本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測(cè)，涉及一種血清中視黃醇結(jié)合蛋白4(rbp4)的熒光免疫層析快速檢測(cè)方法，以及基于該方法設(shè)計(jì)的試劑盒，本發(fā)明方法和所述試劑盒可以應(yīng)用于心血管疾病的診斷和研究。

背景技術(shù)：

1、隨著人口老齡化進(jìn)程的加快以及不良生活方式的流行，心血管疾病(cvd)負(fù)擔(dān)在我國(guó)持續(xù)加重。2020年的心血管健康與疾病報(bào)告顯示，心血管疾病在我國(guó)城市與農(nóng)村分別占死因的45.86％和48.00％，即每5例死亡中就有2例死于心血管疾病[中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告編寫組.中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告2022概要[j].中國(guó)循環(huán)雜志,2023,38(6):583-612]。

2、近年來，科學(xué)工作者們對(duì)視黃醇結(jié)合蛋白4(rbp4)的研究給心血管疾病診斷帶來了新的契機(jī)，視黃醇結(jié)合蛋白4是一類在血液中轉(zhuǎn)運(yùn)的視黃醇蛋白[王晨穎,程佳.視黃醇結(jié)合蛋白4與代謝綜合征[j].生理科學(xué)進(jìn)展,2018,49(06):433-437]，該蛋白負(fù)責(zé)結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)體內(nèi)的視黃醇類活性代謝物，心血管疾病是視黃醇結(jié)合蛋白4通過炎癥反應(yīng)[付鑫,張彥紅,張繼紅,等.視黃醇結(jié)合蛋白4在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用機(jī)制[j].中國(guó)老年學(xué)雜志,2013,33(23):5924-5926；aiwei?y?b,vijayalakshmi?v,bodles?am,et?al.retinol?bindingprotein?4expression?in?humans:relationship?to?insulin?resistance,inflammation,and?response?to?pioglitazone[j].j?clin?endocrinol?metab,2007(7):2590-2597；盧杰,付鑫,張繼紅,等.apoe基因敲除小鼠主動(dòng)脈腫瘤壞死因子-α/p38絲裂原活化蛋白激酶/血清核因子-κb/視黃醇結(jié)合蛋白信號(hào)通路變化研究[j].安徽醫(yī)藥,2018,22(07):1278-1282]、胰島素抵抗[huang?r,bai?x,li?x,et?al.retinol-binding?protein4activates?stra6?provoking?pancreaticβcell?dysfunction?in?type?2diabetes[j].diabetes,2020,70(2):449-463]、脂質(zhì)代謝[liu?y,chen?h,wang?j,et?al.elevatedretinol?binding?protein?4induces?apolipoprotein?b?production?and?associateswith?hypertriglyceridemia[j].journal?of?clinical?endocrinology&metabolism,2015,100(5):720-728]等途徑產(chǎn)生的，因此，血清中的視黃醇結(jié)合蛋白4水平在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵性的作用。

3、目前，視黃醇結(jié)合蛋白4的蛋白檢測(cè)試劑盒有免疫比濁法[李海劍,張婷婷.視黃醇結(jié)合蛋白膠乳增強(qiáng)免疫比濁檢測(cè)方法研究[j].中國(guó)醫(yī)療器械信息，2019,25(15):22-23]、elisa法[蔣國(guó)平,陸建兵,吳薇.糖尿病腎病患者血清視黃醇結(jié)合蛋白4水平檢測(cè)的意義[j].心腦血管病防治,2014,14(02):117-119]和膠體金免疫層析法[張芳,沈兵,范昱,等.免疫膠體金快速試紙條法檢測(cè)尿視黃醇結(jié)合蛋白4對(duì)腎移植患者腎功能不良狀態(tài)的評(píng)估價(jià)值[j].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,36(08):867-871]，其中，免疫比濁法和elisa法檢測(cè)操作繁瑣、耗時(shí)且需要專業(yè)的操作人員,上述兩種方法均不適用于床旁快速檢測(cè)及基層醫(yī)院的推廣應(yīng)用。膠體金免疫層析法因其操作簡(jiǎn)便、快速和特異性強(qiáng)，適用于諸多基層單位并能滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和臨床診斷，但該方法靈敏度較低，難以實(shí)現(xiàn)定量分析[李建武,宋春美,劉芳,等.免疫層析試紙技術(shù)及其在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用[j].食品科學(xué),2014,35(08):36-41]。而熒光免疫層析法既加入了熒光技術(shù)的高靈敏度和可定量檢測(cè)的特點(diǎn)，又結(jié)合了膠體金免疫層析技術(shù)可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，是一種新型膜技術(shù)，成為當(dāng)前免疫診斷學(xué)的研究熱點(diǎn)[周克楠,唐勇,藍(lán)彩鳳,等.呋喃唑酮代謝物單克隆抗體及其新型免疫層析檢測(cè)試紙條的制備[j].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2014,27(07):927-931]。

