專利名稱:同時對乙肝病毒基因型定型和定量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一新穎的引物對、探針對和用乙肝病毒基因?yàn)槟０嫠鶖U(kuò)增而得的核酸，和用其同時對基因型作定型及定量乙肝病毒的方法。
背景技術(shù)：
單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)，即基因序列位置上一群變異的單核苷酸，其分布于整個基因序列中。單核苷酸多態(tài)性也可以是等位基因。也就是說，由于存在該基因多態(tài)性，因此一物種中某些個體具有非變異序列(野生型)，而另一些個體則具有變異序列(變異型)。就動物個體而言，基因多態(tài)性可能導(dǎo)致隱性遺傳疾病。上述疾病包括牛淋巴球粘著缺乏癥(Bovine LeukocyteAdhesion Deficiency)、瓜胺酸血癥(Citrullinemia)、楓糖尿病(Maple SyrupUrine Disease)、尿苷單磷酸合成酶缺乏癥(Deficiency of Uridine MonophosphateSynthase)、α-甘露糖苷貯積癥、泛發(fā)性糖原貯積癥等。人類的囊性纖維化(cysticfibrosis)是上述隱性遺傳疾病之一，該病患者群約占白種人族群中兩千分之一。就諸如細(xì)菌或病毒之類的微生物病原體而言，單核苷酸多態(tài)性與不同的致病效應(yīng)有關(guān)，并因此影響該病癥的病人的治療及長期預(yù)后狀況。依據(jù)上述，迫切需要一種能夠有效鑒定及定量內(nèi)含單核苷酸多態(tài)性的核酸的方法。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及新穎的引物對、探針對和以乙肝病毒基因?yàn)槟０嫠鶖U(kuò)增而得到的核酸，和將其同時用于基因型定型及乙肝病毒定量上的應(yīng)用。
本發(fā)明涉及一種能夠同時鑒定一微生物目標(biāo)核酸的單核苷酸多態(tài)性和定量該目標(biāo)核酸的方法。該鑒定和定量是同時執(zhí)行的。
本發(fā)明方法需使用第一探針及第二探針。該第一探針是與一目的核酸的第一序列相同或互補(bǔ)的，其包含與單核苷酸多態(tài)性相對應(yīng)的堿基；該第二探針與一目的核酸的第二序列相同或互補(bǔ)，其不包含與單核苷酸多態(tài)性相對應(yīng)的堿基。該第一探針共價結(jié)合于第一熒光標(biāo)記，該第二探針共價結(jié)合于第二熒光標(biāo)記。該第一熒光標(biāo)記及該第二熒光標(biāo)記中之一為熒光團(tuán)供體，另一為熒光團(tuán)受體，如此一來，當(dāng)該第一探針及第二探針與該目的核酸雜交時，該熒光團(tuán)供體與該熒光團(tuán)受體處于鄰近位置，使得兩者之間能夠進(jìn)行熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。
本發(fā)明方法包括將一樣本中的目的核酸復(fù)制擴(kuò)增的步驟，其是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)以一對引物(primer)序列進(jìn)行的，使得樣本中該目的核酸形成一包含該第一序列及該第二序列的雙鏈核酸。上述第一探針及第二探針在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的退火(annealing)步驟中與該核酸產(chǎn)物雜交，以分別形成第一雙鏈(duplex)及第二雙鏈。上述兩種探針可以雜交于該核酸產(chǎn)物的同一鏈上。上述兩種探針亦可以雜交于該核酸產(chǎn)物的不同鏈上，并且使得該熒光團(tuán)供體與該熒光團(tuán)受體位于鄰近位置上。例如該兩種探針?biāo)s交的序列可以位于該核酸產(chǎn)物雙鏈所形成的叉狀結(jié)構(gòu)或泡狀結(jié)構(gòu)上。
樣本中目的核酸的定量檢測，是通過測量該第一探針上熒光團(tuán)受體所發(fā)出的熒光量進(jìn)行的，其是在每一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)的退火期的最末階段進(jìn)行的。上述熒光量的測定是將該待測熒光強(qiáng)度與一預(yù)定值比較得知，其中該預(yù)定值是由含有已知濃度的該目的核酸的溶液測量而得。上述熒光量的測定亦可將該聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的交叉值(cross point value，Cp value)與一預(yù)定值比較得知，其中該預(yù)定值是由含有已知濃度的該目的核酸的溶液測量而得，其測量方法如Mackay I.等，Nucleic Acids Res.301292-1305，2002所述。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)完成后，加熱使得溫度高于該第一探針及其互補(bǔ)序列形成雙鏈核酸的解鏈溫度(melting point)。當(dāng)該雙鏈核酸分離時，上述熒光團(tuán)供體與熒光團(tuán)受體之間的FRET受到干擾。該目的核酸中單核苷酸多態(tài)性的鑒定，是以一激發(fā)光照射該熒光團(tuán)供體，并測量該第一探針的熒光團(tuán)受體所發(fā)出的熒光量的改變，該熒光量的變化為所升高溫度值的函數(shù)。舉例來說，鑒定一單核苷酸多態(tài)性時，首先，建立該第一雙鏈核酸的一級導(dǎo)數(shù)解鏈曲線，其中該第一雙鏈核酸包含一熒光標(biāo)記探針，且該解鏈曲線基于隨溫度而變的熒光量而有所變化。其二，建立一溫度曲線，其基于解鏈曲線的解鏈峰而得。其三，比較該溫度值與該雙鏈核酸的解鏈溫度，其中該雙鏈?zhǔn)怯稍摰谝惶结樑c一互補(bǔ)序列形成。當(dāng)該溫度值比該解鏈溫度低時，該目的核酸中存在一單核苷酸多態(tài)性，當(dāng)該溫度值與該解鏈溫度相同時，則不存在單核苷酸多態(tài)性。
