一種快速定量檢測豬流行性腹瀉病毒的免疫熒光試紙條及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速定量檢測豬流行性腹瀉病毒的免疫熒光試紙條及其制備方 法。
【背景技術】
[0002] 豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea, PED)是由冠狀病毒科豬流行性腹 瀉病毒引起的一種侵害豬腸道的急性傳染病。能夠引起各年齡的豬發(fā)生嘔吐、腹瀉和脫 水。各年齡豬均易感，尤其是對1周齡內(nèi)的新生仔豬危害最大。新生仔豬的發(fā)病率可達 60%-100%，死亡率高達100%。導致仔豬的大批死亡，生豬出欄率下降，造成市場豬肉供應不 足，影響豬肉價格穩(wěn)定。本病在歐洲和亞洲傳播非常廣泛，每年都會給一些國家和地區(qū)造成 嚴重的經(jīng)濟損失，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的危害。2013年和2014年PEDV分別席卷了美國和 加拿大的養(yǎng)豬業(yè)。加拿大食品檢驗局（CFIA)于2014年3月份發(fā)布公告認為血漿蛋白粉有 可能是豬流行性腹瀉的罪魁禍首。因為仔豬飼料生產(chǎn)中會添加血漿蛋白粉，所以為PEDV的 大規(guī)模傳播提供了潛在的機會。為了降低飼料中攜帶PEDV病原的風險，我們急需一種簡單 快速的方法對原料中的PEDV病原進行檢測，降低飼料攜帶病原的風險；同時對疾病做出早 期診斷，提前采取防控措施，也是降低養(yǎng)殖戶因疾病帶來的損失的最好途徑。
[0003] 目前常用的檢測PEDV的方法有病毒分離鑒定、RT-PCR、ELISA法、免疫熒光法（IF) 和膠體金。其中病毒分離鑒定、RT_PCR、ELISA法、免疫熒光法（IF)必須結(jié)合實驗室方法進 行確診，操作繁瑣費時，需要專門的試驗技術人員和儀器設備，只能用于實驗室檢測。不適 合于現(xiàn)場檢測和基層獸醫(yī)工作人員的使用。另外，由于PEDV可造成持續(xù)感染，這給PEDV的 臨床檢測帶來了巨大的困難。
[0004] 關于PEDV的快速診斷試紙條我國目前還沒有同類產(chǎn)品上市，市場上有韓國進口 的PEDV膠體金檢測試紙條在銷售，但其只能進行PEDV的定性不能定量，且成本過于昂貴， 普通養(yǎng)殖戶使用不起；且其靈敏度不是很高。因此建立PEDV的快速檢測方法，用于PEDV的 感染早期和現(xiàn)場快速檢測，有利于對感染PEDV的母豬進行及時免疫，防止疾病的擴散，有 利于養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展；同時對飼料原料血漿蛋白的污染源進行質(zhì)量控制，降低從飼料途 徑造成PEDV流行的風險。以抗PEDV的納米抗體研制PEDV病原的快速檢測方法，在國內(nèi)外 尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述存在的問題，本發(fā)明通過研宄，制備了一種特異性高、靈敏度高的納 米抗體(抗PEDV單域抗體)，并基于此抗體制備了一種能夠快速定量檢測豬流行性腹瀉病毒 的免疫熒光檢測試紙條。
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種快速定量檢測豬流行性腹瀉病毒的免疫熒光試紙條。
[0007] 本發(fā)明所采取的技術方案是： 一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒的單域抗體，其氨基酸序列為如SEQ ID NO :6所示。
[0008] -種用于檢測豬流行性腹瀉病毒的單域抗體，編碼該單域抗體氨基酸序列的核苷 酸序列如SEQ ID NO :3所示。
[0009] -種快速定量檢測豬流行性腹瀉病毒的免疫熒光試紙條，包含附著于底板上且 依次緊密相連的樣品墊、結(jié)合墊、層析膜和吸水墊；所述結(jié)合墊上含有熒光微球標記的抗 PEDV單域抗體；所述層析膜上設置有一條檢測線和一條質(zhì)控線，檢測線靠近結(jié)合墊，質(zhì)控 線靠近吸水墊，檢測線上包被有抗PEDV的多克隆抗體，質(zhì)控線上包被有能與熒光微球標記 的抗PEDV單域抗體結(jié)合的蛋白； 其中所述的抗PEDV單域抗體為上述所述的單域抗體。
[0010] 進一步的，上述質(zhì)控線上包被的能與熒光微球標記的抗PEDV單域抗體結(jié)合的蛋 白為兔抗雙峰駝IgG。
[0011] 進一步的，上述樣品墊為玻璃纖維膜。
[0012] 進一步的，上述層析膜為硝酸纖維素膜。
[0013] 進一步的，上述吸水墊為吸水紙。
[0014] 進一步的，上述質(zhì)控線和檢測線之間的距離為4. 5~5. 5mm。
[0015] 進一步的，上述質(zhì)控線用0. 5~I. 5mg/mL兔抗雙峰蛇IgG進行包被，用量為1 μι/ cm 〇
[0016] 進一步的，上述檢測線用0. 8~I. 2 mg/mL抗PEDV多克隆抗體包被，用量為2μLν cm 〇
[0017] 本發(fā)明的有益效果是： 1)本發(fā)明制備的免疫熒光快速試紙技術是應用納米熒光顆粒(熒光微球標記的PEDV 單域抗體)構(gòu)建出一種可定性同時定量的快速檢測試紙。操作者無需培訓和專業(yè)知識，操作 簡單，5~10分鐘即可獲得結(jié)果，若與熒光定量儀連用，可實現(xiàn)定量檢測，同時該技術靈敏度 明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的膠體金檢測試紙技術，具有廣闊的市場前景。
[0018] 2)抗體作為免疫試紙條檢測技術的核心部分，其特異性及親和力決定了測定結(jié)果 的準確性和靈敏度。本發(fā)明采用了特定制備的高靈敏的、PEDV特異性的單域重鏈（VHH)抗 體，研制成檢測PEDV病原的快速檢測試紙，目前在國內(nèi)外均未見報道。
【附圖說明】
[0019] 圖1為實施例1中RT-PCR擴增VHH基因片段的結(jié)果圖； 圖2為SDS-PAGE檢測PEDV單域抗體的結(jié)果； 圖3為PEDV免疫熒光快速檢測試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖，其中1為塑料底板，2為樣品墊， 3為結(jié)合墊，4為硝酸纖維素膜，5為吸水紙，6為檢測線T，7為質(zhì)控線C。
【具體實施方式】
[0020] 實施例1豬流行性腹瀉病毒重鏈單域抗體的制備 1)動物免疫 在雙峰駝頸背部皮下和雙側(cè)后腿皮下進行多點接種PEDV滅活疫苗。首次免疫劑量為 ImL/頭，共2頭；7天后二免，2 mL/頭；之后間隔14天免疫一次，每次免疫4 mL，共免疫3 次，全程共免疫5次。最后一次免疫后7天采血500 mL分離淋巴細胞，提取總RNA進行下 一步實驗。
[0021] 2)單域抗體庫的構(gòu)建 設計引物擴增VHH基因片段，通過前期大量實驗研宄篩選出效果最好的引物，其序列 如下： VHH-F :5' - CCTTTCTATGCAGGCCCAGCCGGCCGCA-3'（SEQ ID NO :1); VHH-R:5' - GTTATTATTATTCAGATTATTATGCGGCC-3' （SEQ ID N0: