比例的。方法2和3分別只能提取水溶性或脂溶性提取物，不夠全面；方法1雖然可以同時提取水溶性或脂溶性提取物，但采用本發(fā)明的方法最終在糞便中能檢出更多水溶性代謝物和脂溶性代謝物。

本實施例所提供的糞便代謝組學研究樣品的制備處理方法，其工藝合理，操作可靠，制備科學，應用范圍廣泛，在保證代謝物質(zhì)穩(wěn)定和提取效率的情況下最大限度地簡化了操作步驟，最終所得樣品可以利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜或者經(jīng)過衍生化后利用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進行定性定量檢測。

實施例2：一種用于土壤代謝組學研究樣品的制備處理方法

(1)樣品預處理：稱取適量土壤樣品，放入到玻璃燒杯中，-80℃冰箱冷凍過夜后，放入冷凍干燥機，干燥至衡重，加液氮研磨破碎，過100目篩子。稱取300mg土壤粉末，加入3ml-20℃水溶性代謝物提取液，使用移液槍吹打，使其混勻，得到第一混懸液；

(2)震蕩破碎提取：將6顆經(jīng)過清洗和400℃烘烤后直徑為3mm的鋼珠加入步驟(1)中得到的第一懸混液，低溫下震蕩破碎，震蕩頻率為100hz，時間為90s，得到破碎后的第一混懸液；

(3)超聲提?。簩⒉襟E(2)中得到的破碎后的第一懸混液溶液在冰上進行超聲，進一步破碎使代謝物質(zhì)溶出，超聲破碎儀功率90w，超聲30s，關(guān)閉30s，超聲破碎時間為7min；4℃下，轉(zhuǎn)速10000rpm，離心20min，收集第一上清液和沉淀；

(4)將步驟(3)中所得第一上清液放入旋轉(zhuǎn)濃縮儀中，濃縮至近干。加入200μl水溶性復溶液(甲醇、乙酸和水按照體積比1:0.05:1混合得到的混合液)，加入一顆經(jīng)過清洗和400℃烘烤后直徑為3mm的鋼珠，震蕩復溶，震蕩頻率為60hz，時間為30s；高速離心，離心條件為溫度4℃，轉(zhuǎn)速14000rpm，離心20min，所得第二上清液為水溶性代謝提取物，可直接上機分析；

(5)向步驟(3)所得沉淀中加入3ml-20℃的脂溶性代謝物提取液，使用移液槍吹打，使其混勻得第二懸混液；

(6)震蕩破碎提?。旱蜏叵抡鹗幤扑?，震蕩頻率為120hz，時間為30s，得到破碎后的第二懸混液；

(7)超聲提取：將步驟(6)中得到的破碎后的第二懸混液在冰上進行超聲，進一步破碎樣品使代謝物質(zhì)溶出，超聲破碎儀功率90w，超聲30s，關(guān)閉30s，超聲破碎時間為10min；4℃下，轉(zhuǎn)速10000rpm，離心20min，收集下層溶液；

(8)使用氮吹的方法將步驟(7)中所得下層溶液吹干。加入200μl脂溶性復溶液(異丙醇、乙腈和水按照體積比10:4:1混合得到的的混合物)，加入一顆經(jīng)過清洗和400℃烘烤后直徑為3mm的鋼珠，震蕩復溶，震蕩頻率為60hz，時間為30s；高速離心，離心條件為溫度4℃，轉(zhuǎn)速14000rpm，離心20min，所得第三上清液為脂溶性代謝提取物，可直接上機分析；

對比例1(方法1)：

(1)稱取適量土壤樣品，放入到玻璃燒杯中，-80℃冰箱冷凍過夜后，放入冷凍干燥機，干燥至衡重，研磨。稱取300mg土壤粉末，加入1ml-20℃甲醇，渦旋震蕩，靜置30min，得到混懸液。

(2)將所得懸混液進行超聲，超聲破碎儀功率60w，超聲30s，關(guān)閉30s，超聲破碎時間為5min；4℃下，轉(zhuǎn)速10000rpm，離心10min，收集第一上清液和沉淀；