4、稀土鑭系元素銪-(eu-)熒光納米粒子在醫(yī)學(xué)免疫學(xué)中用于熒光免疫層析技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，例如，cn105295066a(01510808893.7)公開了一種通過溶脹法制備聚苯乙烯熒光微球的方法，包括以下步驟：將ps微球液分散于溶脹介質(zhì)中，將eu(dbm)3phen溶于溶脹劑中，然后混合在一起，進(jìn)行溶脹反應(yīng)；在適當(dāng)溫度下通過蒸發(fā)去除溶脹劑；在蒸發(fā)掉溶脹劑后對(duì)ps微球液先進(jìn)行1～15min超聲處理，再進(jìn)行稀釋；去除溶脹介質(zhì)后，獲得ps熒光微球沉淀物。據(jù)信該發(fā)明通過優(yōu)化超聲處理發(fā)生的時(shí)間，以及進(jìn)一步優(yōu)化溶脹劑類型及其用量、溶脹介質(zhì)及其濃度、eu(dbm)3phen用量等工藝條件，形成微球溶脹與eu(dbm)3phen溶脹進(jìn)微球的最佳條件，能夠制備出熒光強(qiáng)度高、單分散性好、無變形的熒光微球。

5、cn109781691a(201910151183.x)涉及一種基于聚苯乙烯納米熒光微球探針檢測(cè)氯霉素的方法，該方法步驟如下：(1)制備羧基修飾的聚苯乙烯納米顆粒；(2)制備熒光聚苯乙烯納米顆粒；(3)制備納米微球-氯霉素?zé)晒馓结槪?4)氯霉素?zé)晒庠嚰垪l構(gòu)建和檢測(cè)方法。(5)將氯霉素?zé)晒馓结樇尤氲矫笜?biāo)板孔中；(6)將待測(cè)樣品加入到步驟(5)中的酶標(biāo)板的孔中；(7)向步驟(6)的酶標(biāo)板孔中插入層析試紙條，得到檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明提高了熒光探針的穩(wěn)定性和靈敏度；據(jù)信該發(fā)明制備聚苯乙烯納米熒光微球探針，不存在eu(dbm)3phen泄露問題，構(gòu)建的氯霉素?zé)晒庠嚰垪l穩(wěn)定性好，靈敏度高，具有巨大的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

6、cn116626290a(202310607874.2)公開了一種hcg定量檢測(cè)試紙、試劑盒，涉及hcg檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。所述檢測(cè)試紙包括底板、樣品墊、nc膜和吸水紙；所述底板上依次設(shè)置樣品墊、nc膜和吸水紙，所述樣品墊和吸水紙靠近nc膜的一側(cè)均搭接在nc膜兩邊沿上；在所述nc膜上沿樣本的流經(jīng)方向依次設(shè)有一條檢測(cè)線和一條質(zhì)控線；其中，所述檢測(cè)線上包被有β-hcg單克隆抗體，所述質(zhì)控線上包被有bsa-dnp偶聯(lián)物；所述樣品墊上噴涂有量子點(diǎn)偶聯(lián)復(fù)合物qd以及熒光微球偶聯(lián)復(fù)合物eu。據(jù)信該發(fā)明在主要為量子點(diǎn)示蹤的樣品墊上加入少量偶聯(lián)hcg的熒光微球，一方面，可以增加熒光微球示蹤物對(duì)低濃度樣本的檢出率，擴(kuò)大樣本檢測(cè)范圍；另一方面，熒光微球示蹤物的添加量較低，不會(huì)造成堵膜現(xiàn)象。

7、cn114778820a(202210435654.1)公開了一種檢測(cè)泰妙菌素的時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條及其制備方法和應(yīng)用，以銪-(eu-)熒光納米粒子為示蹤物標(biāo)記泰妙菌素單克隆抗體，選擇合適的熒光微球粒徑，活化緩沖溶液的ph值，抗體稀釋液和抗體用量，制備標(biāo)記泰妙菌素單克隆抗體的時(shí)間分辨熒光微球探針，能提高時(shí)間分辨熒光微球與抗體的結(jié)合效率，促進(jìn)探針釋放，提高其檢測(cè)靈敏度，減少抗原、抗體用量，適用于檢測(cè)雞蛋、雞肉和豬肉等樣品中的泰妙菌素。據(jù)信該發(fā)明樣品前處理方法簡(jiǎn)單，對(duì)雞蛋、雞肉和豬肉等樣品中的泰妙菌素裸眼檢測(cè)限為0.5ng/ml，定量檢測(cè)限為0.07～0.13ng/ml，回收率為75.0％～101.8％，標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2％～29.5％。

8、cn106980020a(201710158012.0涉及)一種降鈣素原和c-反應(yīng)蛋白二合一測(cè)定劑盒，設(shè)有試紙卡，其特征在于所述試紙卡由下至上依次設(shè)有：pvc板、樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中結(jié)合墊上吸附有稀土eu3+熒光微球分別標(biāo)記的抗降鈣素原、抗c-反應(yīng)蛋白兩種單克隆抗體-微球偶聯(lián)復(fù)合物，所述稀土熒光微球的直徑為150nm，稀土熒光微球含稀土鑭系元素eu3+，在基態(tài)下穩(wěn)定，在337nm的激發(fā)光源作用下發(fā)射出波長(zhǎng)615nm的熒光；所述單克隆抗體為純化后混合的單克隆抗體，分別均來源于針對(duì)2-6個(gè)不同的降鈣素原和c-反應(yīng)蛋白等抗原表位的單克隆抗體細(xì)胞株。據(jù)信該發(fā)明具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

9、cn106841631a(201611165645.6)涉及一種心肌肌鈣蛋白i/n-端腦利鈉肽前體/d二聚體三合一測(cè)定劑盒及制法，設(shè)有試紙卡，其特征在于所述試紙卡由下至上依次設(shè)有：pvc板、樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中結(jié)合墊上吸附有稀土eu3+熒光微球分別標(biāo)記的抗心肌肌鈣蛋白i、抗n-端腦利鈉肽前體、抗d二聚體三種單克隆抗體-微球偶聯(lián)復(fù)合物，所述稀土熒光微球的直徑為150nm，稀土熒光微球含稀土鑭系元素eu3+，在基態(tài)下穩(wěn)定，在337nm的激發(fā)光源作用下發(fā)射出波長(zhǎng)615nm的熒光；所述單克隆抗體為純化后混合的單克隆抗體，分別均來源于針對(duì)2-6個(gè)不同的心肌肌鈣蛋白i、n-端腦利鈉肽前體、d二聚體等抗原表位的單克隆抗體細(xì)胞株。據(jù)信該發(fā)明具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

10、cn106841631a(201611165645.6)涉及一種心肌肌鈣蛋白i/n-端腦利鈉肽前體/d二聚體三合一測(cè)定劑盒及制法，設(shè)有試紙卡，其特征在于所述試紙卡由下至上依次設(shè)有：pvc板、樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中結(jié)合墊上吸附有稀土eu3+熒光微球分別標(biāo)記的抗心肌肌鈣蛋白i、抗n-端腦利鈉肽前體、抗d二聚體三種單克隆抗體-微球偶聯(lián)復(fù)合物，所述稀土熒光微球的直徑為150nm，稀土熒光微球含稀土鑭系元素eu3+，在基態(tài)下穩(wěn)定，在337nm的激發(fā)光源作用下發(fā)射出波長(zhǎng)615nm的熒光；所述單克隆抗體為純化后混合的單克隆抗體，分別均來源于針對(duì)2-6個(gè)不同的心肌肌鈣蛋白i、n-端腦利鈉肽前體、d二聚體等抗原表位的單克隆抗體細(xì)胞株。據(jù)信該發(fā)明具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

11、cn106596980a(201611161198.7)涉及一種β-人絨毛膜促性腺激素測(cè)定試劑盒及制作方法，設(shè)有試紙卡，其特征在于所述試紙卡由下至上依次設(shè)有：pvc板、樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中結(jié)合墊上吸附有稀土eu3+熒光微球標(biāo)記的β-人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體，所述稀土熒光微球的直徑為150nm，稀土熒光微球含稀土鑭系元素eu3+，在基態(tài)下穩(wěn)定，在337nm的激發(fā)光源作用下發(fā)射出波長(zhǎng)615nm的熒光；所述單克隆抗體為純化后混合的單克隆抗體，來源于針對(duì)2-6個(gè)不同的β-人絨毛膜促性腺激素抗原表位的單克隆抗體細(xì)胞株，據(jù)信該發(fā)明具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

12、cn106645730a(201611162009.8)涉及一種脂蛋白相關(guān)磷脂酶a2測(cè)定試劑盒及制作方法，設(shè)有試紙卡，其特征在于所述試紙卡由下至上依次設(shè)有：pvc板、樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中結(jié)合墊上吸附有稀土eu3+熒光微球標(biāo)記的脂蛋白相關(guān)磷脂酶a2單克隆抗體，所述稀土熒光微球的直徑為150nm，稀土熒光微球含稀土鑭系元素eu3+，在基態(tài)下穩(wěn)定，在337nm的激發(fā)光源作用下發(fā)射出波長(zhǎng)615nm的熒光；所述單克隆抗體為純化后混合的單克隆抗體，來源于針對(duì)2-6個(gè)不同的脂蛋白相關(guān)磷脂酶a2抗原表位的單克隆抗體細(xì)胞株，據(jù)信該發(fā)明具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

13、cn106959372a(201710157299.5)公開了一種血清淀粉樣蛋白a和c-反應(yīng)蛋白二合一測(cè)定劑盒，設(shè)有試紙卡，其特征在于所述試紙卡由下至上依次設(shè)有：pvc板、樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中結(jié)合墊上吸附有稀土eu3+熒光微球分別標(biāo)記的抗血清淀粉樣蛋白a、抗c-反應(yīng)蛋白兩種單克隆抗體-微球偶聯(lián)復(fù)合物，所述稀土熒光微球的直徑為150nm，稀土熒光微球含稀土鑭系元素eu3+，在基態(tài)下穩(wěn)定，在337nm的激發(fā)光源作用下發(fā)射出波長(zhǎng)615nm的熒光；所述單克隆抗體為純化后混合的單克隆抗體，分別均來源于針對(duì)2-6個(gè)不同的血清淀粉樣蛋白a和c-反應(yīng)蛋白抗原表位的單克隆抗體細(xì)胞株。據(jù)信該發(fā)明具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)

14、cn115494234a(202211233965.6)公開一種b型利鈉肽檢測(cè)試劑盒，采用熒光免疫層析原理，檢測(cè)人血清、血漿和全血中的b型利鈉肽的含量，臨床上主要用于心力衰竭的輔助診斷，通過采用稀土納米熒光微球標(biāo)記抗體，且稀土配合物為eu(hfpd)3phen，據(jù)信該發(fā)明具有背景低，發(fā)光壽命長(zhǎng)，熒光信號(hào)強(qiáng)，信噪比高等優(yōu)勢(shì)，熒光微球表面被活化后，與抗體上的游離氨基反應(yīng)，形成共價(jià)鍵，可穩(wěn)定保存，具有檢測(cè)范圍框、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、檢測(cè)快速簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，可用于快速檢測(cè)。

15、cn113588962a(202110876355.7)公開了一種基于熒光免疫定量試紙條檢測(cè)伏馬毒素b1的方法，屬于免疫分析快速檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。發(fā)明所述的方法包括如下步驟：(1)樣品前處理：在待測(cè)物中加入提取液進(jìn)行提取，得到提取液；(2)將eu3+-熒光微球標(biāo)記的伏馬毒素b1單克隆抗體eu-fb1-mab和提取液混合均勻，孵育，得到待測(cè)溶液；(3)將待測(cè)溶液加入熒光免疫定量試紙條的樣品墊上進(jìn)行層析，然后測(cè)試熒光免疫定量試紙條上t線的熒光強(qiáng)度值；(4)將t線的熒光強(qiáng)度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測(cè)物中伏馬毒素b1的濃度。據(jù)信該發(fā)明的方法中采用的熒光免疫定量試紙條具有靈敏度高、成本低廉、操作簡(jiǎn)便、快速定量檢測(cè)、穩(wěn)定性好，市場(chǎng)前景廣闊，易推廣使用。