在另一方面，本發(fā)明提供了可用以擴(kuò)增HBV的目標(biāo)核酸的引物對，例如正向引物為TACTGCGG(SEQ ID NO13)及反向引物為GGTGAAGCGA(SEQ ID NO14)、正向引物為CGTGGAACC(SEQ ID NO17)及反向引物為GGTGAAGCGA(SEQ ID NO14)或正向引物為CTCAGGCCA(SEQ ID NO20)及反向引物為AACGCCGCAGACACATCCA(SEQID NO6)，其中每一個引物的長度為8到50個堿基(例如，15到40或18到30個堿基)。上述引物對亦可以為如下序列正向引物為CCGATCCATACTGCGGAAC(SEQ IDNO9)及反向引物為GCAGAGGTGAAGCGAAGTGCA(SEQ ID NO10)、正向引物為GCATGCGTGGAACCTTTGTG(SEQ ID NO1)及反向引物為CAGAGGTGAAGCGAAGTGC(SEQ IDNO2)、正向引物為TCATCCTCAGGCCATGCA(SEQ ID NO5)及反向引物為AACGCCGCAGACACATCCA(SEQ ID NO6)。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了探針對，用于同時鑒定乙肝病毒中目標(biāo)核酸的單核苷酸多態(tài)性及定量該目標(biāo)核酸。該探針對分別包含下述序列編碼(SEQ ID)的基因第一探針為TTGTCTACG(SEQ ID NO18)及第二探針為CGCTGAATC(SEQ IDNO19)、第一探針為TACGCGGACTC(SEQ ID NO15)及第二探針為GCCTTCTCATC(SEQ IDNO16)或一感應(yīng)探針為ACACGGGTGTTTCC(SEQ ID NO21)及一錨定探針為ATTGAGAGAA(SEQ ID NO22)，其中每一個引物的長度為9到50個堿基(亦即，15到40或18到30個堿基)。上述探針對亦可為如下序列一感應(yīng)探針ACGTCCTTTGTCTACGTCCCG(SEQ ID NO3)及錨定探針CGGCGCTGAATCCCGCGGAC(SEQ IDNO4)、感應(yīng)探針TCTTTACGCGGACTCCCC(SEQ ID NO11)及錨定探針TCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACC(SEQ ID NO12)、感應(yīng)探針AAGACACACGGGTGTTTCCCC(SEQ ID NO7)及錨定探針GAAAATTGAGAGAAGTCCACCACGAGTCTA(SEQ ID NO8)。
本發(fā)明亦提供以乙肝病毒基因?yàn)槟０嫠鶖U(kuò)增而得的核酸產(chǎn)物，其包含SEQ IDNO15、18及21的基因，或其互補(bǔ)基因序列，其中每一個核酸產(chǎn)物的長度為100到1,000個堿基(例如，200到700或300到500個堿基)。上述核酸產(chǎn)物與上述引物及探針雜交，用以鑒定及定量含有單核苷酸多態(tài)性的目標(biāo)核酸，其中該目標(biāo)核酸取自HBV基因。
本發(fā)明亦提供一可同時鑒定及定量含有單核苷酸多態(tài)性的HBV目標(biāo)核酸的試劑盒。該試劑盒包含1、2或3對上述引物對和/或探針。
本發(fā)明實(shí)施例的實(shí)施細(xì)節(jié)如下所述，但是其并非用以限定本發(fā)明，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可做些許更動與潤飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以權(quán)利要求
的范圍為準(zhǔn)。
具體實(shí)施方式本發(fā)明的目的是提供一種同時鑒定乙肝病毒基因型及定量該基因的方法。
本發(fā)明方法需使用第一探針及第二探針。該第一探針的設(shè)計是依據(jù)目的核酸中熟知的單核苷酸多態(tài)性及其特性來設(shè)計的，例如，GC含量、退火溫度、內(nèi)部配對等，其可以軟件程序來決定。為使得該第一探針能夠鑒定不同種個體核酸中的單核苷酸多態(tài)性，該第一探針的序列是與一含有單核苷酸多態(tài)性的序列相同或互補(bǔ)的，能用以鑒定該物種中至少兩種不同的基因型。上述序列的決定是通過比較該物種不同個體的脫氧核糖核酸的標(biāo)準(zhǔn)序列得到的，其方法與下文中“探針及引物的設(shè)計”單元中所述方法類似。上述不同個體的脫氧核糖核酸序列可由任何恰當(dāng)?shù)馁Y料庫中取得，例如www.ncbi.nlm.gov/PMGifs/Genomes。
該第一探針與一單核苷酸多態(tài)性配對基因(例如野生型)雜交而形成一雙鏈核酸，且其中不具有任何錯配的堿基對。該第二探針與另一單核苷酸多態(tài)性對偶基因(例如突變型)雜交而形成另一雙鏈核酸，且其中具有錯配的堿基對。由于上述雙鏈核酸的后者具有錯配的堿基對，故其解鏈溫度(Tm)較前者為低。該第一探針可以設(shè)計為以基因?yàn)榛A(chǔ)的方式來區(qū)分野生基因型及突變基因型。該第一探針與野生型基因及突變型基因雜交產(chǎn)生雙鏈核酸的能力可以用實(shí)驗(yàn)方法測定。上述兩種雙鏈核酸的解鏈溫度的差異亦可以用實(shí)驗(yàn)方法測定的，其差異大小(例如達(dá)攝氏2度)需足以測量出兩者間的差異。
