專利名稱：一種新的腫瘤標志物以及用該標志物檢測腫瘤的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用高效液相色譜測定尿中假尿嘧啶核苷(簡稱假尿苷)的方法，并用該方法建立肺癌和鼻咽癌的標志物及其檢測方法。
人尿中的修飾核苷是由tRNA降解產生的。人體癌變組織中，由于腫瘤的快速增長，消耗的蛋白質急聚增加，運載蛋白質的tRNA也迅速增長。但tRNA的生長是有壽命的，當它衰亡時，各種核酸成份就代謝出來。其中腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶等主要組份的代謝產物不是被重新利用，就是以尿酸形式排出體外，而修飾核苷因不易被酶識別，最終以核苷形式從體液中排出，假尿苷是修飾核苷之一，在所有修飾核苷中，它在體液中的含量是最高的;又因尿中的假尿苷的含量比血清中高十倍以上，故測定尿中的假尿苷作腫瘤標志物，對癌癥的早期診斷及監(jiān)測腫瘤的放療和化療的臨床效果有十分重要的意義。近幾年來，用HPLC測定人尿中假尿苷已有報導，比如Gerald·A等人報道了先用硼酸親和凝膠將尿中修飾核苷分離出來，然后再用HPLC測定假尿苷(Journal of Chromatography 1986，374149-154)。此法分兩步完成，操作麻煩、費時。
本發(fā)明的目的是提供簡便可靠的方法測定尿中假尿苷(用ψ表示)含量，分別用假尿苷和假尿苷/肌酐(用ψ/C表示)，作為鼻咽癌和肺癌的標志物，以及用該標志物檢測鼻咽癌和肺癌的方法。
本發(fā)明是用高效液相色譜鑒定和定量測定尿中假尿苷，再通過分光光度法同時測出肌酐，采用標準物質加入法鑒定尿中假尿苷的特征峰，標準曲線法測定尿中假尿苷含量。分別用正常人的ψ和ψ/C值作為鼻咽癌和肺癌的參照控制標準，然后對待測尿樣(凝為鼻咽癌和肺癌的病人)進行同樣程序分析，根據(jù)ψ和ψ/C值就可得到診斷結果。
下面結合附圖和實施例對本發(fā)明的內容作詳細說明

圖1為尿中假尿苷定性鑒定色譜圖。
圖2為假尿苷含量與峰面積關系的標準曲線圖。
圖3為正常人、肺癌和鼻咽癌患者尿中的ψ分布圖。
圖4為正常人、肺癌和鼻咽癌患者尿中的ψ/C分布圖。
圖5為13例疑為肺癌的病人中的ψ/C檢測分布圖和為檢測肺癌病人放療和化療效果圖。
本發(fā)明所選用的HPLC系統(tǒng)由Tracor950 A型泵、Tracor970 A型UV監(jiān)測器和056型記錄儀組成;柱子為4×250mm，填料為YWG-C18.10μM(天津試劑二廠)，800型離心機，721型分光光度計。
測定方法是首先收集尿樣，低于-20℃下冷凍20小時以上，待測時解凍，在大于1700g下離心5-10分鐘，立即分離上清液作高效液相色譜。
色譜條件0.02mol/L KH2PO4(PH3.45);流速0.95ml/min;溫度室溫;檢測波長254nm;進樣10-20μl。肌酐分析利用苦味酸分光光度法。
假尿苷特征峰的鑒定采用標準物質加入法確定。在確定的色譜條件下，測假尿苷標準色譜圖(圖1a)。然后在相同條件下分析尿樣(圖1b)，根據(jù)標準假尿苷的標準保留時間tR(6.1±0.1分鐘)，初步確定尿中假尿苷的特征峰，接著在該樣品中加入標準假尿苷再作色譜，發(fā)現(xiàn)初步確定的色譜峰增高，面積增大而并未發(fā)生分裂(圖1c)，因此可確定該峰正是假尿核苷的特征峰。