16、cn115856290a(202211613222.1)公開了一種用于檢測(cè)鈣結(jié)合蛋白a9的熒光免疫定量試紙條及其檢測(cè)方法與應(yīng)用，屬于免疫分析快速檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。為解決常規(guī)結(jié)合蛋白a9的檢測(cè)方法耗時(shí)時(shí)間長(zhǎng)，過程繁瑣等技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)鈣結(jié)合蛋白a9的熒光免疫定量試紙條，該試紙條的硝酸纖維素膜上設(shè)有涂有鈣結(jié)合蛋白a9單克隆抗體溶液的檢測(cè)線和涂有羊抗鼠二抗溶液的質(zhì)控線，結(jié)合墊上涂有熒光微球標(biāo)記的鈣結(jié)合蛋白a9單克隆抗體eu-s100a9-mab。據(jù)信該發(fā)明的熒光免疫定量試紙條具有靈敏度高、成本低廉、操作簡(jiǎn)便、快速定量檢測(cè)、穩(wěn)定性好，市場(chǎng)前景廣闊，易推廣使用等優(yōu)點(diǎn)。

17、此外，本領(lǐng)域還公開了一些檢測(cè)視黃醇結(jié)合蛋白4的方法。例如，cn102650642a(201210141597.2)涉及檢測(cè)人視黃醇結(jié)合蛋白4的抗體復(fù)合物及免疫層析檢測(cè)卡，將人視黃醇結(jié)合蛋白4單克隆抗體1與膠體金顆粒連接，得到的抗體復(fù)合物用來制備人視黃醇結(jié)合蛋白4疫層析檢測(cè)卡和試劑盒，據(jù)信該發(fā)明具有靈敏度好，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

18、cn108318695a(201810087161.7)涉及人視黃醇結(jié)合蛋白膠體金免疫層析定量檢測(cè)試紙卡及其臨床應(yīng)用。本發(fā)明制備了多種人視黃醇結(jié)合蛋白抗體，并進(jìn)行配對(duì)篩選，最終獲得了靈敏度及特異性均能滿足需求的抗體組合(b08及b14)；同時(shí)其方便大量生產(chǎn)，可滿足日后大規(guī)模臨床應(yīng)用的需求。據(jù)信該發(fā)明對(duì)上述抗體組合進(jìn)行檢測(cè)體系的調(diào)試優(yōu)化工作，獲得操作簡(jiǎn)便，靈敏度，特異性及相關(guān)檢測(cè)性能可滿足人臨床樣本檢測(cè)的人視黃醇結(jié)合蛋白的膠體金定量檢測(cè)卡，并可滿足人血液或尿液樣本的臨床檢測(cè)。

19、cn106290911a(201610669678.8)公開了一種采用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法測(cè)定中視黃醇結(jié)合蛋白(rbp)含量的試劑盒。試劑盒包括校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、抗試劑、磁微粒試劑、發(fā)光底物；其中抗試劑異硫氰酸熒光素標(biāo)記的視黃醇結(jié)合蛋白包被抗體和堿性磷酸酶標(biāo)記的視黃醇結(jié)合蛋白標(biāo)記抗體；磁微粒試劑為磁微粒與羊抗fitc連接物。據(jù)信該發(fā)明將化學(xué)發(fā)光技術(shù)與免疫磁微粒相結(jié)合，提供了一種接近均相的反應(yīng)體系，并且采用了一步法反應(yīng)模式，使得檢測(cè)靈敏度、精密性大大提高、檢測(cè)范圍擴(kuò)大，反應(yīng)時(shí)間大大縮短，從開始加樣到檢測(cè)結(jié)果，時(shí)間少于25min，明顯快于同類試劑盒；并且可以在全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀上同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣本，實(shí)現(xiàn)視黃醇結(jié)合蛋白的高通量快速化測(cè)定，準(zhǔn)確度高，特異性強(qiáng)，精確度和檢測(cè)效率有了較大的提高。

20、然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員在使用eu3+羧基熒光微球建立熒光免疫層析檢測(cè)視黃醇結(jié)合蛋白4的方法時(shí)，仍然存在諸多需要改進(jìn)的方面。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)視黃醇結(jié)合蛋白4的熒光免疫層析法，尤其是建立一種血清中視黃醇結(jié)合蛋白4的熒光免疫層析快速檢測(cè)方法，期待該方法能夠應(yīng)用于心血管疾病的診斷研究。尤其是，本發(fā)明的目的在于提供一種采用eu3+羧基熒光微球與抗體氨基進(jìn)行偶聯(lián)的標(biāo)記方式，建立熒光免疫層析檢測(cè)視黃醇結(jié)合蛋白4的方法，期待通過該方法構(gòu)建的檢測(cè)試劑盒可用于探究血清視黃醇結(jié)合蛋白4水平與心血管疾病的相關(guān)性，為疾病的評(píng)估提供一種全新手段。

