本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。涉及生物組織石蠟樣本處理，尤其涉及一種溶解石蠟組織切片的方法，是一種溶解消化石蠟包埋組織切片的方法，特別適用于生物組織石蠟樣本提取核酸物質(zhì)時(shí)使用。

背景技術(shù)：

腫瘤基因檢測(cè)是當(dāng)前熱門的臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域，通過(guò)對(duì)腫瘤組織dna、rna、mirna等核酸物質(zhì)檢測(cè)可獲得腫瘤的分子特征，從而預(yù)判腫瘤患者復(fù)發(fā)生存、治療反應(yīng)等臨床特征。石蠟包埋腫瘤組織切片是最常用的腫瘤基因檢測(cè)樣本，如檢測(cè)肺癌石蠟包埋組織dna的egfr突變可判斷酪氨酸激酶抑制劑的療效，檢測(cè)乳腺癌21個(gè)基因的rna表達(dá)量可判斷是否需要術(shù)后化療。在這些腫瘤基因檢測(cè)中，一般需要從石蠟包埋組織切片中提取dna或rna進(jìn)行檢測(cè)。

石蠟包埋是常溫長(zhǎng)期保存組織蛋白和核酸分子的經(jīng)典方法，幾乎所有醫(yī)療機(jī)構(gòu)均會(huì)采用石蠟包埋方法保存腫瘤組織。在石蠟包埋過(guò)程中，新鮮組織經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑固定和逐步脫水，組織中水的成份被石蠟油替代，從而使生物分子得到完整保存。而在石蠟包埋組織提取dna或rna的過(guò)程中，則必須將組織中的石蠟成份溶解出，由水來(lái)替代，稱為“脫蠟”。脫蠟的組織一般采用蛋白酶進(jìn)行溶解消化，以釋放出dna和rna等核酸物質(zhì)。脫蠟和溶解的過(guò)程，一般由有機(jī)溶劑二甲苯和蛋白酶k來(lái)完成。

一般的石蠟切片組織要求厚度在5-6微米之間，薄的切片有利于二甲苯溶劑的滲透和蛋白酶k的消化，從而使提取更加徹底。但是在實(shí)際操作中，石蠟切片的厚度在不同醫(yī)療機(jī)構(gòu)及不同切片操作員切取時(shí)會(huì)有較大差異。特別在進(jìn)行一些核酸用量較大的基因檢測(cè)如乳腺癌21基因表達(dá)定量時(shí)，檢測(cè)者會(huì)要求切取較大量的石蠟組織，此時(shí)石蠟切片數(shù)量和切片厚度可能會(huì)顯著增加。此時(shí)檢測(cè)操作者會(huì)采用延長(zhǎng)蛋白酶k孵育時(shí)間的方法消化溶解較大量的石蠟組織。一般石蠟組織核酸提取時(shí)蛋白酶k消化孵育的時(shí)間為15分鐘到3小時(shí)，但對(duì)于切片較厚且數(shù)量較多的石蠟切片，即使延長(zhǎng)蛋白酶k孵育時(shí)間至24小時(shí)也無(wú)法將其徹底溶解，容器底部仍然會(huì)殘留固體組織。孵育時(shí)間的過(guò)度延長(zhǎng)會(huì)使部分核酸物質(zhì)出現(xiàn)降解，組織殘余的存在不僅會(huì)使dna和rna提取量減少，而且會(huì)使已溶解消化部分組織所提取dna和rna對(duì)整個(gè)組織的代表性出現(xiàn)偏差，從而影響測(cè)定結(jié)果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種溶解石蠟組織切片的方法，是在完成常規(guī)的第一次蛋白酶k孵育后(一般孵育時(shí)間為60-120分鐘)，將孵育溶解體系升至高溫(80-90攝氏度之間)后維持3-5分鐘后取出，待其冷卻至室溫，再向溶解反應(yīng)體系中加入蛋白酶k，再孵育10-30分鐘即可使組織完全溶解消失，無(wú)明顯顆粒物，溶液清亮。