以肝炎病毒為例肝炎病毒包含單核苷酸多態(tài)性的基因序列為TACGCGGACTC(SEQ ID NO15)，TTGTCTACG(SEQ ID NO18)，ACACGGGTGTTTCC(SEQID NO21)(前述粗體斜線的字母表示對應(yīng)于單核苷酸多態(tài)性的堿基)上述單核苷酸多態(tài)性能用來區(qū)分肝炎病毒A基因型至G基因型。參見表1及表2，以及下文中“同時鑒定及測量”一節(jié)。
上述包含單核苷酸多態(tài)性的序列，其側(cè)翼的序列最好為一物種中不同基因型個體的保守序列(即，無變異的序列)。如下文所述，該保守(或無變異)側(cè)翼序列對于設(shè)計第二探針以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物相當(dāng)重要。
該第二探針的設(shè)計基于兩個原則。其一，該第二探針不包含單核苷酸多態(tài)性，且其序列與物種中不同基因型的保守序列相同或互補(bǔ)。其二，該保守序列與上述包含單核苷酸多態(tài)性的序列相鄰。此種設(shè)計的目的在于，當(dāng)該第一探針及該第二探針與目的核酸雜交后，該兩種探針的位置能夠相當(dāng)靠近，例如間隔1至3個堿基。
上述第一探針及第二探針連結(jié)于熒光標(biāo)記，并可通過已知技術(shù)以直接或間接的方式測定。該熒光標(biāo)記之一為熒光團(tuán)供體，另一為熒光團(tuán)受體，該熒光團(tuán)供體所發(fā)出的熒光發(fā)射光譜(emission spectrum)與該熒光團(tuán)受體的激發(fā)光譜(excitation spectrum)重疊。當(dāng)該第一探針及第二探針與該目的核酸雜交時，該熒光團(tuán)供體與該熒光團(tuán)受體處于鄰近位置，使得兩者之間能夠進(jìn)行熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。上述熒光團(tuán)受體所發(fā)出的熒光能夠通過已知技術(shù)鑒定及定量。凡是發(fā)光光譜及激發(fā)光譜重疊的兩個熒光標(biāo)記都可以用來標(biāo)定上述第一探針及第二探針，例如LightCycler-Red 640可以為上述熒光團(tuán)受體，而熒光黃(fluorescein)可以為上述熒光團(tuán)供體。
要同時鑒定和定量一目的核酸，須將上述探針與該目的核酸混合，立刻進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。上述PCR反應(yīng)所用的引物(primer)對是根據(jù)已知技術(shù)的原則設(shè)計的。該引物序列尤其應(yīng)該與單核苷酸多態(tài)性側(cè)翼的序列相同或互補(bǔ)，其中該側(cè)翼序列為一物種中不同基因型個體的保守序列。上述引物對是用于將含有單核苷酸多態(tài)性的目的核酸復(fù)制擴(kuò)增。上述脫氧核糖核酸序列可由任何恰當(dāng)?shù)馁Y料庫中取得，例如組織勻漿物(tissue homogenate)、血液樣本，并且，其可以是脫氧核糖核酸或核糖核酸，若為核糖核酸，則在進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的前應(yīng)先施以反轉(zhuǎn)錄步驟。上述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)依據(jù)一般標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行，其可以參照Innis等(1990)PCRProtocolsA Guide to Methods and Applications，Academic Press，HarcourtBrace Javanovich，New York。在一實(shí)施例中，實(shí)時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是采用市面上可購得的實(shí)時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)系統(tǒng)(Roche Molecular Diagnostic承銷的LightCycler)。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的三個步驟(即變性、退火、延伸三步驟)可以重復(fù)進(jìn)行多次，使得能夠獲得足量的與目的核酸相對應(yīng)的產(chǎn)物。其重復(fù)進(jìn)行的次數(shù)則與其所使用的樣本性質(zhì)及其他因素有關(guān)。如果上述樣本為復(fù)雜的核酸混合物，則我們要獲得足量的上述目的核酸時，則重復(fù)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的次數(shù)必須較多。通常上述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)重復(fù)進(jìn)行的次數(shù)至少20次左右，但也可能達(dá)到40次、50次、60次甚至100次的多。上述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的產(chǎn)物與上述探針退火后，即可用以鑒定及定量上述目的核酸。