(3)將步驟(2)中所得第一上清液放入旋轉(zhuǎn)濃縮儀中，濃縮至近干。加入200μl甲醇，渦旋，靜置10min；高速離心，離心條件為溫度4℃，轉(zhuǎn)速14000rpm，離心15min，所得第二上清液為土壤水溶性代謝提取物，可直接上機分析；

將以上方法制備的樣品在相同條件的液相色譜/質(zhì)譜系統(tǒng)下檢測，并經(jīng)過xcms進行代謝物提取，實驗結(jié)果見圖2。目前已報道的土壤代謝組提取的方法極少。從圖2可以看出，采用本發(fā)明的方法，其水溶性提取物的提取量遠遠高于對比例。方法2只能提取水溶性提取物，不夠全面；采用本發(fā)明的方法最終在土壤中能檢出更多水溶性代謝物和脂溶性代謝物。

本實施例所提供的土壤代謝組學研究樣品的制備處理方法，其工藝合理，操作可靠，制備科學，應用范圍廣泛，在保證代謝物質(zhì)穩(wěn)定和提取效率的情況下最大限度地簡化了操作步驟，最終所得樣品可以利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜或者經(jīng)過衍生化后利用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進行定性定量檢測。

實施例3：一種用于新生兒胎便代謝組學研究樣品的制備處理方法

(1)樣品預處理：稱取新生兒胎便樣品，放入到玻璃燒杯中，-80℃冰箱冷凍過夜后，放入冷凍干燥機，干燥至衡重，加液氮研磨破碎，過100目篩子。稱取200mg樣品粉末，加入2ml-20℃水溶性代謝物提取液，使用移液槍吹打，使其混勻，得到第一混懸液；

(2)震蕩破碎提取：將4顆經(jīng)過清洗和400℃烘烤后直徑為3mm的鋼珠加入步驟(1)中得到的第一懸混液，低溫下震蕩破碎，震蕩頻率為120hz，時間為60s，得到破碎后的第一混懸液；

(3)超聲提?。簩⒉襟E(2)中得到的破碎后的第一懸混液溶液在冰上進行超聲，進一步破碎使代謝物質(zhì)溶出，超聲破碎儀功率100w，超聲30s，關(guān)閉30s，超聲破碎時間為5min；4℃下，轉(zhuǎn)速10000rpm，離心20min，收集第一上清液和沉淀；

(4)將步驟(3)中所得第一上清液放入旋轉(zhuǎn)濃縮儀中，濃縮至近干。加入200μl水溶性復溶液(甲醇、乙酸和水按照體積比1:0.05:1混合得到的混合液)，加入一顆經(jīng)過清洗和400℃烘烤后直徑為3mm的鋼珠，震蕩復溶，震蕩頻率為60hz，時間為30s；高速離心，離心條件為溫度4℃，轉(zhuǎn)速14000rpm，離心20min，所得第二上清液為水溶性代謝提取物，可直接上機分析；

(5)向步驟(3)所得沉淀中加入3ml-20℃的脂溶性代謝物提取液，使用移液槍吹打，使其混勻得第二懸混液；

(6)震蕩破碎提?。旱蜏叵抡鹗幤扑椋鹗庮l率為120hz，時間為30s，得到破碎后的第二懸混液；

(7)超聲提?。簩⒉襟E(6)中得到的破碎后的第二懸混液在冰上進行超聲，進一步破碎樣品使代謝物質(zhì)溶出，超聲破碎儀功率90w，超聲30s，關(guān)閉30s，超聲破碎時間為10min；4℃下，轉(zhuǎn)速10000rpm，離心20min，收集下層溶液；

(8)使用氮吹的方法將步驟(7)中所得下層溶液吹干。加入200μl脂溶性復溶液(異丙醇、乙腈和水按照體積比10:4:1混合得到的的混合物)，加入一顆經(jīng)過清洗和400℃烘烤后直徑為3mm的鋼珠，震蕩復溶，震蕩頻率為60hz，時間為30s；高速離心，離心條件為溫度4℃，轉(zhuǎn)速14000rpm，離心20min，所得第三上清液為脂溶性代謝提取物，可直接上機分析；