2、為此，本發(fā)明第一方面提供一種測(cè)定血清中的視黃醇結(jié)合蛋白4水平的方法，包括如下步驟：

3、(1)熒光免疫微球的制備：

4、取50μl的eu3+羧基熒光微球用1ml的mes溶液混勻清洗2次后，清洗后的微球用該mes溶液定容至50μl，加入10mg/ml?edc和10mg/ml?nhs的混合液(edc：nhs＝1:3)37.5μl，30℃130r/min振蕩活化15min；

5、超聲分散后，用1ml?10mg/ml?mes溶液重復(fù)清洗兩次后，加10.5μg標(biāo)記抗體，37℃130r/min震蕩標(biāo)記2h；

6、再加100μl封閉液，130r/min振蕩1h進(jìn)行封閉；

7、封閉結(jié)束后，加入終洗液1ml，清洗3次，微球用終洗液定容至50μl，4℃條件下保存?zhèn)溆茫?/p>

8、(2)試紙盒的構(gòu)建：

9、取空白試紙條，撕掉pvc背板上覆蓋的膠條，貼上nc膜，nc膜上的t線和c線分別用0.8mg/ml的包被抗體和0.6mg/ml的羊抗鼠抗體包被，噴液量為1μl/cm，37℃烘干1h；

10、取制備好的熒光免疫微球5μl，按照1:150:150的比例加入微球稀釋液和純化水，混勻，涂在結(jié)合墊上，37℃干燥2h。另將樣品墊用處理液浸泡3min后，37℃烘干3h；

11、按照樣品墊、結(jié)合墊、包被有t線、c線的nc膜和吸水紙的順序組裝卡條，裁成4.0cm寬的試紙條，組裝，放入鋁箔袋(含干燥劑)密封保存，將其與pbs緩沖液一起置于試劑盒中，作為用于測(cè)定血清中的視黃醇結(jié)合蛋白4水平的試劑盒；

12、(3)使用試劑盒測(cè)定血清中rbp4濃度：

13、取100μl血清樣本用pbs緩沖液稀釋500倍后點(diǎn)樣，15min后，用熒光免疫層析分析儀檢測(cè)質(zhì)控線與檢測(cè)線的熒光強(qiáng)度比值(t/c值)，計(jì)算血清中rbp4濃度。

14、根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述微球稀釋液中包含：0.25％～0.55％的tris、1％～2％的bsa、0.5％～1.5％的s9、4％～6％的海藻糖。

15、根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述微球稀釋液中包含：0.25％的tris、1％的bsa、1％的s9、5％海藻糖。

16、根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述微球稀釋液中包含：0.25％的tris、1％的bsa、0.5％的s9、44％的海藻糖。

17、根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述微球稀釋液中包含：0.25％的tris、1.5％的bsa、1.5％的s9、5％的海藻糖。

18、根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述微球稀釋液中包含：0.25％的tris、2％的bsa、1％的s9、6％的海藻糖。

19、根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述微球稀釋液中包含：0.4％的tris、1％的bsa、1.5％的s9、6％的海藻糖。

20、根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述微球稀釋液中包含：0.4％的tris、1.5％的bsa、1％的s9、4％的海藻糖。

21、根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述微球稀釋液中包含：0.4％的tris、2％的bsa、0.5％的s9、5％的海藻糖。

22、根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述微球稀釋液中包含：0.55％的tris、1％的bsa、1％的s9、5％的海藻糖。

23、根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述微球稀釋液中包含：0.55％的tris、1.5％的bsa、0.5％的s9、6％的海藻糖。

24、根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述微球稀釋液中包含：0.55％的tris、2％的bsa、1.5％的s9、4％的海藻糖。

25、根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中還可另外通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算血清中rbp4濃度。

26、根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中還可另外通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算血清中rbp4濃度，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線是如下方式建立的：取濃度為600、300、150、75、37.5ng/ml的rbp4質(zhì)控品，每個(gè)濃度進(jìn)行3次檢測(cè)，以濃度和t/c的對(duì)數(shù)分別作為橫縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

27、根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中還可另外通過精密度的測(cè)定驗(yàn)證方法學(xué)性能，所述精密度是如下方式測(cè)定的：隨機(jī)抽取3個(gè)批次的試劑盒，分別以300、75ng/ml的rbp4質(zhì)控品點(diǎn)樣，各濃度重復(fù)檢測(cè)10次，計(jì)算3個(gè)批次批內(nèi)和批間重復(fù)性cv。

28、根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中還可另外通過準(zhǔn)確度的測(cè)定驗(yàn)證方法學(xué)性能，所述準(zhǔn)確度是如下方式測(cè)定的：采用基質(zhì)血清作為稀釋液，將rbp4抗原稀釋至300、75、37.5ng/ml為預(yù)測(cè)濃度，用所述4試劑盒進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試結(jié)果為實(shí)測(cè)濃度，按如下公式計(jì)算：

29、回收率＝(實(shí)測(cè)濃度/預(yù)測(cè)濃度)×100％。

30、根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中還可另外通過靈敏度的測(cè)定驗(yàn)證方法學(xué)性能，所述靈敏度是如下方式測(cè)定的：采用空白稀釋液進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)檢測(cè)20次，檢測(cè)結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(sd)，得出均值+2sd，即為最低檢出量，能反映試劑盒的靈敏度。

31、根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中還可另外通過特異性的測(cè)定驗(yàn)證方法學(xué)性能，所述特異性是如下方式測(cè)定的：將0.1ml?10mm?pbs添加至1ml高濃度和低濃度質(zhì)控品作為對(duì)照樣本，將0.1ml干擾物溶液(3850μmol/l膽紅素、440mmol/l甘油三酯、22g/l血紅蛋白)添加至1ml高濃度和低濃度質(zhì)控品作為干擾樣本，每個(gè)樣本檢測(cè)3次，計(jì)算干擾樣本與對(duì)照樣本的相對(duì)偏差。

32、進(jìn)一步的，本發(fā)明第二方面提供了一種用于測(cè)定血清中的視黃醇結(jié)合蛋白4水平的試劑盒，其包括用于稀釋血清樣本的pbs緩沖液以及試紙條，該試紙條依次通過將樣品墊、結(jié)合墊、包被有t線和c線的nc膜和吸水紙組裝而成。

33、根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒，其中所述t線和c線分別用0.8mg/ml的包被抗體和0.6mg/ml的羊抗鼠抗體包被，噴液量為1μl/cm。

34、根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒，其中所述結(jié)合墊上涂漬有熒光免疫微球。

35、根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒，其中所述試紙條是通過如下方式組成而成的：

36、取空白試紙條，撕掉pvc背板上覆蓋的膠條，貼上nc膜，nc膜上的t線和c線分別用0.8mg/ml的包被抗體和0.6mg/ml的羊抗鼠抗體包被，噴液量為1μl/cm，37℃烘干1h；

37、取制備好的熒光免疫微球5μl，按照1:150:150的比例加入微球稀釋液和純化水，混勻，涂在結(jié)合墊上，37℃干燥2h。另將樣品墊用處理液浸泡3min后，37℃烘干3h；

38、按照樣品墊、結(jié)合墊、包被有t線、c線的nc膜和吸水紙的順序組裝卡條，裁成4.0cm寬的試紙條，組裝，放入鋁箔袋(含干燥劑)密封保存，即得試紙條。

39、根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒，其中所述熒光免疫微球是通過如下方式制備得到的：

40、取50μl的eu3+羧基熒光微球用1ml的mes溶液混勻清洗2次后，清洗后的微球用該mes溶液定容至50μl，加入10mg/ml?edc和10mg/ml?nhs的混合液(edc：nhs＝1:3)37.5μl，30℃130r/min振蕩活化15min；

41、超聲分散后，用1ml?10mg/ml?mes溶液重復(fù)清洗兩次后，加10.5μg標(biāo)記抗體，37℃130r/min震蕩標(biāo)記2h；

42、再加100μl封閉液，130r/min振蕩1h進(jìn)行封閉；

43、封閉結(jié)束后，加入終洗液1ml，清洗3次，微球用終洗液定容至50μl，4℃條件下保存?zhèn)溆茫礊闊晒饷庖呶⑶颉?/p>

44、本發(fā)明方法呈現(xiàn)如本文上下文所述優(yōu)良技術(shù)效果。