樣本中目的核酸的量的測定，是通過測量上述熒光團(tuán)受體所發(fā)出的熒光量實(shí)現(xiàn)的，其是在每一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)的退火期的最末階段通過照射上述熒光團(tuán)供體實(shí)現(xiàn)的。上述發(fā)出熒光的強(qiáng)度是上述復(fù)制擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物量的函數(shù)，而上述核酸產(chǎn)物量是該目的核酸原始濃度及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)重復(fù)次數(shù)的函數(shù)。若聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)重復(fù)進(jìn)行的次數(shù)夠多，則該復(fù)制擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物的累積率及熒光量變化率即進(jìn)入一對數(shù)線性階段。將該熒光強(qiáng)度值對該聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)次數(shù)繪圖，即可獲得對應(yīng)于該對數(shù)線性階段起點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)重復(fù)次數(shù)(亦即交叉值，Cp值)。然后，將上述測得的Cp值與一預(yù)定值比較，其中該預(yù)定值是由含有已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)核酸溶液測量而得。利用下文中“HBV定量”一節(jié)所述的方法，即可獲得一系列的上述Cp預(yù)定值。因此，我們可以通過將一給定的Cp值與上述一系列Cp預(yù)定值進(jìn)行比較，即可得知該目的核酸的原始濃度。
或者，亦可將其所發(fā)出熒光強(qiáng)度與一預(yù)定熒光強(qiáng)度值比較，而來定量一目的核酸。除了其對應(yīng)的核酸原始濃度為已知外，該預(yù)定熒光強(qiáng)度值是以相同方式?jīng)Q定的。
要鑒定一目的核酸，可于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)束后，對復(fù)制擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物進(jìn)行解鏈曲線分析而得知。將該聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)后的反應(yīng)溶液緩慢加熱，其加熱梯度約為每秒鐘升高攝氏0.5度，使得溫度高于該第一探針及其互補(bǔ)序列形成的雙鏈核酸的解鏈溫度。同時在照射該熒光團(tuán)供體時，監(jiān)測該熒光團(tuán)受體所發(fā)出的熒光量。將該熒光強(qiáng)度(F)對該解鏈溫度(Tm)作圖，即可得到一解鏈曲線圖。繼的，將該熒光強(qiáng)度(F)對溫度(T)微分，取其負(fù)值(-dF/dT)對溫度作圖，以獲得該解鏈曲線的一次微分曲線，來確定一解鏈峰值。將該解鏈峰值所對應(yīng)的溫度與該第一探針的解鏈溫度比較。在一較佳實(shí)施例中，上述解鏈曲線分析是用LightCycler分析軟件(3.5版)進(jìn)行的(Roche Diagnostics Applied Science，Manngeim Germany)。當(dāng)該溫度值低于該解鏈溫度，則表示該目的核酸中含有單核苷酸多態(tài)性，當(dāng)該溫度值等于該解鏈溫度，則表示該目的核酸中不含有單核苷酸多態(tài)性。上述方法能夠有效地同時鑒定和定量含有單核苷酸多態(tài)性的核酸。
雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例如上公開，然其并非用以限定本發(fā)明，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可進(jìn)行修改和變化，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)根據(jù)權(quán)利要求
所要求的范圍而定。
探針和引物的設(shè)計由www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/viruses.html所示資料庫中取得216段完整的肝炎病毒DNA序列。其中有175段序列經(jīng)鑒定為屬于A到G基因型的病毒，該鑒定操作是用Biology WorkBench所提供的CLUSTRLW Multiple SequenceAlignment，DRAWTREE及DEAWGRAM軟件進(jìn)行的(workbench.sdsc.edu/)。
在上述175段基因序列中，有47段屬于B基因型，有49段屬于C基因型。將上述兩種基因型的基因序列排列比較，以鑒定出另一含有單核苷酸多態(tài)性且兩側(cè)序列為上述兩種基因型共有基因的基因序列片段，這是通過CLUSTRLW多序列比較程序(CLUSTRLW Multiple Sequence Alignment program)進(jìn)行的。上述步驟比較出三段基因序列，并據(jù)此設(shè)計出三對引物及探針，這是根據(jù)TIB MOLBIOL(Gerlin，Germany)所提出的原則進(jìn)行的。上述引物對可通過PCR反應(yīng)由其個別目的核酸來產(chǎn)生復(fù)制擴(kuò)增產(chǎn)物。上述復(fù)制擴(kuò)增產(chǎn)物、引物對及探針對的基因位置總結(jié)如表1所示。
表1用于鑒定及定量HBV中單核苷酸多態(tài)性的復(fù)制擴(kuò)增產(chǎn)物、引物對及探針對
1核酸位置(nt)是以乙肝ayr亞型基因庫的位置表示(GenBank登錄號NC_003977)。
2P表不3’端經(jīng)磷酸化處理以避免探針在PCR時延伸。
