(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種內(nèi)嵌內(nèi)標(biāo)分子的納米粒子表面增強(qiáng)拉曼光譜定量分析方法。

(二)

背景技術(shù)：

表面增強(qiáng)拉曼光譜(surfaceenhancedraman)是一種可以提供目標(biāo)分子的指紋信息的超靈敏非標(biāo)記檢測(cè)方法，通過(guò)檢測(cè)吸附在納米粒子表面的分子的振動(dòng)特征來(lái)鑒別分子物種，廣泛應(yīng)用于物理、化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、考古學(xué)、納米科學(xué)等領(lǐng)域。理論上光譜的強(qiáng)度正比于樣品的濃度，由于儀器本身的因素，包括激發(fā)光激發(fā)功率的變化、信號(hào)采集以及周圍環(huán)境變化等的影響，不能直接得到樣品的絕對(duì)拉曼強(qiáng)度與其濃度的線性關(guān)系，所以sers技術(shù)一般用于定性分析。通過(guò)檢測(cè)物與內(nèi)標(biāo)分子相對(duì)sers強(qiáng)度定量檢測(cè)的方法已被廣泛接受，此法不僅可以消除儀器本身的影響，還可以校正因基底形態(tài)或流速變化的影響。

目前，一種內(nèi)標(biāo)方法是將內(nèi)標(biāo)分子和檢測(cè)物同時(shí)修飾在基底的外表面，這種方法使內(nèi)標(biāo)分子和被檢測(cè)分子具有相同的sers環(huán)境，能夠很好的消除不確定因素的影響，可是這種方法要求內(nèi)標(biāo)分子不與檢測(cè)物分子發(fā)生反應(yīng)，而且會(huì)爭(zhēng)奪sers‘熱點(diǎn)’。另一種是核-分子-殼納米粒子模式，這種方法能夠保護(hù)內(nèi)標(biāo)分子不受外界分子的影響且不占據(jù)納米粒子的sers‘熱點(diǎn)’，但是核-分子-殼納米粒子需要添加凝聚劑使其達(dá)到sers增強(qiáng)的最優(yōu)化，然而凝聚劑的添加又增加了一個(gè)不可控影響因素，且凝聚會(huì)使粒子表面環(huán)境、sers‘熱點(diǎn)’等改變。因此新的sers定量方法有待于改進(jìn)。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種能夠快速、靈敏、準(zhǔn)確可靠的定量檢測(cè)分析分子的內(nèi)嵌內(nèi)標(biāo)分子的納米粒子表面增強(qiáng)拉曼光譜定量分析的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種內(nèi)嵌內(nèi)標(biāo)分子的納米粒子表面增強(qiáng)拉曼光譜定量分析的方法，所述方法包括：

(1)以金納米粒子為內(nèi)核，在內(nèi)核表面修飾上內(nèi)標(biāo)分子，所述內(nèi)標(biāo)分子為對(duì)巰基苯甲酸(pmba)；

(2)在內(nèi)標(biāo)分子外圍包覆銀外殼，得到au-pmba@ag納米粒子溶膠；

(3)將au-pmba@ag納米粒子溶膠與待測(cè)分子混合均勻，或者將au-pmba@ag納米粒子溶膠先制備成基底、再滴加待測(cè)分子；

(4)進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼檢測(cè)，及mapping。

所述金納米粒子為長(zhǎng)方體或棒狀金納米粒子。

所述au-pmba@ag納米粒子溶膠制備成單層基底。

所述au-pmba@ag納米粒子中，pmba分子所占金納米棒表面積的比值為100％。

所待測(cè)分子為下列之一：r6g分子、結(jié)晶紫、氨基酸等。

具體的所述待測(cè)分子為r6g分子時(shí)，所述方法如下：

(1)取金納米棒，加入pmba和十六烷基三甲基氯化銨，超聲振蕩0.5～2小時(shí)，然后離心，去上清，再加超純水離心洗滌，得到修飾內(nèi)標(biāo)分子的金納米棒；