定量分析采用標準曲線法。配制濃度分別為50nmOl/ml、100nml/ml、150nmOl/ml、250nmOl/ml、350nmOl/ml、450nmOl/ml的標準假尿苷溶液，在上面確定的色譜條件下分別測定他們的HPLC及其峰面積，根據(jù)假尿苷含量與對應的峰面積的比例關系繪制ψ含量～A面積的標準曲線(圖2)，待測樣品的含量就可經(jīng)標準曲線計算出來。
圖1為標準假尿苷，尿樣和標準假尿苷加尿樣的HPLC對照圖。圖中“＊”表示假尿苷特征峰，圖1a為標準假尿苷的峰，圖1b為尿樣的色譜峰，圖1c為標準假尿苷加尿樣色譜峰。
圖2為假尿苷含量與峰面積的線性關系標準曲線，圖中橫座標為假尿苷含量(單位nmOl)，縱座標為峰面積，標準曲線的線性回歸方程為A＝74.135ψ+0.665，r＝0.9997，A表示峰面積，ψ表示假尿苷含量，r表示線性相關系數(shù)。
實施例一用假尿苷作鼻咽癌的標志物。
隨機收取20～53歲健康人員尿樣12例。從醫(yī)院收集肺癌和鼻咽癌患者尿樣分別為14和13例。用HPLC系統(tǒng)測得這些尿中的ψ值，經(jīng)統(tǒng)計學的t檢驗處理結果表明t鼻咽癌/正常＝3.91＞t(25)0.001＝3.74P＜0.001t肺癌/正常＝1.39＜t(26)0.1＝1.71P＞0.1正常人與鼻咽癌患者尿中的ψ值有非常顯著性差異，陽性檢出率為92.3%。從統(tǒng)計學角度講，ψ的差異對鼻咽癌的診斷具有非常顯著的意義。
圖3為正常人，鼻咽癌和肺癌患者尿中ψ的分布圖，縱座標為ψnmOl/ml，橫座標的a為正常人，b為鼻咽癌，c為肺癌。
實施例二通過ψ/C診斷肺癌根據(jù)對上述12個正常人，14例肺癌和13例鼻咽癌患者所測的數(shù)據(jù)，計算每個樣品的假尿苷/肌酐(ψnmOl/CμmOl/ml)的數(shù)據(jù)繪于圖4中。并對所測數(shù)據(jù)作統(tǒng)計學分析，t檢驗結果t肺癌/正常＝3.28＞t(26)0.01＝2.78P＜0.01t鼻咽癌/正常＝1.54＜t(25)0.1＝1.71P＞0.1正常人與肺癌病人尿中ψ/C的比值有非常顯著性差異，陽性檢出率為86%。從統(tǒng)計學角度講，對肺癌的診斷有非常顯著的意義。
圖4為正常人，肺癌和鼻咽癌患者尿中的ψ/C分布，圖中縱座標為ψ/C[(nmOl/ml)/(μmOl/ml)]，橫座標的a為正常人，b為肺癌，c為鼻咽癌。
實施例三肺癌早期診斷用本方法對12例懷疑為肺癌的病人作假尿苷/肌酐(ψ/C)分析，結果分析如圖5(a)所示。對該12例病人于兩個月后經(jīng)切片活檢后得出肯定結論。圖中“△”為活檢證實為肺癌者，用本方法查出了三例中的兩例，漏判一例，誤判一例，其余10例結論相符，準確率為86%，而誤判和漏判的這兩例也可通過影響肌肝分析的相關病得到解釋。也就是說，如作臨床綜合分析，準確率還會顯著提高。
實施例四監(jiān)測肺癌病人放療和化療效果用本方法測定已經(jīng)有效放射性治療和化學藥物治療的肺癌病人7例(圖5b)，其中6例顯著降低，達到正常水平，準確率為86%以上，只有一例略高于正常平均值，但落在正常值的統(tǒng)計范圍內。
圖5為用于早期診斷和放療化療結果檢驗研究的分布圖，圖中橫座標為早期診斷效果和放療化療效果檢驗結果，縱座標為ψ/C值，1為正常值控制線，2、3為正常值控制范圍。
使用本發(fā)明有以下特點1.測定方法簡便可靠，病人無任何痛苦，愿意合作，方法靈敏度高，實際操作一個樣品只需2小時就可得到準確結果。
2.用ψ和ψ/C分別作鼻咽癌和肺癌的標志物，陽性檢出率高于現(xiàn)有臨床的各種腫瘤標志物，因此準確度高，見下表(該表摘自米島學·他，腫瘤標志物，國外醫(yī)學腫瘤學分冊，1989，2108)
3.根據(jù)尿中假尿苷含量增高的基本原理，假尿者也可推廣應用于其它腫瘤的標志物。
權利要求
1.一種新的腫瘤標志物，其特征在于采用高效液相色譜鑒定和定量測定人尿中假尿嘧碇核苷(簡稱假尿苷)，再用分光光度法同時測出肌酐，分別以假尿苷和假尿苷/肌酐作為鼻咽癌和肺癌的標志物。
2.根據(jù)權利要求1所說的標志物，其特征在于用同樣的色譜條件分別測定正常人和已確診為鼻咽癌病人的尿中假尿苷含量，對測定結果作統(tǒng)計分析證明，假尿苷可作為鼻咽癌的腫瘤標志物。
3.根據(jù)權利要求1所說的標志物，其特征在于用同樣的色譜條件分別測定正常人和肺癌患者尿中的假尿苷含量，以及用苦味酸分光光度法測定尿中肌酐，測定結果用假尿苷/肌酐表示，進行統(tǒng)計分析證明假尿苷/肌酐可作為肺癌的標志物。
4.一種新的腫瘤檢測方法，其特征在于采用人尿中的假尿苷和假尿苷/肌酐分別作為鼻咽癌和肺癌的標志物，在通過條件選擇確定的色譜條件下，鑒定尿中的假尿苷特征峰和測定其峰面積，測試標準假尿苷對峰面積的線性標準曲線，得出線性回歸方程A＝74.135ψ+0.665，r＝0.9997，然后對待測尿樣進行同樣程序的分析，將峰面積帶入線性回歸方程即得出待測尿樣的假尿苷含量，再用分光光度測出肌酐后，計算假尿苷/肌酐。
5.根據(jù)權利要求4所說的方法，其特征在于所測定的尿樣，包括正常人和鼻咽癌、肺癌患者的尿樣，首先分別收集鮮尿，在低于-20℃冷凍20小時以上，待測時解凍，于＞1700g離心5-10分鐘，立即分離上清液作高效液相色譜。
6.根據(jù)權利要求4或5所說的方法，其特征在于液相色譜條件為0.02mol/lKH2PO4(PH3.45)、流速0.95ml/min，溫度為室溫，檢測波長254nm，進樣10-20μl，肌酐分析采用苦味酸分光光度法。
7.根據(jù)權利要求4所說的方法，其特征在于線性回歸方程中A表示峰面積，ψ表示假尿苷含量，r表示線性相關系數(shù)。
全文摘要
用高效液相色譜(簡寫HPLC)直接測定人尿中假尿嘧啶核苷(簡稱假尿苷)，再通過分光光度法同時測出肌酐，分別用假尿苷和假尿苷(nmol/ml)/肌酐(μmol/ml)作為鼻咽癌和肺癌的標志物。同時，將該標志物分別用于鼻咽癌和肺癌的早期診斷、監(jiān)測其放療和化療臨床效果。本法簡便可靠，陽性檢出率高，測定一個樣品的實際操作只需2小時。
文檔編號G01N33/574GK1051980SQ90106198
公開日1991年6月5日 申請日期1990年12月18日 優(yōu)先權日1990年12月18日
發(fā)明者王科太, 弋昌厚 申請人:四川大學