3FLU表熒光(flourescien)；LC-Red 640表示Light-cycler Red-640。
4所示TM值為平均數(shù)，TM值±1℃是為基因型定型所容許的。
5SNP位置以粗體、底線標(biāo)示。
復(fù)制擴(kuò)增產(chǎn)物1在核酸位置1425處含有一C/T單核苷酸多態(tài)性。復(fù)制擴(kuò)增產(chǎn)物2在核酸位置1544處含有一A/T單核苷酸多態(tài)性。上述兩種單核苷酸多態(tài)性位于HBx基因上。復(fù)制擴(kuò)增產(chǎn)物3含有4個單核苷酸多態(tài)性，其分別為HBV的核酸位置285處(A/G單核苷酸多態(tài)性)；HBV的核酸位置287處(G/A單核苷酸多態(tài)性)；HBV的核酸位置292處(G/A單核苷酸多態(tài)性)；HBV的核酸位置294處(T/C單核苷酸多態(tài)性)。上述4種單核苷酸多態(tài)性均位于HBs基因上。
上述引物及探針由TIB MOLBIOL所合成。其中，第二探針(錨定探針)的3’端具有熒光標(biāo)記，含有單核苷酸多態(tài)性的第一探針(感應(yīng)探針)則是在5’端具有LC-Red640染劑標(biāo)記。上述感應(yīng)探針的3’端也已磷酸化。
為確認(rèn)上述復(fù)制擴(kuò)增產(chǎn)物中含有單核苷酸多態(tài)性，由40位乙肝病人取得血清樣本，依照下文中“HBV的DNA制備”一節(jié)中所述方法由該血清樣本中制備DNA。利用傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)復(fù)制擴(kuò)增上述基因樣本，再將該等基因樣本的復(fù)制擴(kuò)增產(chǎn)物以ABI PRISM Big-dye試劑盒分析其基因序列，并通過ABI 3100 Genetics Analyzer(Applied Biosystem，F(xiàn)oster City，CA)分析的。結(jié)果顯示，上述20種樣本的復(fù)制擴(kuò)增產(chǎn)物含有HBV C基因型的單核苷酸多態(tài)性，而另外20種樣本的復(fù)制擴(kuò)增產(chǎn)物含有HBV B基因型的單核苷酸多態(tài)性。
HBV DNA的制備由114位慢性乙肝病人取得血清樣本。所有上述病人均由臺灣大學(xué)附設(shè)醫(yī)院門診進(jìn)行后續(xù)追蹤。為確認(rèn)上述血清提供者確患慢性乙肝，進(jìn)一步以市售肝炎測試劑(Ausab，Ausria II，Murex HbeAg/抗-Hbe，Abbott Laboratories，North Chicago，IL)測試該血清樣本含有HbsAg、抗-HBs、抗-HBc Igs、HBeAg、抗-HbeAg。上述血清中的HBV DNAs也以分支鏈DNA分析法(QUANTIPLEX tm HBV DNA Assay，ChironCorporation，Emeryville，CA)分析，根據(jù)該產(chǎn)品廠商提供的操作方法進(jìn)行。上述操作均依照1975年赫爾辛基宣言中所示的醫(yī)學(xué)倫理準(zhǔn)則進(jìn)行。
然后，由上述樣本中制備HBV基因，這是用高純度病毒基因制備試劑盒(RocheDiagnosis Applied Science，Mannheim Germany)進(jìn)行的。取200μl的上述血清樣本，將其與200μl的結(jié)合緩沖液混合，在攝氏72度中反應(yīng)10分鐘，其中該結(jié)合緩沖液成分包含6M鹽酸胍(guanidine-HCl)、10mM尿酸、10Mm Tris-HCl、20％Triton X-100(體積/體積)、200μg的poly(A)、0.8mg胰蛋白K。然后，將該反應(yīng)混合液與100μl的異丙醇混合，滴入一已預(yù)先充填了玻璃纖維的高純度過濾管中。將該過濾管以一除去抑制物的緩沖液沖洗兩次后，以100μl水將該病毒核酸洗出，其中該除去抑制物的緩沖液成分包含100％乙醇、20mmol/L氯化鈉、2mmol/LTris-HCl。
然后，利用常規(guī)方法確認(rèn)上述HBV病毒DNA所屬的基因型，所述常規(guī)方法包括PCR-PFLP、使用基因型特異性引物的PCR、及直接測序等等。上述肝炎病患的血清中，有60個樣本經(jīng)鑒定為含有B基因型的HBV，而46個樣本經(jīng)鑒定為含有C基因型的HBV。其余8個樣本中的HBV則無法以上述常規(guī)方法決定出其所屬的基因型。
HBV定量為進(jìn)行HBV的定量，必須先以質(zhì)粒pHBV 48為對象，做成一復(fù)制量標(biāo)準(zhǔn)曲線。該質(zhì)粒的制造是將1.5mer的HBV DNA片段(核酸位置為2851至3182/1至3182/1至1281)插入pGEM-3Z載體8中。上述質(zhì)體合成后，用質(zhì)粒純化試劑盒(QIAGEN GMbH，Hilden Germany)純化，并以光譜儀定量。其對應(yīng)的HBV效價(拷貝/mL)是以每一質(zhì)體的質(zhì)量決定的。然后，將該質(zhì)體進(jìn)行一系列稀釋，以得到HBV效價值介于1×102拷貝/mL至1×1011拷貝/mL的10個樣本。上述10個樣本根據(jù)下述方法做成一標(biāo)準(zhǔn)曲線。