(2)步驟(1)修飾內(nèi)標(biāo)分子的金納米棒加到ctac溶液中，50～60℃加熱，磁力攪拌10～20min，然后加入硝酸銀溶液，繼續(xù)攪拌5～10min，再加入抗壞血酸，繼續(xù)加熱攪拌3～4小時(shí)，最終溶液顏色為綠色；離心、超純水洗滌，再離心，沉淀轉(zhuǎn)移到pvp乙醇溶液，超聲2～h，離心、無(wú)水乙醇洗滌，離心、沉淀用無(wú)水乙醇重懸，得到au-pmba@ag納米粒子溶膠；

(3)au-pmba@ag納米粒子加入環(huán)己烷和二氯甲烷均勻混合，然后取混合溶液于離心管，并加入辛烷混合，滴加于直徑2cm的水面上，待有機(jī)相完全揮發(fā)后，干凈的硅片沉于液面下之后，通過(guò)提拉硅片將液面上的銀納米棒的膜轉(zhuǎn)移到硅片表面，得到au-pmba@ag納米粒子單層基底；

(4)將步驟(3)制備好的基底泡于濃度分別為10nm、30nm、50nm、70nm、90nm和100nm的r6g乙醇溶液中過(guò)夜，取出自然晾干，置于共焦拉曼光譜顯微鏡上進(jìn)行sers成像；計(jì)算r6g610cm^-1sers強(qiáng)度與內(nèi)標(biāo)分子pmba1080cm^-1sers強(qiáng)度的比值并做出與r6g濃度的關(guān)系圖；

(5)將上述制備好的基底泡于待測(cè)樣品溶液中過(guò)夜，取出自然晾干，置于共焦拉曼光譜顯微鏡上進(jìn)行sers成像，計(jì)算r6g610cm^-1sers強(qiáng)度與內(nèi)標(biāo)分子pmba1080cm^-1sers強(qiáng)度的比值，對(duì)照步驟(4)關(guān)系圖，即可獲得待測(cè)樣品溶液中的r6g濃度值。

本發(fā)明在核-殼納米粒子之間融入一種內(nèi)標(biāo)分子，在拉曼檢測(cè)時(shí)，納米粒子自帶內(nèi)參分子，使內(nèi)參分子和待測(cè)分子除了分子的不同外，所處的檢測(cè)環(huán)境幾乎完全相同，所以可以通過(guò)待測(cè)分子與內(nèi)參分子的比值得到待測(cè)分子拉曼強(qiáng)度與其濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而定量檢測(cè)待測(cè)分子。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1)本發(fā)明的內(nèi)嵌內(nèi)標(biāo)分子的納米粒子的制備方法簡(jiǎn)單，制備的原材料易得，而且核-殼金屬納米粒子的大小可控，粒度均一。

2)本發(fā)明與球形納米粒子相比較形態(tài)、粒度均一，不依賴于聚集產(chǎn)生拉曼活性。

3)本發(fā)明核-殼納米粒子的核殼間加有內(nèi)標(biāo)分子，對(duì)吸附在納米粒子表面的分析物具有校正作用，從而定量檢測(cè)分析物。

4)本發(fā)明的內(nèi)嵌內(nèi)標(biāo)分子的納米粒子既可以作為溶液基底也可以作為固體基底。

(四)附圖說(shuō)明

圖1是內(nèi)嵌內(nèi)標(biāo)分子的納米粒子及其基底的制備的實(shí)驗(yàn)流程示意圖。

圖2是內(nèi)嵌內(nèi)標(biāo)分子的納米粒子的紫外可見光譜。

圖3是內(nèi)嵌內(nèi)標(biāo)分子的納米粒子的tem照片。

圖4是內(nèi)嵌10％-100％pmbaau@ag長(zhǎng)方體的sers強(qiáng)度與pmba所占百分比的關(guān)系圖r²＝0.98366。