對比例1(方法1)：

(1)收集新生兒胎便，-80℃冰箱冷凍過夜后，放入冷凍干燥機，干燥至衡重，研碎，稱取100mg樣品粉末，加入1ml-20℃甲醇，渦旋震蕩，靜置30min。

(2)4℃下，轉(zhuǎn)速10000rpm，離心10min，收集第一上清液和沉淀；

(3)將步驟(2)中所得第一上清液放入旋轉(zhuǎn)濃縮儀中，濃縮至近干。加入200μl甲醇，渦旋，靜置10min；高速離心，離心條件為溫度4℃，轉(zhuǎn)速14000rpm，離心15min，所得第二上清液為糞便水溶性代謝提取物，可直接上機分析；

(4)向步驟(2)所得沉淀中加入1ml-20℃三氯甲烷，使用移液槍吹打，使其混勻，得第一懸混液，渦旋，靜置30min；

(5)4℃下，轉(zhuǎn)速10000rpm，離心10min，收集下層溶液，得到脂溶性代謝物溶液；

(6)使用氮吹的方法將步驟(5)中所得下層溶液吹干。加入200μl乙腈，渦旋，靜置10min；高速離心，離心條件為溫度4℃，轉(zhuǎn)速14000rpm，離心15min，所得第三上清液為糞便脂溶性代謝提取物，可直接上機分析；

對比例2(方法2)：

(1)收集新生兒胎便，-80℃冰箱冷凍過夜后，放入冷凍干燥機，干燥至衡重，研碎，稱取100mg樣品粉末，加入1ml-20℃甲醇，渦旋震蕩，靜置30min，得到混懸液。

(2)將所得懸混液進行超聲，超聲破碎儀功率60w，超聲30s，關(guān)閉30s，超聲破碎時間為5min；4℃下，轉(zhuǎn)速10000rpm，離心10min，收集第一上清液和沉淀；

(3)將步驟(2)中所得第一上清液放入旋轉(zhuǎn)濃縮儀中，濃縮至近干。加入200μl甲醇，渦旋，靜置10min；高速離心，離心條件為溫度4℃，轉(zhuǎn)速14000rpm，離心15min，所得第二上清液為糞便水溶性代謝提取物，可直接上機分析；

對比例3(方法3)：

(1)收集新生兒胎便，-80℃冰箱冷凍過夜后，放入冷凍干燥機，干燥至衡重，研碎，稱取100mg樣品粉末，加入1ml-20℃三氯甲烷，渦旋震蕩，靜置30min，得到第一混懸液。

(2)將三顆經(jīng)過清洗和400℃烘烤后直徑為3mm的鋼珠加入步驟(1)中得到的第一懸混液，低溫下震蕩破碎，震蕩頻率為90hz，時間為60s；

(3)4℃下，轉(zhuǎn)速10000rpm，離心10min，收集下層溶液，得到脂溶性代謝物溶液；

(4)使用氮吹的方法將步驟(3)中所得下層溶液吹干。加入200μl乙腈，渦旋，靜置10min；高速離心，離心條件為溫度4℃，轉(zhuǎn)速14000rpm，離心15min，所得清液為糞便脂溶性代謝提取物，可直接上機分析；

實驗結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，采用本發(fā)明的方法，其脂溶性提取物和水溶性提取物的提取量遠遠高于對比例的。方法2和3分別只能提取水溶性或脂溶性提取物，不夠全面；方法1雖然可以同時提取水溶性或脂溶性提取物，但采用本發(fā)明的方法最終在新生兒胎便中能檢出更多水溶性代謝物和脂溶性代謝物。

本實施例所提供的收集新生兒胎便代謝組學研究樣品的制備處理方法，其工藝合理，操作可靠，制備科學，應用范圍廣泛，在保證代謝物質(zhì)穩(wěn)定和提取效率的情況下最大限度地簡化了操作步驟，最終所得樣品可以利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜或者經(jīng)過衍生化后利用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進行定性定量檢測。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。