每一上述樣本，取2μl，將其與下列溶液混合0.5μl的LightCycler fastStartDNA Master雜交混合物、0.2μl的25mM氯化鎂、以及如上文“探針及引物設(shè)計”一節(jié)中所述的第二探針，其中該LightCycler fastStart DNA Master雜交混合物包含成分Tag DNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液、10mM氯化鎂、dNTP混合液(RocheDiagnosis Applied Science，Mannheim Germany)?；旌仙鲜鲆后w后，將最終反應(yīng)液的體積調(diào)整到5μl，使得每一反應(yīng)液中的引物濃度為5μM，而每一反應(yīng)液中的探針濃度為0.5μM。將上述最終反應(yīng)液裝入LightCycler毛細(xì)管中并離心，再置入LightCycler樣本旋轉(zhuǎn)架中(Roche Diagnosis Applied Science，MannheimGermany)。
然后，根據(jù)下述程序執(zhí)行一實(shí)時PCR反應(yīng)。首先以攝氏95度加熱該反應(yīng)液10分鐘，使得DNA變性解鏈。然后重復(fù)進(jìn)行如下程序55次于攝氏95度加熱5分鐘，使得DNA變性分離；于攝氏55度加熱10秒，使得DNA退火；于攝氏72度加熱20秒，使得DNA分子延伸。上述反應(yīng)中溫度轉(zhuǎn)換速度的設(shè)定為分離/退火轉(zhuǎn)換為每秒鐘20度；而退火/延伸轉(zhuǎn)換為每秒鐘5度。在每一次退火步驟完成時，測量LC-RED640發(fā)出的熒光量。決定每一樣本的Cp值，并利用LightCycler軟件3.5版，將樣本的Cp值對樣本濃度對數(shù)值作圖，即可得出標(biāo)準(zhǔn)曲線。上述標(biāo)準(zhǔn)曲線在1×102拷貝/mL至1×1011拷貝/mL的范圍內(nèi)呈現(xiàn)一直線段，表示其測試限度為1×102拷貝/mL。
然后測試該標(biāo)準(zhǔn)曲線以定量HBV DNA。該測試操作所使用的測試樣本包括由HBV Genotype Panel(International Enzymes，Inc.，F(xiàn)allbrook，CA)取得的15個基因型為A至F的樣本、由QUANTIPLEX bDNA劑組取得的4個樣本。上述19個樣本均包含已知其效價的HBV。將上述樣本進(jìn)行實(shí)時PCR，并以上述方法獲知其Cp值。并利用上述標(biāo)準(zhǔn)曲線找出與Cp值相對應(yīng)的效價。針對每一樣本進(jìn)行6次(3次重復(fù)實(shí)驗(yàn))上述定量作業(yè)。上述測試結(jié)果顯示所有樣本的效價均為正確。
將上述方法所獲知的效價與依據(jù)傳統(tǒng)方法獲知的效價進(jìn)行比較，其中該傳統(tǒng)方法包含NGI SuperQuant、Roche Amplicor、Chiron Quantiplex bDNA assays。上述三種傳統(tǒng)方法的實(shí)施根據(jù)其制造商提供的操作方法進(jìn)行。將上述方法測得的效價對上述三種傳統(tǒng)方法測得的效價進(jìn)行線性回歸，結(jié)果顯示其具有顯著相關(guān)(γ值分別為0.9866，0.9830及0.999)。通過皮爾森關(guān)聯(lián)(Pearson correlation)估算其組間差異系數(shù)與組內(nèi)差異系數(shù)。其結(jié)果為P值小于0.001，顯示該方法具有相當(dāng)?shù)脑佻F(xiàn)性。
HBV的鑒定測試上述三組探針對及引物對，以區(qū)分出在臺灣、大陸及日本三地流行的乙肝病毒及丙肝病毒。
由上述樣本中選取10個含有基因型B基因序列的樣本，以及10個含有基因型C基因序列的樣本。依據(jù)上述“HBV定量”一節(jié)中所述方法，以上述樣本及第2組引物及探針進(jìn)行PCR反應(yīng)。于PCR反應(yīng)結(jié)束后，先將反應(yīng)液置于攝氏95中60秒，再將其冷卻至攝氏45度(溫度下降速度為每秒鐘下降攝氏0.5度)，將該反應(yīng)液置于攝氏45度中120秒，在將其加熱至攝氏80度(溫度上升速度為每秒鐘上升攝氏0.5度)。同時，測量640nm的熒光量。繪出所有上述樣本的解鏈曲線后，將該熒光強(qiáng)度(F)對溫度(T)微分，取其負(fù)值(-dF/dT)對溫度作圖，以獲得該解鏈曲線的一次微分曲線，來決定一解鏈峰值，上述解鏈曲線分析是用LightCycler分析軟件(3.5版)進(jìn)行的。
上述解鏈曲線的一級導(dǎo)數(shù)曲線顯示，上述樣本的解鏈峰值依其值的大小分為兩群。且上述兩群樣本的解鏈溫度平均值分別對應(yīng)HBV基因型B及基因型C的溫度(其分別為攝氏60.9度及54.8度)。上述10個含有基因型B基因序列的樣本，其解鏈溫度與60.9度的差異均在1.8度的內(nèi)，亦即ΔTm(6.1度)的30％之內(nèi)。上述10個含有基因型C基因序列的樣本，其解鏈溫度與54.8度的差異均在1.8度之內(nèi)。因此1.8℃(或ΔTm(6.1度)的30％)是區(qū)分基因型B及基因型C的分界點(diǎn)。根據(jù)上述方法測定，第1組及第3組復(fù)制擴(kuò)增物(及其相對應(yīng)的引物和探針)的基因型分界點(diǎn)分別為2.5℃和4.9℃。上述平均解鏈溫度和分界點(diǎn)總結(jié)于表1中。
然后，利用上述3組引物及探針，測定如前文“HBV DNA制備”一節(jié)中所述的60種B基因型的HBV及46種C基因型的HBV的基因型。采用第1組引物及探針時，上述106種HBV中，可以正確判定其中103種HBV的基因型。至于3個未被正確判定的樣本，有1個被錯誤判定，另外2個則無法判定。采用第2組和第3組引物及探針時，則分別有1個和2個樣本無法正確判定。然而，若同時采用上述3組引物和探針中任意2組時，則可以正確判斷所有上述106個樣本的基因型。