本發(fā)明方法的具體步驟如下：

(1)第一次酶解：在已脫蠟干燥的組織中注入適于蛋白酶酶解的溶液及蛋白酶組成酶解體系，在56攝氏度孵育60-120分鐘；

(2)短時(shí)升溫：完成第一次孵育后將其取出，立即置于高溫下短時(shí)孵育；

(3)第二次酶解：再次向酶解體系中注入蛋白酶，混勻后在56攝氏度孵育10-30分鐘，組織完全溶解；

(4)在第一次或第二次酶解孵育期間，用物理方法震蕩松動(dòng)正在酶解的組織1-2次。

其中步驟(2)所述短時(shí)升溫中的高溫是指80-90攝氏度。其短時(shí)升溫中的短時(shí)是指3-5分鐘。

其中步驟(4)所述物理方法震蕩松動(dòng)酶解組織，是指彈擊酶解體系的容器壁或者上下快速震蕩容器。

本發(fā)明的技術(shù)方案是采用短時(shí)升溫二次酶解法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述方法在溶解石蠟組織切片中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的一種消化溶解石蠟組織切片的方法，專門針對(duì)較厚或較大量石蠟組織切片無(wú)法在短時(shí)間內(nèi)徹底溶解消化的問(wèn)題。采用本發(fā)明所述方法可將石蠟組織多量厚切片在3小時(shí)內(nèi)完全消化溶解，使組織溶液澄清，不破壞核酸物質(zhì)，無(wú)明顯顆粒物。本發(fā)明方法顯著縮短多量厚切片石蠟組織消化溶解所需時(shí)間，不破壞核酸物質(zhì)，減少長(zhǎng)時(shí)間孵育引起的核酸物質(zhì)降解，使所提取核酸物質(zhì)對(duì)整個(gè)切片組織具有更完整的代表性。

附圖說(shuō)明

圖1是短時(shí)升溫二次酶解步驟示意圖。

具體實(shí)施方法

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。

實(shí)施例1

參見(jiàn)圖1，取兩支同一蠟塊切取的乳腺癌石蠟組織，標(biāo)為a和b，兩管組織量基本相同。a管和b管石蠟組織切片在經(jīng)過(guò)相同的二甲苯脫蠟、酒精清洗和組織干燥后，其組織體積均約為5毫米×4毫米×6毫米(0.12毫升)。向含有待溶解干燥組織的a和b離心管內(nèi)各加入200微升組織溶解液，溶解液配方為常規(guī)含sds溶液。再向離心管a加入20毫克/毫升濃度的蛋白酶k溶液15微升，向離心管b加入相同的蛋白酶k溶液25微升，各自組成溶解反應(yīng)體系。將含有溶解反應(yīng)體系的離心管蓋緊后在金屬浴恒溫儀上于56攝氏度進(jìn)行第一次孵育。60分鐘后觀察組織溶解情況，可見(jiàn)兩管均出現(xiàn)組織聚縮成團(tuán)，組織溶解度無(wú)顯著區(qū)別。將含溶解反應(yīng)體系的離心管取出上下劇烈搖晃混勻，用手指彈擊離心管底部使之混勻?；靹蚝骯管和b管繼續(xù)第一次孵育，孵育60分鐘后再觀察，此時(shí)觀察到兩管組織均呈松解狀渾濁液，晃動(dòng)離心管可見(jiàn)溶液中有棉絮樣沉淀。此時(shí)，b管繼續(xù)在56攝氏度恒溫金屬浴內(nèi)孵育16個(gè)小時(shí)，a管則取出進(jìn)行短時(shí)升溫二次酶解操作。

另取一個(gè)金屬恒溫儀，調(diào)節(jié)溫度至80攝氏度，待恒溫儀到達(dá)設(shè)定溫度后，將離心管a置入80攝氏度高溫孵育5分鐘，5分鐘后立即取出置于室溫，待其降溫至30攝氏度以下后，打開(kāi)離心管a蓋子，向離心管a溶解反應(yīng)體系內(nèi)再加入20毫克/毫升濃度蛋白酶k溶液8微升，蓋緊管蓋。將離心管a置入56攝氏度恒溫金屬浴內(nèi)進(jìn)行第二次孵育，時(shí)間為30分鐘。30分鐘后取出離心管a，此時(shí)可觀察到a管內(nèi)溶解反應(yīng)體系已無(wú)棉絮樣沉淀或其他顆粒物，溶液清亮(圖1)。后續(xù)進(jìn)行常規(guī)80攝氏度高溫孵育15分鐘后，溶解反應(yīng)體系更加清亮并透明，無(wú)需15分鐘高速離心去除沉淀，直接可加入乙醇進(jìn)行后續(xù)提取。最后得到880納克/微升的rna溶液共30微升，共獲得26.4微克rna。

b管在孵育16小時(shí)后，溶液反應(yīng)體系內(nèi)棉絮狀沉淀物有少許減少，但整個(gè)反應(yīng)體系仍呈渾濁狀，對(duì)光透視可見(jiàn)溶液中仍然有明顯顆粒物。后續(xù)80攝氏度高溫孵育15分鐘后，顆粒物有所減少，但溶液仍然渾濁。將b管在13000轉(zhuǎn)/分下高速離心15分鐘，離心后可見(jiàn)b管底部粘稠沉淀物，沉淀物上層有約120微升清亮液體，清亮液體與管壁接觸部分亦有粘稠物質(zhì)。小心將b管內(nèi)上層清亮液轉(zhuǎn)移至另一干凈離心管內(nèi)，加入乙醇進(jìn)行后續(xù)提取，最后得到350納克/微升的rna溶液共30微升，共獲得10.5微克rna。