圖5是r6g分子在au-pmba@ag長(zhǎng)方體溶膠外中的校正前后拉曼強(qiáng)度與濃度的關(guān)系，其中1是r6g分子在au-pmba@ag長(zhǎng)方體溶膠外中的校正前拉曼強(qiáng)度與濃度的關(guān)系圖r²＝89.237，2是r6g分子在au-pmba@ag長(zhǎng)方體溶膠外中的校正后拉曼強(qiáng)度與濃度的關(guān)系圖，r²＝0.99633。

圖6為au-100％pmba@ag長(zhǎng)方體及基底的sem表征及mapping成像結(jié)果，其中(1)是內(nèi)嵌au-100％pmba@ag長(zhǎng)方體的tem表征圖，圖6(2)是au-100％pmba@ag長(zhǎng)方體納米粒子單層基底sem表征，圖6(3)是sers基底的mapping成像，圖6(4)是mapping各點(diǎn)的sers光譜。

圖7為r6gsers強(qiáng)度與內(nèi)標(biāo)分子pmbasers強(qiáng)度的比值與r6g濃度的關(guān)系圖；其中圖7(1)是內(nèi)標(biāo)分子pmba在不同r6g濃度下的sers強(qiáng)度，圖7(2)是r6g的sers強(qiáng)度未經(jīng)內(nèi)標(biāo)分子校正時(shí)的關(guān)系圖，r²＝0.97581，圖7(3)是r6g的sers強(qiáng)度經(jīng)內(nèi)標(biāo)分子校正后的關(guān)系圖r²＝0.99161

(五)具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于此：實(shí)施例1：內(nèi)嵌內(nèi)標(biāo)分子的納米粒子及其基底的制備：

圖1是內(nèi)嵌內(nèi)標(biāo)分子的納米粒子及其基底的制備的實(shí)驗(yàn)流程示意圖，具體制備方法是：

制備金納米棒種子：

1)0.364gctab，9.75ml超純水溶解，250ul10mm氯金酸，攪拌10min后加入0.6ml10mm硼氫化鈉攪拌2min，28攝氏度水浴放置30min。

2)7.2gctab，0.987g油酸鈉，400ml超純水溶解，20ml10mm氯金酸攪拌15min，8ml10mmagno3攪拌5min，1.2ml濃鹽酸攪拌5min，640ul0.1m抗壞血酸攪拌30s，30攝氏度水浴過(guò)夜得到金棒，金棒長(zhǎng)82nm。

取290ul濃度為3.43nm的金納米棒(長(zhǎng)約82nm，直徑約20nm)，加入一定量的濃度為0.1mm的pmba和濃度為80mm的十六烷基三甲基氯化銨(ctac)，100hz超聲振蕩1小時(shí)，然后6500rpm/min離心15min，去上清，再加1ml超純水6500rpm/min離心洗滌15min，然后加到8ml濃度為80mm的ctac溶液，60℃加熱，300r/min磁力攪拌20min，然后加入5ml濃度為2mm的硝酸銀溶液，繼續(xù)攪拌5min，再加入2ml濃度為50mm的抗壞血酸，繼續(xù)加熱攪拌3.5小時(shí)，最終溶液顏色為綠色。6500rpm/min離心15min，30ml超純水洗滌，6500rpm/min離心15min，1ml超純水重懸。

其中加入0.1mm的pmba的量為0，25ul，50ul，75ul，100ul，150ul，200ul，225ul，250ul，對(duì)應(yīng)加入的濃度為80mm的十六烷基三甲基氯化銨(ctac)體積為710ul，685ul，660ul，635ul，610ul，560ul，510ul，485ul，460ul，使加入的金納米棒、pmba、ctac三者的體積和為1ml。

圖2是不加和加入不同濃度的pmba后的紫外可見光譜，其中0-100表示的是pmba分子所占金納米棒表面積的比值0％-100％，從該譜圖可以看到，加入pmba后的紫外吸收略有藍(lán)移，但是不明顯，峰寬也無(wú)明顯變化，說(shuō)明pmba的加入并不會(huì)影響au@ag長(zhǎng)方體的合成。為了達(dá)到可觀的實(shí)驗(yàn)效果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用pmba占比為100％的銀納米粒子，即au-100％pmba@ag。

圖3是不加和加入不同濃度的pmba后的tem照片，從該圖中可以明顯的看到金棒內(nèi)核和銀殼，且粒度均一，雜顆粒少，而且加入不同比例的pmba后粒子形態(tài)均無(wú)明顯變化，再一次證明pmba的加入不會(huì)影響au@ag長(zhǎng)方體的合成。

圖4是內(nèi)嵌10％-100％pmbaau@ag長(zhǎng)方體的sers強(qiáng)度與pmba所占百分比的關(guān)系圖。由圖可知，pmba的拉曼強(qiáng)度與其占金棒表面積的百分比線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r²＝0.98366。即隨著pmba濃度的升高其sers強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)。

實(shí)施例2：

1)以au-100％pmba@ag為例，利用au-100％pmba@ag內(nèi)的pmba分子作為內(nèi)標(biāo)分子，r6g分子作為分析物分子，進(jìn)行sers定量分析檢測(cè)。

2)取290ul濃度為3.43nm的金納米棒(長(zhǎng)約82nm，直徑約20nm)，加入250ul濃度為0.1mm的pmba和460ul濃度為80mm的十六烷基三甲基氯化銨(ctac)，100hz超聲振蕩1小時(shí)，然后6500rpm離心15min，去上清，再加1ml超純水6500rpm離心洗滌15min，然后加到8ml濃度為80mm的ctac溶液，60℃加熱，300r/min磁力攪拌20min，然后加入5ml濃度為2mm的硝酸銀溶液，繼續(xù)攪拌5min，再加入2ml濃度為50mm的抗壞血酸，繼續(xù)加熱攪拌3.5小時(shí)，最終溶液顏色為綠色。6500rpm/min離心15min，30ml超純水洗滌，6500rpm/min離心15min，沉淀轉(zhuǎn)移到3mlpvp乙醇溶液，超聲3h，6500rpm/min離心15min，4ml無(wú)水乙醇洗滌，6500rpm/min離心15min，1ml無(wú)水乙醇重懸。重復(fù)制備12個(gè)。

3)在1)中制備好的12個(gè)au-100％pmba@ag溶膠中分別加入不同量的r6g,使終濃度分別為100nm，90nm，70nm，50nm，30nm，10nm，4.8nm，2.4nm，1.2nm，0.6nm，0.3nm，0.15nm。100hz超聲2h，過(guò)夜，使r6g分子充分吸附到au-100％pmba@ag納米粒子表面。6000rpm/min離心10min,1ml乙醇洗滌，6000rpm/min離心10min，洗去游離的r6g分子，500ul乙醇重懸。

4)將2)準(zhǔn)備好的樣品進(jìn)行sers檢測(cè)。

圖5(1)是r6g分子在au-pmba@ag長(zhǎng)方體溶膠外中的校正前拉曼強(qiáng)度與濃度的關(guān)系圖r²＝89.237。由圖可知，校正前r6g分子的拉曼強(qiáng)度與濃度的線性關(guān)系并不強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)只有r²＝89.237，而校正后(圖5(2))其線性相關(guān)性很強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)r²＝0.99633，即使r6g分子的濃度跨度很大線性相關(guān)性也還很好。說(shuō)明au-100％pmba@ag溶膠用于定量分析具有可行性和可靠性。

實(shí)施例3：

1)取290ul濃度為3.43nm的金納米棒(長(zhǎng)約82nm，直徑約20nm)，加入250ul濃度為0.1mm的pmba和460ul濃度為80mm的十六烷基三甲基氯化銨(ctac),100hz超聲振蕩1小時(shí)，然后6500rpm離心15min，去上清，再加1ml超純水6500rpm離心洗滌15min，然后加到8ml濃度為80mm的ctac溶液，60℃加熱，300r/min磁力攪拌20min，然后加入5ml濃度為2mm的硝酸銀溶液，繼續(xù)攪拌5min，再加入2ml濃度為50mm的抗壞血酸，繼續(xù)加熱攪拌3.5小時(shí)，最終溶液顏色為綠色。6500rpm/min離心15min，30ml超純水洗滌，6500rpm/min離心15min，沉淀轉(zhuǎn)移到3mlpvp乙醇溶液，超聲3h，6500rpm/min離心15min，4ml無(wú)水乙醇洗滌，6500rpm/min離心15min，250ul無(wú)水乙醇重懸。

2)au-100％pmba@ag長(zhǎng)方體納米粒子單層基底制備

上述制備好的au-100％pmba@ag長(zhǎng)方體納米粒子250ul，加入250ul環(huán)己烷和250ul二氯甲烷均勻混合，然后取200ul混合溶液于1ml離心管，并加入10ul辛烷混合，滴加于直徑2cm的水面上，待有機(jī)相完全揮發(fā)后，干凈的硅片沉于液面下之后，通過(guò)提拉硅片將液面上的銀納米棒的膜轉(zhuǎn)移到硅片表面。組裝基底的sem表征見圖6(2)。

au-100％pmba@ag長(zhǎng)方體納米粒子單層基底sers表征：

將上述組裝好基底置于共焦拉曼光譜顯微鏡上進(jìn)行sers成像。成像面積20×20μm²，掃描步長(zhǎng)2μm，激發(fā)光532nm，激發(fā)功率4.4mw，積分時(shí)間1s，激發(fā)和信號(hào)收集物鏡10倍na值0.25。sers基底的mapping成像見圖6(3)，mapping各點(diǎn)的sers光譜見圖6(4)。sersmapping和所有譜圖1080波數(shù)峰強(qiáng)度的相對(duì)誤差分析證明組裝的銀長(zhǎng)方體基底具有很好的增強(qiáng)均勻性。

實(shí)施例4：

1)單層基底制備如實(shí)施案例3所述。

2)au-100％pmba@ag長(zhǎng)方體納米粒子單層基底定量分析：

將上述制備好的基底泡于濃度分別為10nm、30nm、50nm、70nm、90nm和100nm的r6g乙醇溶液中過(guò)夜，取出自然晾干，置于共焦拉曼光譜顯微鏡上進(jìn)行sers成像，成像面積20x20μm²，掃描步長(zhǎng)2μm，激發(fā)光532nm，激發(fā)功率4.4mw，積分時(shí)間1s，激發(fā)和信號(hào)收集物鏡10倍na值0.25。計(jì)算r6g610cm^-1sers強(qiáng)度與內(nèi)標(biāo)分子pmba1080cm^-1sers強(qiáng)度的比值并做出與r6g濃度的關(guān)系圖，見圖7，其中圖7(1)是內(nèi)標(biāo)分子pmba在不同r6g濃度下的sers強(qiáng)度，由圖可知pmba的sers強(qiáng)度變化不大，保持相對(duì)穩(wěn)定。圖7(2)是r6g的sers強(qiáng)度未經(jīng)內(nèi)標(biāo)分子校正時(shí)的關(guān)系圖，r²＝0.97581，圖7(3)是r6g的sers強(qiáng)度經(jīng)內(nèi)標(biāo)分子校正后的關(guān)系圖r²＝0.99161，說(shuō)明銀的長(zhǎng)方體單層基底也具有一定的定量分析作用。