同時鑒定及定量HBV通過上述引物及探針與上述方法，針對含有B基因型及C基因型的HBV的樣本同時進(jìn)行鑒定及定量。自臺灣大學(xué)附設(shè)醫(yī)院(臺北，臺灣)取得含有B基因型及C基因型的HBV的質(zhì)粒。將含有B基因型及C基因型的HBV的質(zhì)粒依不同比例混合，其混合比例介于10∶1到1∶10之間。依據(jù)上述“HBV的鑒定”一節(jié)中所述方法，鑒定該質(zhì)體混合液所含HBV的基因型，其中該質(zhì)體混合液的效價為每毫升107個質(zhì)體。上述操作的結(jié)果顯示，各樣本的解鏈曲線的一次微分曲線顯示對應(yīng)HBV B基因型及C基因型的解鏈曲線與解鏈峰值。同時，依據(jù)如前文“HBV定量”一節(jié)中所述的方法，測得各樣本的Cp值及其中所含質(zhì)體的效價。上述操作的結(jié)果顯示，上述方法可以同時鑒定及定量一樣本中所含的主要HBV群及次要HBV群。其中，上述次要HBV群的質(zhì)體效價至少為上述主要HBV群的10％。上述方法可以僅以單管樣本，同時鑒定及定量一含有單核苷酸多態(tài)性的目的核酸，該方法具有極佳的效率、正確性及靈敏度。
本發(fā)明方法除了可以用于鑒定及定量B基因型及C基因型之外，也可以用于其他基因型的鑒定及定量。前文“探針及引物的設(shè)計”一節(jié)中所述的175個HBV DNA序列，均可以依據(jù)該節(jié)所述方法排列比較。該引物及固定探針的序列在A到G的基因型中，均保持不變。還檢驗(yàn)了對應(yīng)復(fù)制擴(kuò)增物的單核苷酸多態(tài)性，其序列變異及相對頻率均如表2所示。
表2.HBV A基因型A至G基因型中單核苷酸多態(tài)性序列的變異
下劃線字母和數(shù)字表示較低的變異及其頻率。
如表2所示，7種基因型中除了基因型B及D之外，在3種復(fù)制擴(kuò)增物中均具有獨(dú)特的單核苷酸多態(tài)性組合。因此，可以依據(jù)下述方法，利用3組不同的引物及探針來鑒定HBV的基因型(1)使用第2組引物及探針，確定待測HBV是屬于第1群(基因型A、C、E、G)或是第2群(基因型B、D、F)。
(2)使用第1組引物及探針，確定待測HBV是屬于第1群的基因型A、G、C、E中哪一種。
(3)使用第3組引物及探針，確定待測HBV是屬于第2群的基因型B、D、F中哪一種。
其他實(shí)施例雖然本發(fā)明已以數(shù)個較佳實(shí)施例如上公開，但它并非用以限定本發(fā)明，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員，在不違背本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，可以進(jìn)行各種改變和修改，這些改變和修改都在權(quán)利要求
范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種可同時鑒定乙肝病毒目標(biāo)核酸的單核苷酸多態(tài)性和定量該目標(biāo)核酸的方法，其包括提供第一探針和第二探針，其中該第一探針與該目標(biāo)核酸的第一序列相同或互補(bǔ)，所述第一序列包含與單核苷酸多態(tài)性相對應(yīng)的堿基，所述第一探針的基因序列與SEQ ID NO7的序列具有至少90％的相似度；其中該第二探針與該目標(biāo)核酸的第二序列相同或互補(bǔ)，所述第二序列不包含與單核苷酸多態(tài)性相對應(yīng)的堿基，所述第二探針的基因序列與SEQ ID NO8的序列具有至少90％的相似度；通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以一對引物來擴(kuò)增該目標(biāo)核酸，以形成一包含該第一序列和該第二序列的雙鏈核酸產(chǎn)物，所述的一對引物之一的基因序列與SEQ ID NO5的序列具有至少90％的相似度，以及所述一對引物的另一引物的基因序列與SEQID NO6的序列具有至少90％的相似度；在反應(yīng)液中將所述核酸產(chǎn)物分別與該第一探針和第二探針雜交，以分別形成第一雙鏈和第二雙鏈，其中該第一探針與第一熒光團(tuán)共價結(jié)合，該第二探針與第二熒光團(tuán)共價結(jié)合，其中該第一熒光團(tuán)和該第二熒光團(tuán)之一為熒光團(tuán)供體，另一為熒光團(tuán)受體，使得當(dāng)該第一探針和第二探針與該目標(biāo)核酸產(chǎn)物雜交時，該熒光團(tuán)供體與該熒光團(tuán)受體處于鄰近位置，且其兩者之間能夠進(jìn)行熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)；加熱該反應(yīng)液，使得其溫度高于該第一探針和其互補(bǔ)序列所形成的雙鏈的解鏈溫度；鑒定該單核苷酸多態(tài)性，通過用激發(fā)光照射該熒光團(tuán)供體，并監(jiān)測該第一探針的熒光團(tuán)受體發(fā)出的熒光量的變化，該熒光量變化是升高的溫度值的函數(shù)；和通過監(jiān)測該熒光團(tuán)受體所發(fā)出的熒光來定量該目標(biāo)核酸。
2.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述定量步驟是將該熒光團(tuán)受體所發(fā)出的熒光強(qiáng)度與一預(yù)定值比較。
3.如權(quán)利要求
2所述的方法，其特征在于，第一探針和第二探針與所述核酸產(chǎn)物的同一鏈雜交。
4.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，第一探針和第二探針與所述核酸產(chǎn)物的同一鏈雜交。
5.如權(quán)利要求
4所述的方法，其特征在于，該鑒定步驟包括建立該第一雙鏈的一級導(dǎo)數(shù)解鏈曲線；確定該曲線的解鏈峰值所對應(yīng)的溫度值；比較該溫度值與該雙鏈的解鏈溫度，其中該雙鏈?zhǔn)怯稍摰谝惶结樑c其互補(bǔ)序列形成，若該溫度值比該解鏈溫度低時，該目標(biāo)核酸中存在一單核苷酸多態(tài)性，若該溫度值與該解鏈溫度相同時，則不存有單核苷酸多態(tài)性。