實(shí)施例2

參見(jiàn)圖1，取一支含較多結(jié)直腸癌石蠟切片組織的離心管，在經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟、酒精清洗和組織干燥后，其組織體積均約為8毫米×5毫米×10毫米(0.4毫升)。向含有待溶解干燥組織離心管內(nèi)加入600微升組織溶解液，溶解液配方為常規(guī)含sds溶液。再向離心管內(nèi)加入20毫克/毫升濃度的蛋白酶k溶液25微升，組成溶解反應(yīng)體系。將含有溶解反應(yīng)體系的離心管蓋緊后在金屬浴恒溫儀上于56攝氏度進(jìn)行第一次孵育。60分鐘后觀察組織溶解情況，可見(jiàn)離心管內(nèi)組織聚縮沉于底部。將含溶解反應(yīng)體系的離心管取出上下劇烈搖晃混勻，用手指彈擊離心管底部使之混勻，為第一次混勻，混勻后繼續(xù)第一次孵育。孵育30分鐘后再將離心管取出上下劇烈搖晃混勻，用手指彈擊離心管底部使之混勻，為第二次混勻，混勻后繼續(xù)第一次孵育。孵育30分鐘后取出離心管，此時(shí)可見(jiàn)組織均呈松解狀渾濁液，溶液中有棉絮樣沉淀。

將金屬恒溫儀調(diào)節(jié)溫度至90攝氏度，待恒溫儀到達(dá)設(shè)定溫度后，將離心管置入90攝氏度高溫孵育5分鐘，5分鐘后立即取出置于室溫，待其降溫至30攝氏度以下后，打開(kāi)離心管蓋子，向離心管溶解反應(yīng)體系內(nèi)再加入20毫克/毫升濃度蛋白酶k溶液15微升，蓋緊管蓋置入56攝氏度恒溫金屬浴內(nèi)進(jìn)行第二次孵育，時(shí)間為30分鐘。30分鐘后取出離心管，此時(shí)可觀察到管內(nèi)溶解反應(yīng)體系已無(wú)棉絮樣沉淀或其他顆粒物，溶液清亮。

實(shí)施例3

參見(jiàn)圖1，取一支含胃癌石蠟切片組織的離心管，在經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟、酒精清洗和組織干燥后，其組織體積均約為5毫米×3毫米×4毫米(0.06毫升)。向含有待溶解干燥組織離心管內(nèi)各加入200微升組織溶解液，溶解液配方為常規(guī)含sds溶液。再向離心管內(nèi)加入20毫克/毫升濃度的蛋白酶k溶液15微升，組成溶解反應(yīng)體系。將含有溶解反應(yīng)體系的離心管蓋緊后在金屬浴恒溫儀上于56攝氏度進(jìn)行第一次孵育。30分鐘后觀察組織溶解情況，可見(jiàn)離心管內(nèi)組織聚縮。將含溶解反應(yīng)體系的離心管取出上下劇烈搖晃混勻，用手指彈擊離心管底部使之混勻。混勻后繼續(xù)第一次孵育，孵育30分鐘后取出離心管，此時(shí)可見(jiàn)組織均呈松解狀渾濁液，溶液中有棉絮樣沉淀。

將金屬恒溫儀調(diào)節(jié)溫度至85攝氏度，待恒溫儀到達(dá)設(shè)定溫度后，將離心管置入85攝氏度高溫孵育3分鐘，3分鐘后立即取出置于室溫，待其降溫至30攝氏度以下后，打開(kāi)離心管蓋子，向離心管溶解反應(yīng)體系內(nèi)再加入20毫克/毫升濃度蛋白酶k溶液10微升，蓋緊管蓋置入56攝氏度恒溫金屬浴內(nèi)進(jìn)行第二次孵育，時(shí)間為10分鐘。10分鐘后取出離心管，此時(shí)可觀察到管內(nèi)溶解反應(yīng)體系已無(wú)棉絮樣沉淀或其他顆粒物，溶液清亮。