本發(fā)明涉及一種檢測(cè)氯氰菊酯的時(shí)間分辨熒光試紙條及其應(yīng)用，屬于時(shí)間分辨熒光免疫分析(trfia)
技術(shù)領(lǐng)域：
，用于蘋果、玉米、黃瓜、西紅柿、菠菜、白菜等樣品中氯氰菊酯的含量檢測(cè)。
背景技術(shù)：
：氯氰菊酯，又名興棉寶、滅百可、賽波凱，是一種合成的除蟲菊精類，對(duì)于昆蟲是一種速效神經(jīng)毒素。氯氰菊酯的工業(yè)品為黃色至棕色粘稠固體，60℃時(shí)為粘稠液體。動(dòng)物急性中毒表現(xiàn)為共濟(jì)失調(diào)，步態(tài)不穩(wěn)，偶有震顫，同時(shí)具有慢性毒性，對(duì)皮膚粘膜亦有刺激作用。隨著該農(nóng)藥的應(yīng)用日益廣泛，必然會(huì)造成對(duì)蔬菜及其他作物的污染。因此，我國(guó)相關(guān)質(zhì)檢部門對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行了限量規(guī)定。gb2763-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定了氯氰菊酯的最大殘留限量：谷物(部分)0.3mg/kg，大豆和玉米0.05mg/kg，蔬菜中菠菜、普通白菜、萵苣和大白菜均為2mg/kg，水果中橙、檸檬、柚、蘋果、梨、核果類(桃除外)和枸杞均為2mg/kg，柑橘、桃和榴蓮均為1mg/kg。目前，檢測(cè)氯氰菊酯的方法有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法等。儀器檢測(cè)方法的精確度較高，但是儀器昂貴，需要專業(yè)的技術(shù)人員，檢測(cè)步驟復(fù)雜，難以批量檢測(cè)樣品，不適用于基層實(shí)驗(yàn)室批量、快速檢測(cè)樣品。而免疫學(xué)檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏，可同時(shí)檢測(cè)多數(shù)樣品，是理想的快速篩選手段。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、成本低、檢測(cè)時(shí)間短的氯氰菊酯時(shí)間分辨熒光試紙條。本發(fā)明所提供了一種氯氰菊酯時(shí)間分辨熒光試紙條，該試紙條包括樣品吸收墊、反應(yīng)膜以及吸水墊三部分。反應(yīng)膜位于中間，樣品吸收墊與吸水墊分別搭接于反應(yīng)膜左右兩端。其中，樣品吸收墊上設(shè)有加樣區(qū)和微球區(qū)，微球區(qū)上載有時(shí)間分辨熒光微球；反應(yīng)膜上設(shè)有檢測(cè)線(t線)和質(zhì)控線(c線)，t線接上包被氯氰菊酯抗原，c線包被抗兔抗體。所述氯氰菊酯時(shí)間分辨熒光微球，包括檢測(cè)微球和質(zhì)控微球，檢測(cè)微球?yàn)楸砻姘挥新惹杈挣慰寺】贵w的熒光微球，質(zhì)控微球?yàn)楸砻姘挥型每箻?biāo)記蛋白的熒光微球。所述熒光微球中填充了斕系元素化合物；較優(yōu)的，該斕系元索鰲合物為銪鰲合物；最優(yōu)的，該銪鰲合物可為eu(tta)3/topo或eu(tta)3/phen。所述蛋白可以是牛血清y-球蛋白(bgg)或小牛血清白蛋白(bsa)。所述時(shí)間分辨熒光微球粒徑范圍為100-1000nm。所述硝酸纖維素膜上，t線上包被的抗體為氯氰菊酯抗原，c線上包被的抗兔抗體。所述氯氰菊酯時(shí)間分辨熒光免疫定量檢測(cè)試紙條底部設(shè)有塑料底板。所述t線接上包被氯氰菊酯抗原是由氯氰菊酯半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白。所述氯氰菊酯單克隆抗體是以氯氰菊酯半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原制備獲得，是由氯氰菊酯單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株分泌獲得；所述抗兔抗體是將兔源抗體免疫羊得到。所述樣品吸收墊為fusion5膜或其他功能相同的膜；所述結(jié)合物釋放墊可為玻璃棉或聚酯材料；所述吸水墊為吸水墊；所述反應(yīng)膜可為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備上述試紙條的方法，其包括步驟：(1)質(zhì)控微球制備：①用生物素標(biāo)記蛋白；②采用上述標(biāo)記蛋白包被醛基修飾的熒光微球；(2)半抗原制備：經(jīng)過(guò)一系列化學(xué)反應(yīng)得到氯氰菊酯半抗原產(chǎn)物；(3)將氯氰菊酯半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，得到氯氰菊酯半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物；(4)用氯氰菊酯半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物免疫新西蘭大白兔，將新西蘭大白兔脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞通過(guò)融合、篩選，得到氯氰菊酯單克隆雜交瘤細(xì)胞株；(5)提取新西蘭大白兔igg免疫健康山羊，得到抗兔抗體；(6)檢測(cè)微球制備：采用氯氰菊酯的單克隆抗體包被醛基修飾的熒光微球；(7)空白大卡粘貼：將硝酸纖維素膜粘貼在塑料底板中間，fusion5膜與吸水墊分別搭接于硝酸纖維素膜左右兩端；(8)噴膜：將兔抗標(biāo)記蛋白的熒光微球和氯氰菊酯單克隆抗體的熒光微球采用釋放緩沖液混合稀釋到一定濃度，噴到fusion5膜的微球區(qū)；氯氰菊酯抗原和抗兔抗體稀釋后，分別噴到硝酸纖維素膜的t線和c線位置；(9)干燥及切條：將上述噴好試劑的大卡烘干、切條。噴膜步驟中用到的釋放緩沖液含有10％-20％蔗糖、3％-10％海藻糖、0.5％-1％n，0-雙三甲硅基乙酰胺(bsa)，0.2％-0.5％慶大霉素。噴膜步驟稀釋后檢測(cè)微球終濃度為0.5mg/ml-2mg/ml，質(zhì)控微球終濃度0.05mg/ml-0.2mg/ml；t線抗原終濃度0.5mg/ml-2mg/ml，c線抗原終濃度0.5mg/ml-2mg/ml；c，t線噴膜液量為0.5μl/cm-1.5μl/cm，微球噴膜量為2μl/cm-8μl/cm。干燥及切條步驟中所述的烘干可在恒溫烘箱或者烘房中，37℃烘干8-12小時(shí)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種應(yīng)用上述試紙條檢測(cè)蘋果、玉米、黃瓜、西紅柿、菠菜、白菜等樣品中氯氰菊酯殘留的方法，它包括步驟：(1)樣品前處理；(2)用試紙條進(jìn)行檢測(cè)；(3)分析檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明的氯氰菊酯時(shí)間分辨熒光試紙條采用高度特異性的抗體抗原反應(yīng)及免疫層析分析技術(shù)，將氯氰菊酯單克隆抗體-時(shí)間分辨熒光標(biāo)記物固定于fusion5膜上，樣品中的氯氰菊酯在流動(dòng)過(guò)程中，與fusion5膜上的氯氰菊酯單克隆抗體-時(shí)間分辨熒光標(biāo)記物結(jié)合，形成藥物-抗體-時(shí)間分辨熒光標(biāo)記物。樣品中的藥物與反應(yīng)膜檢測(cè)線上的氯氰菊酯半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合氯氰菊酯單克隆抗體-時(shí)間分辨熒光標(biāo)記物，最終應(yīng)用免疫層析檢測(cè)儀計(jì)算待測(cè)樣品液中含有的氯氰菊酯殘留量。本發(fā)明的試紙條具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、定量檢測(cè)、成本低、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、適合各種單位使用、儲(chǔ)存簡(jiǎn)單、保質(zhì)期長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)。用本發(fā)明試紙條檢測(cè)氯氰菊酯殘留的方法簡(jiǎn)便、快速、直觀、準(zhǔn)確、適用范圍廣、成本低、易推廣使用。附圖說(shuō)明圖1為氯氰菊酯半抗原合成路線圖。圖2為氯氰菊酯半抗原核磁共振氫譜圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1氯氰菊酯檢測(cè)試紙條的制備該試紙條的制備方法主要包括以下步驟：1)制備噴涂有氯氰菊酯單克隆抗體-時(shí)間分辨熒光標(biāo)記物的樣品吸收墊；2)制備具有包被有氯氰菊酯半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測(cè)線和包被有抗兔抗體的質(zhì)控線的反應(yīng)膜；3)將1)和2)制備好的樣品吸收墊、反應(yīng)膜以及吸水墊組裝成試紙條。下面分步詳細(xì)敘述：1、氯氰菊酯半抗原的制備(1)將24.3g3-(4-硝基苯氧基)苯甲醛溶于100ml無(wú)水甲醇中，室溫?cái)嚢枞芙猓尤氲?.5g，滴加11gtmscn，滴加完畢，室溫反應(yīng)10h，蒸干溶劑，柱層析純化，得到25.65g氰基醇目標(biāo)物，收率95％。(2)將步驟一中得到的氰基醇27g加入到100ml三氯甲烷中，室溫?cái)嚢枞芙?，加入py8.5g，于室溫下滴加含有22.6g二氯菊酰氯的30ml三氯甲烷溶液。滴加完畢，室溫繼續(xù)反應(yīng)5h，蒸干溶劑，柱層析純化，得到氰基酯目標(biāo)物42.32g，收率92％。(3)將步驟二所得的氰基酯化合物46g，加入到120ml無(wú)水甲醇中，室溫溶解，倒入加氫釜中，加入pd/c3g，加1個(gè)大氣壓，室溫反應(yīng)6h，過(guò)濾除去pd/c，減壓去溶劑，得到氨基目標(biāo)物40.8g，收率95％。(4)將步驟三所得氨基化合物43g加入到200ml三氯甲烷中，室溫?cái)嚢枞芙?。加?g對(duì)甲基苯磺酸，加入琥珀酸酐12g，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過(guò)夜。蒸干溶劑，柱層析純化得到含羧基的半抗原目標(biāo)物45.6g，收率86％。由氯氰菊酯半抗原核磁共振氫譜圖可知，12.2的羧基峰、7-8的芳環(huán)峰，以及0.97的甲基峰，說(shuō)明半抗原合成成功。該方法制備的半抗原并沒有改變氯氰菊酯的結(jié)構(gòu)，而是從剛性較強(qiáng)的二芳醚結(jié)構(gòu)引出連接臂，使得氯氰菊酯的全部活性結(jié)構(gòu)都可以暴露在抗原之外，引起較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，使得到高親和力的抗體成為可能。2、免疫原的制備將133mgbsa溶于5ml0.01mpbs，攪拌溶解。氯氰菊酯半抗原與bsa比例可在1∶1～60∶1的范圍內(nèi)調(diào)整，本申請(qǐng)選擇在加入53mg氯氰菊酯半抗原(與bsa摩爾比為50∶1)，加入edc鹽酸鹽10mg，室溫?cái)嚢?h。移入透析袋中透析48h。該比例下得到氯氰菊酯免疫原可以在抗原表面暴露出更多的氯氰菊酯半抗原，從而更好地引起針對(duì)氯氰菊酯的免疫應(yīng)答。3、包被原的制備將86mgova溶于5ml0.01mpbs，攪拌溶解。氯氰菊酯半抗原與ova比例可在1∶1～40∶1的范圍內(nèi)調(diào)整，本申請(qǐng)選擇在加入42.4mg氯氰菊酯半抗原(與ova摩爾比為40∶1)，加入edc鹽酸鹽10mg，室溫?cái)嚢?h。移入透析袋中透析48h。該比例下得到氯氰菊酯包被原在與樣品中抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體時(shí)，能夠充分與抗體反應(yīng)，從而避免假陽(yáng)性，也不會(huì)因?yàn)榘辉┞段稽c(diǎn)過(guò)多，形成空間位阻，從而避免假陰性。4、氯氰菊酯單克隆抗體的制備將免疫原注入balb/c新西蘭大白兔體內(nèi)，產(chǎn)生抗血清。取免疫balb/c新西蘭大白兔脾細(xì)胞與sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選陽(yáng)性孔，得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。將雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成細(xì)胞懸液，備用。將雜交瘤細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進(jìn)行純化，得到單克隆抗體，-20℃保存。所述細(xì)胞培養(yǎng)基為向rpmi1640培養(yǎng)基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為20％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，碳酸氫鈉在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為0.2％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))；所述細(xì)胞培養(yǎng)基的ph為7.4。以羊作為免疫動(dòng)物，以兔源抗體為免疫原對(duì)無(wú)病原體羊進(jìn)行免疫，得到抗兔抗體。5、微球溶液、檢測(cè)線(t線)溶液以及質(zhì)控線(c線)溶液的制備(1)微球溶液的配置用釋放緩沖液(含有20％蔗糖、5％海藻糖、0.5％bsa，0.2％慶大霉素)將質(zhì)控微球和檢測(cè)微球配制成時(shí)間分辨熒光微球混合液，質(zhì)控微球終濃度為0.1mg/ml-0.3mg/ml，檢測(cè)微球終濃度為0.8mg/ml-1.2mg/ml。(2)檢測(cè)線(t線)溶液的配制用0.01mpb溶液將氯氰菊酯抗原復(fù)合物稀釋成0.4mg/ml-0.6mg/ml。(3)質(zhì)控線(c線)溶液的配制用0.01mpb溶液將鏈霉親和素稀釋成0.4mg/ml-0.6mg/ml。6、試紙條的制備反應(yīng)膜位于中間，樣品吸收墊與吸水紙分別搭接于反應(yīng)膜左右兩端，粘貼在帶有背膠的塑料底板上。c，t線噴膜液量為0.6μl/cm-1.2μl/cm，微球溶液噴膜量為2μl/cm-6μl/cm。將噴好試劑的氯氰菊酯大卡在恒溫烘箱中37℃烘干12小時(shí)。將烘干的氯氰菊酯大卡切割成3mm-5mm寬度的紙條，即得到氯氰菊酯試紙條。實(shí)施例2樣品中氯氰菊酯殘留的檢測(cè)1、樣品處理(1)蘋果前處理方法。用均質(zhì)器均質(zhì)樣品；稱取(2.00±0.05)g均質(zhì)后的蘋果樣品到10ml聚苯乙烯離心管中，分別加入4ml0.01mpbs，2ml甲醇，用渦旋儀渦動(dòng)5min；室溫下4000r/min離心5min；取上清液200μl，加入到800μl0.01mpbs中，充分混勻，取其50μl用于分析。(2)玉米前處理方法。用均質(zhì)器均質(zhì)樣品；稱取(2.00±0.05)g均質(zhì)后的玉米樣品到10ml聚苯乙烯離心管中，分別加入4ml10％氯化鈉，2ml甲醇，用渦旋儀振動(dòng)5min；室溫下4000r/min離心5min；取上清液100μl，加入到900μl0.01mpbs中，充分混勻，取其50μl用于分析。(3)蔬菜前處理方法。用均質(zhì)器均質(zhì)樣品；稱取(1.00±0.05)g均質(zhì)后的蔬菜樣品到10ml聚苯乙烯離心管中，加入2ml0.1mol/l硫酸，再加入5ml甲醇，用渦旋儀渦動(dòng)5min；，室溫下1000r/min離心5min；取上清液200μl，加入到800μl0.01mpbs中，充分混勻，取50μl用于分析。2、用試紙條進(jìn)行檢測(cè)(1)將試紙條和提取液恢復(fù)至室溫。(2)用移液器準(zhǔn)確吸取60μl待檢樣品，(取樣時(shí)注意不要吸入氣泡)垂直緩慢滴加于加樣孔(s)中，加樣后開始計(jì)時(shí)，加樣后8分鐘讀取結(jié)果。(3)將試劑卡插入免疫層析檢測(cè)儀的承載器中，按檢測(cè)鍵，儀器將自動(dòng)對(duì)測(cè)試卡進(jìn)行掃描。(4)從免疫層析檢測(cè)儀的顯示屏幕上讀取檢測(cè)結(jié)果。3、分析檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)限范圍：1ng/ml-30ng/ml。實(shí)施例3樣品檢測(cè)實(shí)例1、檢測(cè)限試驗(yàn)取空白蘋果/玉米/黃瓜/西紅柿/菠菜/白菜等樣品，分別添加氯氰菊酯至終濃度為0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml，取試紙條進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次。用試紙條檢測(cè)蘋果/玉米/黃瓜/西紅柿/菠菜/白菜等樣品時(shí)，根據(jù)試紙條顯示結(jié)果確定檢測(cè)限范圍，表明本試紙條檢測(cè)限范圍：1ng/ml-30ng/ml。2、樣本精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)以回收率作為準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)指標(biāo)，重復(fù)測(cè)定某一濃度樣品的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(rsd％)作為精密度評(píng)價(jià)指標(biāo)。計(jì)算公式為：回收率(％)＝實(shí)際測(cè)定值/理論值×100％，其中理論值為樣品的添加濃度；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差rsd％＝sd/x×100％，其中sd為標(biāo)準(zhǔn)偏差，x為測(cè)定數(shù)據(jù)的平均值。按1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml五個(gè)濃度氯氰菊酯分別對(duì)蘋果/玉米/黃瓜/西紅柿/菠菜/白菜等樣品進(jìn)行添加回收測(cè)定，每個(gè)樣品做4個(gè)平行，用三批不同試劑進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算樣品的平均回收率及精密度結(jié)果見下表。表1樣品精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn)以1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml五個(gè)濃度的氯氰菊酯分別對(duì)蘋果/玉米/黃瓜/西紅柿/菠菜/白菜等樣品進(jìn)行添加，平均回收率在91.1％～109.3％之間；批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15％。3、交叉反應(yīng)率試驗(yàn)選擇與氯氰菊酯具有類似結(jié)構(gòu)和類似功能的藥物進(jìn)行時(shí)間分辨熒光試紙條測(cè)定，通過(guò)各種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到其50％抑制濃度，用下式計(jì)算試劑盒對(duì)其它藥物的交叉反應(yīng)率。表2交叉反應(yīng)率試驗(yàn)藥物名稱交叉反應(yīng)率(％)氯氰菊酯100氯菊酯＜1溴氰菊酯＜1甲氰菊酯＜1聯(lián)苯菊酯＜1三氟氯氰菊酯＜1氯氟氰菊酯＜1氰戊菊酯＜1當(dāng)前第1頁(yè)12