6.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，其中該鑒定步驟包含建立該第一雙鏈的一級導(dǎo)數(shù)解鏈曲線；確定該曲線的解鏈峰值所對應(yīng)的溫度值；比較該溫度值與該雙鏈的解鏈溫度，其中該雙鏈由該第一探針與其互補(bǔ)序列形成，若該溫度值比該解鏈溫度低時，該目標(biāo)核酸中存在一單核苷酸多態(tài)性，若該溫度值與該解鏈溫度相同時，則不存有單核苷酸多態(tài)性。
7.如權(quán)利要求
6所述的方法，其特征在于，其中該定量步驟是將該熒光團(tuán)受體所發(fā)出的熒光強(qiáng)度值與一預(yù)定值比較。
8.如權(quán)利要求
7所述的方法，其特征在于，其中該第一探針和該第二探針雜交于該核酸產(chǎn)物的同一鏈上。
9.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，其中該第一探針的基因序列是SEQ ID NO21，和所述第二探針的基因序列是SEQ ID NO22。
10.如權(quán)利要求
9所述的方法，其特征在于，其中該一對引物之一的基因序列是SEQ ID NO20，該一對引物另一的基因序列為SEQ ID NO6。
11.如權(quán)利要求
10所述的方法，其特征在于，其中該鑒定步驟包含建立該第一雙鏈的一級導(dǎo)數(shù)解鏈曲線；決定該曲線的解鏈峰值所對應(yīng)的溫度值；比較該溫度值與該雙鏈的解鏈溫度，其中該雙鏈?zhǔn)怯稍摰谝惶结樑c其互補(bǔ)序列形成，若該溫度值比該解鏈溫度低時，該目標(biāo)核酸中存在一單核苷酸多態(tài)性，若該溫度值與該解鏈溫度相同時，則不存有單核苷酸多態(tài)性。
12.如權(quán)利要求
11所述的方法，其特征在于，其中該定量步驟是將該熒光團(tuán)受體所發(fā)出的熒光強(qiáng)度值與一預(yù)定值比較。
13.如權(quán)利要求
12所述的方法，其特征在于，其中該第一探針和該第二探針雜交于該核酸產(chǎn)物的同一鏈上。
14.一種用于權(quán)利要求
1所述方法的引物，其特征在于，該引物用于擴(kuò)增乙肝病毒的目標(biāo)核酸，該引物的基因序列與SEQ ID NO5的序列具有至少90％的相似度。
15.如權(quán)利要求
14所述的引物，其特征在于，該引物的基因序列是SEQ IDNO5。
16.如權(quán)利要求
14所述的引物，其特征在于，所述引物的基因序列為SEQ IDNO20。
17.一種用于權(quán)利要求
1所述方法的引物，其特征在于，該引物該引物用于擴(kuò)增乙肝病毒的目標(biāo)核酸，該引物的基因序列與SEQ ID NO6的序列具有至少90％的相似度。
18.如權(quán)利要求
17所述的引物，其特征在于，所述引物的基因序列為SEQ IDNO6。
19.一種探針，其特征在于，該探針包含一與單核苷酸多態(tài)性相對應(yīng)的堿基，用于鑒定乙肝病毒目標(biāo)核酸的單核苷酸多態(tài)性，該探針的基因序列與SEQ ID NO7的序列具有至少90％的相似度。
20.如權(quán)利要求
19所述的探針，其特征在于，所述引物的基因序列為SEQ IDNO7。
21.如權(quán)利要求
19所述的探針，其特征在于，所述引物的基因序列為SEQ IDNO21。
22.一種探針，其特征在于，該探針包含一與單核苷酸多態(tài)性相對應(yīng)的堿基，用于鑒定乙肝病毒目標(biāo)核酸的單核苷酸多態(tài)性，該探針的基因序列與SEQ ID NO8的序列具有至少90％的相似度。
23.如權(quán)利要求
22所述的探針，其特征在于，所述引物的基因序列為SEQ IDNO8。
24.如權(quán)利要求
22所述的探針，其特征在于，所述引物的基因序列為SEQ IDNO22。
25.一種用于權(quán)利要求
1所述方法的試劑盒，其特征在于，該試劑盒可同時鑒定乙肝病毒目標(biāo)核酸的單核苷酸多態(tài)性和定量該目標(biāo)核酸，該試劑盒包含如權(quán)利要求
14所述的引物、權(quán)利要求
17所述的引物、權(quán)利要求
19所述的探針和權(quán)利要求
20所述的探針。
26.如權(quán)利要求
25所述的試劑盒，其特征在于，還包含如權(quán)利要求
16所述的引物。
27.如權(quán)利要求
25所述的試劑盒，其特征在于，還包含如權(quán)利要求
18所述的引物。
28.如權(quán)利要求
25所述的試劑盒，其特征在于，還包含如權(quán)利要求
21所述的探針和權(quán)利要求
24所述的探針。
專利摘要
一種可同時對乙肝病毒進(jìn)行基因型定型和定量的方法。還公開了(1)一對引物，其分別包含SEQ ID NO13和14、SEQ ID NO17和14、或SEQ ID NO20和6的序列，每一引物的長度為8到50個堿基；(2)一對探針，其分別包含SEQ ID NO18和19、SEQ ID NO15和16、或SEQ ID NO21和22的序列，每一探針長度為9到50個堿基；(3)一以乙肝病毒基因?yàn)槟０鏀U(kuò)增而得的核酸，其含有選自SEQID NO15、19、22或其互補(bǔ)序列的序列，其序列長度為100到1000個堿基。
文檔編號C12P19/00GK1995982SQ200710001881
公開日2007年7月11日 申請日期2003年11月25日
發(fā)明者陳培哲, 陳定信, 葉秀慧 申請人:普生股份有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan