本發(fā)明涉及b族維生素的定量檢測領域，具體涉及一種超高效液相色譜測定b族維生素的方法。

背景技術：

b族維生素也叫乙族維生素，也叫維他命b、維生素b族或維生素b復合群，主要包括維生素b1、維生素b2、維生素b6、維生素b12、煙酸、泛酸、葉酸等。b族維生素是維持人體正常機能與代謝活動不可或缺的水溶性維生素，它們推動體內(nèi)代謝，把糖、脂肪、蛋白質(zhì)等轉(zhuǎn)化成熱量。如果缺少維生素b，則細胞功能馬上降低，引起代謝障礙，這時人體會出現(xiàn)怠滯和食欲不振。b族維生素廣泛存在于米糠、麩皮、酵母、動物的肝臟、粗糧蔬菜等食物中，但由于食用方法不對，幾乎攝取不到。而人體卻無法自行制造合成維生素b，所以必須額外補充。

b族維生素的測定方法包括熒光法、微生物法、分光光度法、自動測定法、高壓液相色譜法和高效毛細管電泳法等。這些方法多數(shù)是針對某個單一維生素的測定，近年來國內(nèi)外學者對多種b族維生素的同時測定進行了大量研究，出現(xiàn)了許多分析方法，其中以高效液相色譜法和高效毛細管電泳法為代表的色譜分析法較為突出。目前，水溶性維生素種類多、結(jié)構復雜、分析測定困難。

技術實現(xiàn)要素：

為解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種超高效液相色譜測定b族維生素的方法，該方法測定水溶性成分效果較好。

本發(fā)明是通過下述技術方案來解決上述技術問題的：

一種超高效液相色譜測定b族維生素的方法，包括以下步驟：

一、分別稱取相同質(zhì)量的維生素b1、維生素b2標準品于25ml棕色容量瓶中，加入鹽酸溶液并充分振蕩，于超聲波儀中超聲一段時間，待全部溶解后，用0.01mol/l鹽酸溶液定容，即得儲備液a；

二、分別稱取相同質(zhì)量的維生素b6、維生素b12標準品于25ml棕色容量瓶中，先用naoh溶液溶解后，再加0.01mol/l鹽酸溶液定容，于超聲波儀中超聲一段時間，待全部溶解后，即得儲備液b；

三、分別吸取一定量的儲備液a和儲備液b配成不同系列的濃度，于離心管中配成0.05g/ml～2g/ml濃度的混標溶液，進樣，以峰面積對質(zhì)量濃度繪制標準曲線；

四、準確稱取樣品后置于錐形瓶中，用0.1％甲酸水溶解，于超聲波儀中超聲提取一段時間后，加入丙酸鋅和鐵氰化鉀溶液混勻，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移至容量瓶中用0.1％甲酸定容，混勻，濾紙過濾，取濾液用濾膜處理，待上機；

五、使用超高效液相色譜測定樣品中的水溶性維生素。

優(yōu)選的，步驟一中儲備液a具體通過以下步驟制得：分別準確稱取5mg維生素b1、維生素b2標準品于25ml棕色容量瓶中，加入15ml濃度為0.01mol/l鹽酸溶液并充分振蕩，超聲10min，待全部溶解后，用0.01mol/l鹽酸溶液定容，即得濃度為0.2mg/ml的儲備液a。

優(yōu)選的，步驟二中儲備液b具體通過以下步驟制得：分別準確稱取3.75mg維生素b6、維生素b12標準品于25ml棕色容量瓶中，先用1.5ml濃度為2mol/l的naoh溶液溶解后，再加0.01mol/l鹽酸溶液定容，超聲10min，即得濃度為0.15mg/ml得儲備液b。

優(yōu)選的，步驟三中進樣量為0.8-1.2μl。

優(yōu)選的，步驟四中稱取樣品質(zhì)量為5-10g。

優(yōu)選的，準確稱取樣品后經(jīng)過以下步驟處理：用35-40ml0.1％甲酸水溶解，于超聲波儀中超聲提取90min，然后，加入丙酸鋅和鐵氰化鉀溶液混勻，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中用0.1％甲酸定容，混勻，濾紙過濾，取濾液濾膜用0.22mm水系濾膜處理。

優(yōu)選的，步驟五中超高效液相色譜分析條件為：

流動相a：乙腈；流動相b：0.1％甲酸；柱溫20℃；紫外檢測器，波長275nm；進樣體積5l；流速0.2-0.3ml/min，梯度洗脫，運行時間10min。

本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明采用超高效液相色譜(uplc)可快速完成對4種水溶性維生素b的測定，具有良好的準確度、精密度。測定結(jié)果與國標法測定數(shù)據(jù)比較，結(jié)果均在允許范圍內(nèi)，可對較寬濃度范圍內(nèi)的小麥多種水溶性維生素進行同步分析，有助于提高小麥檢測的分析效率。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施例部分予以詳細說明。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例一種維生素混標的超高效液相色譜圖；

圖2為本發(fā)明實施例一中小麥樣品的超高效液相色譜圖。

具體實施例

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

以下實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行，所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例一

本實施例提供了一種超高效液相色譜測定b族維生素的方法，包括以下步驟：

一、維生素標準儲備液的配制

分別準確稱取5mg維生素b1、維生素b2標準品于25ml棕色容量瓶中，加入15ml濃度為0.01mol/l鹽酸溶液并充分振蕩，超聲10min，待全部溶解后，用0.01mol/l鹽酸溶液定容，即得濃度為0.2mg/ml的儲備液a。

分別準確稱取3.75mg維生素b6及維生素b12標準品于25ml棕色容量瓶中，先用1.5ml濃度為2mol/l的naoh溶液溶解后，再加0.01mol/l鹽酸溶液定容，超聲10min，即得濃度為0.15mg/ml的儲備液b，低溫避光保存。

二、超高效液相色譜(uplc)分析條件

流動相a：乙腈；流動相b：0.1％甲酸；柱溫20℃；紫外檢測器，波長275nm；進樣體積5l；流速0.2ml/min，梯度洗脫，運行時間10min。

三、工作曲線的繪制

分別吸取一定量的儲備液a和儲備液b配成不同系列的濃度，于2ml離心管中，配成0.05g/ml濃度的混標溶液。按照上述條件進樣，進樣量為1.2μl，以峰面積對質(zhì)量濃度繪制標準曲線。得到4種維生素的線性方程并以3倍信噪比計算相應的檢出限。

以標準溶液濃度為橫坐標c，峰面積為縱坐標y，得到回歸方程。4種水溶性維生素均具有良好的線性，相關系數(shù)r2>0.99，滿足檢測需要。方法的線性回歸方程、相關系數(shù)及檢出限，結(jié)果見表1。在本試驗方法所確定的實驗條件下，取一系列標準溶液進行超高效液相色譜測定，以峰面積y對濃度c(ng/ml)做圖，找出線性關系。并確定方法最低檢測限。

表1四種維生素的標準曲線

四、樣品預處理方法

準確稱取5g小麥(精確至0.01g)于150ml錐形瓶，用35ml0.1％甲酸水溶解，超聲提取90min后，加入丙酸鋅和鐵氰化鉀溶液混勻，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中用0.1％甲酸定容，混勻，濾紙過濾，取濾液用0.22mm水系濾膜處理，樣品譜圖見圖1。從圖1中可以看出乙腈-0.1％甲酸為流動相分離效果較好，各維生素b的出峰順序為：維生素b1：0.520min、維生素b6:0.990min、維生素b12:5.572min、維生素b2:6.019min。

五、實際樣品檢測

分別用所建立的超高效液相色譜(uplc)法測定小麥樣品中的水溶性維生素，得到的實際測定數(shù)據(jù)與國標法實測值比較，圖2中的結(jié)果表明相對誤差在1.5％～2.1％，均在允許范圍內(nèi)，說明此法測得的小麥樣品的數(shù)據(jù)準確可靠，適用于小麥及谷物中水溶性維生素的同時測定。小麥中維生素b1、維生素b2、維生素b6、維生素b12的含量分別為：1233.836μg/100g樣品、326.192μg/100g樣品、1759.678μg/100g樣品、724.678μg/100g樣品。

實施例二

本實施例與實施例一的不同點是：步驟二中所述流動相a的流速為0.3ml/min，其他與實施例一相同。

實施例三

本實施例與實施例一或?qū)嵤├坏牟煌c是：步驟三中所述混標溶液的濃度為2g/ml，進樣量為0.8μl，其他與實施例一或?qū)嵤├幌嗤?/p>

實施例四

本實施例與實施例一至三之一的不同點是：步驟四中所述小麥的質(zhì)量為10g，所述甲酸的體積為40ml，其他與實施一至三之一相同。

本發(fā)明采用超高效液相色譜(uplc)可快速完成對4種水溶性維生素b的測定，具有良好的準確度、精密度。測定結(jié)果與國標法測定數(shù)據(jù)比較，結(jié)果均在允許范圍內(nèi)，可對較寬濃度范圍內(nèi)的小麥多種水溶性維生素進行同步分析，有助于提高小麥檢測的分析效率。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施例，基于本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都應當屬于本發(fā)明保護的范圍。應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。