專(zhuān)利名稱：細(xì)胞電位測(cè)量電極及使用這種電極的測(cè)量設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及低阻抗細(xì)胞電位測(cè)量電極組件，其通常在絕緣基底上具有多個(gè)微電極以及具有包圍包括微電極的區(qū)域的一個(gè)壁。該裝置適于使用微電極測(cè)量被監(jiān)測(cè)樣本的電生理學(xué)活性，同時(shí)在微電極區(qū)域內(nèi)培養(yǎng)那些細(xì)胞或細(xì)胞組織。本發(fā)明利用獨(dú)立參考電極來(lái)降低整個(gè)系統(tǒng)的阻抗并從而降低測(cè)量數(shù)據(jù)中通常固有的噪聲。最好通過(guò)用于控制被監(jiān)測(cè)樣本周?chē)h(huán)境的物理壁來(lái)包圍微電極。
細(xì)胞電位測(cè)量設(shè)備已被改進(jìn)用于測(cè)量活性或由神經(jīng)細(xì)胞、其它細(xì)胞、或細(xì)胞組織(例如，日本的Kokai 8-62209)的活性產(chǎn)生的電位，而不用將玻璃電極或類(lèi)似物插入所述細(xì)胞中。
通過(guò)將玻璃電極或類(lèi)似物插入細(xì)胞中來(lái)測(cè)量細(xì)胞電位可能會(huì)破壞該細(xì)胞。細(xì)胞電位的長(zhǎng)時(shí)間測(cè)量非常困難。同時(shí)測(cè)量多個(gè)位置更加困難；存在對(duì)能放置到測(cè)量電極陣列中的電極數(shù)量的限制，以及同樣難于充分確定測(cè)量電極上樣本的位置。相反，使用基底上具有多個(gè)微電極的細(xì)胞電位測(cè)量電極(具有包圍包括微電極的區(qū)域的一個(gè)壁)，允許在由壁包圍的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。并允許同時(shí)測(cè)量多個(gè)位置的電位而不會(huì)破壞那些細(xì)胞。
這些細(xì)胞電位測(cè)量裝置測(cè)量相對(duì)于參考電位的細(xì)胞電位。在Kokai8-62209中討論了一種這樣的方法。當(dāng)通過(guò)將一個(gè)微電極用作參考電位(即，用作連接到培養(yǎng)基電位的公共參考電極)，將64個(gè)微電極布置為8列8排時(shí)，通過(guò)使用剩余的63個(gè)微電極可同時(shí)測(cè)量其它63個(gè)位置的細(xì)胞電位。
然而，當(dāng)測(cè)量很低的電平或微電位如細(xì)胞電位時(shí)，噪聲是一個(gè)問(wèn)題。噪聲電平隨參考電極的選擇形式和位置極大地變化。如上所述，當(dāng)使用一個(gè)微電極作為參考電極時(shí)，由于高的噪聲電平，通過(guò)使用剩余的63個(gè)微電極來(lái)同時(shí)測(cè)量其它63個(gè)位置的電位是不可能的。當(dāng)參考電極和測(cè)量電極為一個(gè)接一個(gè)彼此對(duì)應(yīng)時(shí)，可在非常低的噪聲電平狀態(tài)下測(cè)量電位；但是，如果使用64個(gè)微電極，例如，相當(dāng)于32個(gè)參考電極和32個(gè)測(cè)量電極，僅能同時(shí)測(cè)量32個(gè)位置。
理論上，必須限制參考電極的數(shù)量以同時(shí)測(cè)量盡可能多位置的電位。
如Kokai 8-62209中的

圖14中所示，用布置成一排的8個(gè)微電極作為參考電極并且7個(gè)測(cè)量電極中的每個(gè)和每個(gè)參考電極相關(guān)聯(lián)，從而可同時(shí)測(cè)量7×8=56個(gè)位置的電位。如果用56個(gè)微電極作為測(cè)量電極，即，通過(guò)使用布置成一排的8個(gè)微電極作為參考電極，與使用所有64或63個(gè)作為測(cè)量電極的情況相比，測(cè)量點(diǎn)的損耗約為12％。然而，甚至當(dāng)7個(gè)測(cè)量電極和一個(gè)參考電極同時(shí)使用時(shí)，噪聲依然很大。由于噪聲，難于檢測(cè)細(xì)胞電位的微小變化。
而且，如Kokai 8-62209中的圖14中所示，當(dāng)在多個(gè)微電極上放置細(xì)胞或細(xì)胞組織的切片S時(shí)，不應(yīng)將切片S放置在用作參考電極的微電極的排上。由于當(dāng)通過(guò)顯微鏡觀察該切片時(shí)，切片S必須用鑷子夾持并移動(dòng)，所以這樣的放置需要技巧并很困難。放置切片S使得一排中的8個(gè)微電極被完全暴露同時(shí)剩余的56個(gè)微電極用該切片覆蓋是極其困難的。如果切片S被放置為使得一排中的8個(gè)微電極被完全暴露，通常剩余的56個(gè)中的一些也被暴露，從而減少了同時(shí)測(cè)量的位置數(shù)。
本發(fā)明旨在解決這樣的問(wèn)題。本發(fā)明提供一種對(duì)噪聲不敏感的細(xì)胞電位測(cè)量電極，并且如果在放置要測(cè)量的細(xì)胞或細(xì)胞組織的切片時(shí)定位不精確，通過(guò)有效利用所有可用微電極也能夠同時(shí)測(cè)量很多位置的電位。
本發(fā)明的細(xì)胞電位測(cè)量電極最好包括在絕緣基片上的多個(gè)微電極、用于將微電極連接到微電極區(qū)域外的一些范圍上的導(dǎo)電圖形、連接到該導(dǎo)電圖形端部的電觸點(diǎn)、覆蓋導(dǎo)電圖形表面的絕緣膜、以及包圍包括絕緣膜表面上的微電極的區(qū)域的一個(gè)壁。本發(fā)明的參考電極具有比測(cè)量微電極的阻抗更低的阻抗。它們分別放置在由壁包圍的區(qū)域中的多個(gè)位置上并通常與微電極有特定距離。電觸點(diǎn)通常還被連接到用于每個(gè)參考電極布線的導(dǎo)電圖形和導(dǎo)電圖形端部之間。用于參考電極布線的導(dǎo)電圖形的表面通常用絕緣膜覆蓋。
根據(jù)本發(fā)明，由于專(zhuān)用的參考電極被設(shè)在遠(yuǎn)離多個(gè)測(cè)量微電極區(qū)域的多個(gè)位置上，所以易于將細(xì)胞樣本切片放置為覆蓋所有微電極而不與參考電極接觸。參考電極通常具有，例如，比測(cè)量微電極更大的區(qū)域，從而阻抗更小。因此，即使通常被連接到測(cè)量位置的多個(gè)參考電位，噪聲電平也是很小的。所以，公共參考電極可與多個(gè)測(cè)量微電極同時(shí)使用。此外，由于多個(gè)參考電極的每個(gè)負(fù)責(zé)多個(gè)測(cè)量電極，通過(guò)使用所有的微電極，細(xì)胞電位可容易地被同時(shí)測(cè)量。
優(yōu)選地，多個(gè)參考電極被放置成與多個(gè)微電極區(qū)域有幾乎相等距離和幾乎相等角度的間隔?！皫缀跸嗟冉嵌鹊拈g隔”意味著當(dāng)從上面觀察多個(gè)微電極區(qū)域時(shí)，多個(gè)參考電極從該區(qū)域在等角射線上延伸。更好地，以矩陣的形式放置多個(gè)微電極，其中的4個(gè)參考電極被設(shè)置在保持該矩陣的區(qū)域?qū)茄由炀€上。在這樣的對(duì)稱布置中，每個(gè)微電極的噪聲電平被平均。
作為一個(gè)具體的例子，微電極位于側(cè)邊為例如0.8至2.2mm(在300μm微電極間距的情況中)或0.8至3.3mm(在450μm微電極間距的情況中)的矩形陣列中。4個(gè)參考電極位于一側(cè)為5至15mm的矩形的四個(gè)角上。更好地，64個(gè)微電極被以約100至450μm的中心間距布置為8排8列，最好約為100至300μm。
為了將參考電極的阻抗設(shè)為比微電極的阻抗足夠小，參考電極區(qū)域優(yōu)選是微電極區(qū)域的4至25倍(更好為16倍)。作為一個(gè)具體的例子，每個(gè)微電極的區(qū)域優(yōu)選約在4×102和4×104μm2之間，并且每個(gè)參考電極的區(qū)域優(yōu)選約在64×102和64×104μm2之間。
優(yōu)選地，微電極和參考電極由相同的材料形成以簡(jiǎn)化制造過(guò)程并獲得成本效益。更優(yōu)選地，微電極和參考電極由銦-錫氧化物(ITO)膜上的鍍鎳、鍍金和鉑黑層形成。鍍鉑后，參考電極的阻抗優(yōu)選約在2-3千歐之間。
絕緣基底(例如，玻璃基底)可以是接近為正方形。多個(gè)電觸點(diǎn)可被連接到導(dǎo)電圖形的端部并優(yōu)選被放置在絕緣基底的四個(gè)側(cè)邊上。結(jié)果，易于設(shè)計(jì)多個(gè)微電極和參考電極的布線圖。由于使得電觸點(diǎn)的間距相對(duì)較大，通過(guò)電觸點(diǎn)與外部單元的電連接同樣很容易。
微電極區(qū)域通常很小。當(dāng)通過(guò)顯微鏡觀察樣本時(shí)，難于區(qū)分位置與垂直和橫向方向。希望將索引微標(biāo)放置到微電極區(qū)域附近以允許通過(guò)顯微鏡可視地識(shí)別不同的方向、軸、和位置。
本發(fā)明的最優(yōu)選細(xì)胞電位測(cè)量設(shè)備由具有細(xì)胞電位測(cè)量電極的細(xì)胞放置裝置、用于與電觸點(diǎn)接觸的觸點(diǎn)、以及用于通過(guò)從上和下夾持來(lái)固定絕緣基底的電極夾持器組成。在本發(fā)明的一個(gè)改型中，信號(hào)處理器被放置在微電極矩陣或區(qū)域附近。細(xì)胞電位測(cè)量電極可被電連接到細(xì)胞放置組件裝置上，從而處理樣本產(chǎn)生的并在每個(gè)這樣的微電極和參考電極之間測(cè)量的電壓信號(hào)。細(xì)胞電位測(cè)量組件通常包括由壁包圍的一個(gè)區(qū)域，用于培養(yǎng)樣本細(xì)胞或細(xì)胞組織。其最好還包括一個(gè)光學(xué)裝置，用于光學(xué)地放大并觀察由壁包圍的一個(gè)區(qū)域中培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞組織。該細(xì)胞電位測(cè)量設(shè)備最好還包括一個(gè)用于存儲(chǔ)通過(guò)光學(xué)裝置獲得的放大圖象的圖象存儲(chǔ)裝置。
圖1是表示本發(fā)明細(xì)胞電位測(cè)量設(shè)備的整體結(jié)構(gòu)的方框圖。
圖2是包括本發(fā)明細(xì)胞電位測(cè)量設(shè)備的細(xì)胞放置裝置的分解圖。
圖3是表示細(xì)胞電位測(cè)量設(shè)備和用于其布線的導(dǎo)電圖形的中部的微電極的一個(gè)例子的局部平面圖。
圖4是表示細(xì)胞電位測(cè)量電極的整體結(jié)構(gòu)的平面圖。
圖5是細(xì)胞電位測(cè)量電極的一個(gè)斷面的示意圖。
圖6是表示通過(guò)上下夾持器夾持來(lái)固定細(xì)胞電位測(cè)量電極的一個(gè)狀態(tài)的平面圖和側(cè)斷面圖。
圖7是細(xì)胞電位測(cè)量電極和圖6中的上和下夾持器的透視圖。
圖8是設(shè)在上夾持器中的觸點(diǎn)金屬配件的側(cè)視圖。
圖9是表示在設(shè)在細(xì)胞電位測(cè)量電極中的參考電極為50微米見(jiàn)方大小的情況中的噪聲電平的波形圖。
圖10是表示在設(shè)在細(xì)胞電位測(cè)量電極中的參考電極為50微米見(jiàn)方大小的情況中的噪聲電平的波形圖。
圖11是表示在設(shè)在細(xì)胞電位測(cè)量電極中的參考電極為200微米見(jiàn)方大小的情況中的噪聲電平的波形圖。
圖12是表示使用常規(guī)細(xì)胞電位測(cè)量電極的細(xì)胞電位測(cè)量方法的一個(gè)例子的方框圖。
圖1表示使用根據(jù)本發(fā)明制作的細(xì)胞電位測(cè)量電極和參考電極的整個(gè)細(xì)胞電位測(cè)量設(shè)備的一個(gè)典型個(gè)例子。該細(xì)胞電位測(cè)量設(shè)備包括一個(gè)組合的細(xì)胞放置裝置1、一個(gè)光學(xué)觀察裝置20、一個(gè)計(jì)算機(jī)30、和一個(gè)用于維持樣本培養(yǎng)環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)40，其中，細(xì)胞放置裝置1包括本發(fā)明細(xì)胞電位測(cè)量電極、光學(xué)觀察裝置20包括一個(gè)倒置顯微鏡21以用于光學(xué)地測(cè)量放在細(xì)胞放置裝置1中的樣本或細(xì)胞，計(jì)算機(jī)30用于產(chǎn)生一個(gè)刺激信號(hào)到細(xì)胞并用于處理細(xì)胞的輸出信號(hào)。
除了細(xì)胞放置裝置被放置在其上的倒置顯微鏡21外，光學(xué)觀察裝置20還包括一個(gè)用于顯微鏡21的SIT攝象機(jī)22、一個(gè)高清晰度顯示器23、和一個(gè)圖象存儲(chǔ)裝置24。高清晰度顯示器23還可用作計(jì)算機(jī)30的顯示器。
計(jì)算機(jī)30通常是其中安裝有測(cè)量軟件的個(gè)人計(jì)算機(jī)(PC)。計(jì)算機(jī)30和細(xì)胞放置裝置1通過(guò)一個(gè)用于測(cè)量的I/O板被連接。I/O板包括一個(gè)A/D轉(zhuǎn)換器31和一個(gè)D/A轉(zhuǎn)換器32。A/D轉(zhuǎn)換器31通常用于測(cè)量和轉(zhuǎn)換獲得的電位；而D/A轉(zhuǎn)換器32是對(duì)樣本的刺激信號(hào)。例如，A/D轉(zhuǎn)換器31可具有16位、64信道、以及D/A轉(zhuǎn)換器32具有16位、8信道。
安裝在計(jì)算機(jī)30中的測(cè)量軟件可包括用于設(shè)置產(chǎn)生刺激信號(hào)條件、形成刺激信號(hào)、以及用于記錄獲得的檢測(cè)信號(hào)的軟件。通過(guò)使用這樣的測(cè)量軟件，計(jì)算機(jī)30可包括用于產(chǎn)生細(xì)胞刺激信號(hào)的裝置和用于處理從細(xì)胞檢測(cè)到的信號(hào)的裝置。計(jì)算機(jī)30也可控制光學(xué)觀察裝置(SIT攝象機(jī)和圖象存儲(chǔ)裝置)和細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。
下面逐屏來(lái)描述理想測(cè)量軟件的功能概況。
在一個(gè)參數(shù)設(shè)置屏上，通過(guò)用鍵盤(pán)或鼠標(biāo)在屏幕上畫(huà)出刺激波形來(lái)設(shè)置復(fù)雜的刺激條件。如果記錄條件的設(shè)置為64輸入信道和10kHz的抽樣率，計(jì)算機(jī)能處理連續(xù)的記錄達(dá)幾小時(shí)。而且，可通過(guò)用鼠標(biāo)或鋼筆指出顯示在屏幕上的顯微鏡圖象來(lái)指定提供刺激信號(hào)的電極和拾取細(xì)胞的檢測(cè)信號(hào)的電極。通過(guò)鍵盤(pán)可理想地設(shè)置細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)40的溫度、pH、和其它條件。
在記錄屏上，可實(shí)時(shí)顯示從細(xì)胞檢測(cè)到的自發(fā)活動(dòng)電位或感應(yīng)電位。另外，通過(guò)在細(xì)胞的顯微鏡圖象上覆蓋可顯示被記錄的自發(fā)活動(dòng)、電位或感應(yīng)電位。當(dāng)測(cè)量感應(yīng)電位時(shí)，顯示整個(gè)被記錄的波形。當(dāng)用限幅鑒頻器或波形識(shí)別器通過(guò)尖峰信號(hào)檢測(cè)功能來(lái)測(cè)量自發(fā)活動(dòng)電位時(shí)，被記錄的波形僅在檢測(cè)到自發(fā)活動(dòng)的產(chǎn)生時(shí)被顯示。與被記錄波形的顯示一起，也可實(shí)時(shí)顯示測(cè)量參數(shù)(如，激勵(lì)條件、記錄條件、溫度、pH等)。同時(shí)設(shè)有報(bào)警功能，用于當(dāng)溫度或pH等超出允許范圍時(shí)報(bào)警。
關(guān)于數(shù)據(jù)分析或處理，傅立葉函數(shù)變換(FFT)分析、一致性分析、和相干性分析是所希望的?？捎玫墓δ芸砂ㄊ褂貌ㄐ巫R(shí)別的單個(gè)尖峰信號(hào)分離功能、暫時(shí)外形顯示功能、形態(tài)顯示功能、和電流源通量分析功能。可通過(guò)在圖象存儲(chǔ)裝置中存儲(chǔ)的顯微鏡圖象上覆蓋來(lái)顯示這些分析結(jié)果。
當(dāng)從計(jì)算機(jī)30發(fā)出刺激信號(hào)時(shí)，通過(guò)D/A轉(zhuǎn)換器32和隔離器33將該刺激信號(hào)送到細(xì)胞放置裝置上。細(xì)胞放置裝置1包括一個(gè)細(xì)胞電位測(cè)量電極，如后面所述，其由以矩陣式排列在玻璃基底上的64個(gè)微電極形成，并具有一個(gè)用于保持樣本(如，細(xì)胞或細(xì)胞組織的切片)與微電極及其培養(yǎng)液接觸的包圍壁。被送到細(xì)胞放置裝置1上的刺激信號(hào)被提供到64個(gè)微電極之外的任意電極上并接著被提供到樣本上。
出現(xiàn)在每個(gè)微電極和參考電位(其是培養(yǎng)液的電位)之間的感應(yīng)的、引發(fā)的或自然電位通過(guò)64信道高靈敏放大器34和A/D轉(zhuǎn)換器到計(jì)算機(jī)30中。放大器34的放大系數(shù)可以是，如，約80至100dB，例如，在頻帶約為0.1至10kHz，或至20Hz。然而，當(dāng)用低通濾波器測(cè)量由刺激信號(hào)感應(yīng)的電位時(shí)，頻帶約為100Hz至10kHz。自然電位通常被用于100Hz至20kHz的范圍中。
細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)40通常包括一個(gè)溫度控制器41、一個(gè)培養(yǎng)液循環(huán)裝置42、以及一個(gè)用于提供如空氣和二氧化碳的混合氣體的進(jìn)給裝置43。細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)40可被代替為由商用微型培養(yǎng)箱、溫度控制器、和二氧化碳汽缸組成。微型培養(yǎng)箱可被用于通過(guò)珀?duì)柼刂圃?至50℃溫度范圍內(nèi)，可應(yīng)用于3.0ml/min或更小的液體進(jìn)給速率和1.0升/分鐘或更小的氣體流速?；蛘撸墒褂醚b有溫度控制器的微型培養(yǎng)箱。
參考圖2中的分解圖，詳細(xì)說(shuō)明細(xì)胞放置裝置1的結(jié)構(gòu)(圖1中所示)。優(yōu)選的細(xì)胞放置裝置1可由一個(gè)細(xì)胞電位測(cè)量電極(也稱為集成多電極或微電極組件)、夾持器3和4、以及用于固定夾持器的印刷線路板5組成，其中細(xì)胞電位測(cè)量電極2具有一個(gè)設(shè)在透明玻璃基底上的圓柱形壁6并在其內(nèi)側(cè)區(qū)域具有多個(gè)微電極，夾持器3、4被分為兩部分用于通過(guò)從上面和下面夾持來(lái)固定細(xì)胞電位測(cè)量電極2。
圖3示出了該玻璃基底的詳細(xì)情況。構(gòu)成細(xì)胞電位測(cè)量電極(集成多電極)2的玻璃基底的大小為厚1.1mm，并約為50微米見(jiàn)方。在該玻璃基底的中部，64個(gè)微電極11被形成在8x8的矩陣式中。微電極被相互絕緣并與參考電極絕緣。用于布線的導(dǎo)電圖形12被連接到每個(gè)微電極11上。微電極11可以約為50微米見(jiàn)方，以及相鄰電極中心之間的距離約為150微米。描述的64個(gè)微電極11從而被表示在8×8的矩陣式中，形成的矩形區(qū)的一個(gè)側(cè)邊約為1.1mm。
盡管本發(fā)明的描述包括特殊大小和區(qū)域的許多具體參數(shù)，但本發(fā)明并不局限于此；其僅用于引導(dǎo)目的并不界定本發(fā)明，已描述的除外。
而且，如圖4中所示，參考電極10形成在從玻璃基底中部矩形區(qū)域的對(duì)角延伸線上的四個(gè)位置，微電極設(shè)在所述基底上。參考電極彼此絕緣并與微電極絕緣。這些參考電極10也通過(guò)用于與微電極11同樣布線的導(dǎo)電圖形12被連接到位于玻璃基底四個(gè)側(cè)邊上的電觸點(diǎn)7上。參考電極10以與微電極11同樣的過(guò)程形成，如下所述，但是大小極大地大于例如一邊約為200微米的矩形微電極11的大小。因此，與約50微米見(jiàn)方的微電極11之一相比，矩形區(qū)域較大，優(yōu)選約為大于16倍，以及通過(guò)該部分，參考電極10的阻抗比微電極11的阻抗小。
參考電極10的位置優(yōu)選在從璃基底中部的矩形區(qū)域的對(duì)角延伸線上，微電極設(shè)在所述基底上。在這種改型中的參考電極10位于距矩形區(qū)域中心約6mm的位置。換句話說(shuō)，其被放置在一邊約8.5mm的正方形的四個(gè)角上。
此外，如圖4中所示，在玻璃基底的四個(gè)邊的每個(gè)上有17個(gè)電觸點(diǎn)7。這些電觸點(diǎn)7通過(guò)導(dǎo)電圖形12被連接(一個(gè)接一個(gè))到64個(gè)微電極11的每個(gè)和四個(gè)參考電極10上。17個(gè)電觸點(diǎn)的間距被理想地間隔成通用連接器的間距1.27mm。以下通過(guò)參考圖5中的斷面圖來(lái)說(shuō)明這種集成多電極2的制造過(guò)程。圖5中的描述，為了易于說(shuō)明，并非按比例的。
在玻璃基底13的表面上，提供了一個(gè)厚為150nm的ITO(銦錫氧化物)膜，并通過(guò)光刻膠和蝕刻形成導(dǎo)電圖形12。厚約為1.4微米的負(fù)感光性聚酰亞胺膜被設(shè)在其上，并形成一個(gè)絕緣膜14。在微電極11(或可選擇的參考電極100)和電觸點(diǎn)7部分上，ITO膜被暴露，接著進(jìn)行厚為500nm的鍍鎳15和厚為50nm的鍍金16。
通過(guò)使用硅樹(shù)脂粘合劑(參見(jiàn)圖2和圖4)，相應(yīng)于內(nèi)徑約為22mm、外徑約為25mm、以及高為8mm的壁的聚苯乙烯或玻璃圓柱件6可以被放置在玻璃基底的中部上。最優(yōu)選的粘合劑為RTV(室溫硫化)硅樹(shù)脂、特別是使用酸固化系統(tǒng)的那些物質(zhì)。由于固化步驟中產(chǎn)生的醋酸，這些物質(zhì)產(chǎn)生低毒性。兩個(gè)有用的種類(lèi)包括KE42T(Shin-EtsuSilicone)和Silastic Medical Adhesive Silicone Type A(Dow Coning)。圓柱形壁件6被示出，但壁可以是橢圓的，從而能便于樣本取放。壁件6附貼在玻璃基底的中部，即，成為與其中設(shè)有64個(gè)微電極的矩形區(qū)域的中部成一線的狀態(tài)。在由該圓柱件6包圍的區(qū)域中，培養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞組織。該圓柱件6填充有，如，1wt.％的氯鉑酸、0.01wt.％的醋酸鉛、和0.0.25wt.％的鹽酸水溶液，以及通過(guò)通入20mA/cm2的電流1分鐘，鉑黑11a(或可替換地，參考電極鉑黑10a)被沉淀在微電極11和參考電極10的表面上。
圓柱件6內(nèi)的區(qū)域有時(shí)被稱為“測(cè)量區(qū)域”其包括包含微電極11和參考電極10的區(qū)域。參考電極被放置在圓柱件6的內(nèi)表面上也在本在集成多電極2的一個(gè)角，設(shè)有索引或表示方向的箭頭標(biāo)記17，用與微電極11和參考電極10相同的制作過(guò)程來(lái)形成該箭頭標(biāo)記17。然而，表面僅涂敷有鍍金層，并沒(méi)有形成鉑黑。箭頭標(biāo)記17的長(zhǎng)度和寬度都約為5毫米。而且，在設(shè)置微電極11的矩形區(qū)域的一個(gè)角附近，設(shè)有一個(gè)小的索引標(biāo)記，例如，與箭頭標(biāo)記相似的微標(biāo)記18。用肉眼看不到該微標(biāo)記18，但通過(guò)測(cè)量裝置的光學(xué)觀察裝置可從放大的示圖中分辨出與箭頭標(biāo)記17一樣的圖形，從而可識(shí)別方向、位置、軸等。象箭頭標(biāo)記17一樣，用與微電極11和參考電極10相同的制作過(guò)程也可形成該箭頭標(biāo)記18。
在圖2中，集成多電極2被夾在夾持器3和4之間，以同樣的方式進(jìn)行電連接。夾持器3、4通常是聚合物的。臺(tái)階部分用于夾持集成多電極2的邊緣，中部形成有矩形開(kāi)口。上夾持器3設(shè)有一對(duì)扣件8和17×4對(duì)觸頭金屬區(qū)域9。圖6(A)示出了用于夾住并固定集成多電極2的夾持器3，4的俯視圖，圖6(B)為其側(cè)視圖(斷面B-B)，以及圖7為其立體后視圖。如這些圖所示出的，扣件8由上夾持器3的兩個(gè)對(duì)面?zhèn)壬系妮S銷(xiāo)8a支持并可繞其旋轉(zhuǎn)。如圖7中所示，槽4a形成在下夾持器4后側(cè)的兩個(gè)對(duì)面?zhèn)戎?。扣?的突起8b裝在槽4a中，上、下夾持器3、4在夾住集成多電極2的狀態(tài)中被緊緊固定。
通過(guò)加工彈性和導(dǎo)電的金屬板如鍍鎳和金的鈹-銅彈簧用合金，形成設(shè)在上夾持器3上并與集成多電極2的電觸點(diǎn)7對(duì)應(yīng)的全部68個(gè)觸點(diǎn)金屬配件9。金屬配件9具有如圖8中所示的截面形狀。即，金屬配件9包括一個(gè)銷(xiāo)9a、其基底部分9b、和通過(guò)一個(gè)曲部9c從基底部分9b延伸出的動(dòng)觸點(diǎn)部分9d。在這種結(jié)構(gòu)中，動(dòng)觸點(diǎn)部分9d可從基底部分9b彈性地移位。在上夾持器3中，在68個(gè)(17×4)位置中形成用于插入觸點(diǎn)金屬配件9的銷(xiāo)9a的孔和用于安裝基底部分9b的槽。
如圖2和圖6(B)中所示，由于觸點(diǎn)金屬配件9被插入和固定在孔和槽中，銷(xiāo)9a從上夾持器3上突起。觸點(diǎn)金屬配件9具有基底部分9b的長(zhǎng)度不同的兩種形式。交替地布置兩種大小的配件9，沿兩種Z形排來(lái)布置從上夾持器突出的16個(gè)銷(xiāo)9a。如下文所述的那樣，這些銷(xiāo)9a被連接到裝在印刷線路板5上的連接器上以與外部連接。
當(dāng)觸點(diǎn)金屬配件9被插入并附貼于上夾持器3的孔和槽中時(shí)，觸頭金屬配件9的動(dòng)觸點(diǎn)部分9d從上夾持器的下側(cè)突出。由于夾持器3、4被固定到集成多電極2的兩側(cè)上，每個(gè)觸點(diǎn)金屬配件9的動(dòng)觸點(diǎn)部分9d與集成多電極2的電觸點(diǎn)7接觸，并且通過(guò)曲部9c的彈性變形，給定的接觸壓力被施加到觸點(diǎn)區(qū)域。這樣，用于通過(guò)導(dǎo)電圖形12連接到集成多電極2的微電極11和參考電極10上的電觸點(diǎn)7以與觸點(diǎn)金屬配件9相比較在低接觸電阻(30毫歐或更小)處被電連接。
如上所述，在與集成多電極2電接觸的狀態(tài)下緊緊固定集成多電極2的夾持器3、4被電連接并被固定到印刷線路板5上，如圖2中所示。從集成多電極2的微電極11和參考電極10到導(dǎo)電圖形12、電觸點(diǎn)7和觸點(diǎn)金屬配件9的電連接通過(guò)印刷線路板5被進(jìn)一步連接到上述細(xì)胞電位測(cè)量設(shè)備上。通過(guò)使用印刷線路板5簡(jiǎn)化了測(cè)量設(shè)備上集成多電極的處理過(guò)程。
如圖2中所示，印刷線路板5可以由如玻璃環(huán)氧樹(shù)脂雙面基底制成。連接器5a設(shè)在形成于印刷電路板5中部的圓形開(kāi)口的周?chē)膫€(gè)位置的后側(cè)。由于從上夾持器3的表面上的四個(gè)位置以兩種Z形排突出的16個(gè)銷(xiāo)9a被插入到各相應(yīng)連接器5a中，集成多電極2和夾持器3、4的組件被固定到印刷線路板5上并被電連接。
在印刷線路板5的兩個(gè)邊緣5b，可看到兩個(gè)邊緣連接器的2.54mm間距的電觸點(diǎn)。這些電觸點(diǎn)和中心連接器5a被連接到導(dǎo)電圖形5c中。兩個(gè)連接器5a的內(nèi)排通過(guò)表面圖形被布線，而外排通過(guò)后側(cè)圖形布線，以及34每個(gè)在兩個(gè)邊緣5b的表面和后側(cè)上，也就是說(shuō)，形成總共68個(gè)電觸點(diǎn)。為了使得機(jī)械固定可靠，通過(guò)用螺釘緊固，上夾持器3可被固定到印刷線路板5上。
通過(guò)圖4來(lái)描述集成多電極2的參考電極10。參考電極10通常浸入培養(yǎng)液中作為測(cè)量每個(gè)微電極中產(chǎn)生的電位的參考電位。因此，每個(gè)微電極11被連接到放大器34(圖1)的一個(gè)輸入端上，參考電極10被連接到每個(gè)放大器的參考電壓端上。64信道放大器被分成每組16信道的4組，四個(gè)參考電極的每個(gè)通常被共同連接到用于16信道的一組參考電壓端上。
首先，如圖4中所示出的，優(yōu)選地，把4個(gè)參考電極10定位在包含微電極11的中部矩形區(qū)域的對(duì)角延伸線上。通常，這是為了便于圖形布線。而且，為了易于放置細(xì)胞或細(xì)胞組織的切片以覆蓋所有的64個(gè)微電極而不覆蓋四個(gè)參考電極，設(shè)在微電極11的中部矩形區(qū)域和參考電極10之間的距離應(yīng)當(dāng)合理地盡可能大。此外，通過(guò)與矩形區(qū)域的中部等距離放置四個(gè)參考電極10，出現(xiàn)在每個(gè)微電極中的噪聲電平大致均勻。盡管上文已精確指定了參考電極的位置，但數(shù)值并不是絕對(duì)的，其僅用于指導(dǎo)。
參考電極10的大小可以是上述微電極區(qū)域的4-64倍，優(yōu)選約為16倍。結(jié)果，阻抗平衡于放大器的測(cè)量電位輸入側(cè)和參考電位輸入側(cè)之間，并使得噪聲最小。例如，通過(guò)以提到的相同處理過(guò)程形成微電極和參考電極并通過(guò)設(shè)置參考電極的面積是微電極面積的16倍，16個(gè)微電極的阻抗和一個(gè)參考電極的阻抗近似相等。
例子該例子示出了包括如上所述的集成多電極的系統(tǒng)和50微米見(jiàn)方以及200微米見(jiàn)方的參考電極之間的噪聲電平的區(qū)別。圖9和10示出了那些可比的噪聲電平。
我們制作分別具有50微米見(jiàn)方的參考電極和200微米見(jiàn)方的參考電極的集成多電極(如圖4中所示)。每個(gè)集成多電極具有圓柱件6。如通常用于細(xì)胞組織培養(yǎng)的相同培養(yǎng)媒質(zhì)被放置在圓柱件6內(nèi)。為了限制所產(chǎn)生的信噪比，沒(méi)有細(xì)胞或細(xì)胞組織放置到微電極上。如圖11中所示，在64個(gè)微電極中，中間的7個(gè)位置(信道I至5、7、8)被測(cè)量。
圖9表示50微米見(jiàn)方的參考電極的噪聲波形圖，圖10是200微米見(jiàn)方的參考電極的噪聲波形圖。在每個(gè)圖中，縱軸上的電壓為0.02mV/div，橫軸上的時(shí)間為5.0ms／div。比較圖9和圖10可見(jiàn)，與50微米見(jiàn)方的參考電極(圖9)相比，當(dāng)參考電極為200微米見(jiàn)方(圖10)時(shí)，噪聲電平明顯較小。另外，如現(xiàn)有技術(shù)中描述的那樣，通過(guò)使用64個(gè)微電極之一作為負(fù)責(zé)16個(gè)微電極的參考電極，噪聲電平與圖9中一樣大。
如這里所說(shuō)的，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞電位測(cè)量電極和設(shè)備，噪聲影響小，并且如果設(shè)置需要測(cè)量的細(xì)胞或細(xì)胞組織的切片時(shí)定位不很精確時(shí)，所有的微電極被有效地利用，并可同時(shí)測(cè)量多點(diǎn)的電位。
權(quán)利要求
1．一種細(xì)胞電位測(cè)量電極組件，其適于測(cè)量神經(jīng)系統(tǒng)樣本中的電位，包括a.多個(gè)測(cè)量微電極，其互相絕緣并位于測(cè)量區(qū)域中的絕緣基底上。b.多個(gè)參考電極，在所述測(cè)量區(qū)域互相絕緣，當(dāng)以lkHz，50mA在覆蓋所述測(cè)量區(qū)域的電解液中測(cè)量時(shí)，每個(gè)所述多個(gè)參考電極具有小于每個(gè)所述測(cè)量電極的阻抗。
2．權(quán)利要求1的細(xì)胞電位測(cè)量電極組件，其中多個(gè)參考電極中每個(gè)的面積大于多個(gè)測(cè)量電極中每個(gè)的面積。
3．權(quán)利要求2的細(xì)胞電位測(cè)量電極組件，其中多個(gè)參考電極中每個(gè)的面積是多個(gè)測(cè)量電極中每個(gè)的面積的4至25倍。
4．權(quán)利要求2的細(xì)胞電位測(cè)量電極組件，其中所述多個(gè)測(cè)量電極中每個(gè)的面積是4×102至4×104平方微米，多個(gè)參考電極中的每個(gè)的面積的64×102至64×104平方微米。
5．權(quán)利要求1的細(xì)胞電位測(cè)量電極組件，其中多個(gè)測(cè)量微電極中的每個(gè)位于所述測(cè)量區(qū)域的陣列中。
6．權(quán)利要求1的細(xì)胞電位測(cè)量電極組件，其中64個(gè)微電極以100至450微米的中心間距被布置為8排8列。
7．權(quán)利要求1的細(xì)胞電位測(cè)量電極組件，其中多個(gè)測(cè)量微電極中的每個(gè)和多個(gè)參考電極中的每個(gè)被連接到測(cè)量區(qū)域外的位置。
8．權(quán)利要求l的細(xì)胞電位測(cè)量電極組件，其中測(cè)量區(qū)域由一個(gè)壁包圍。
9．權(quán)利要求8的細(xì)胞電位測(cè)量電極組件，其中所述壁是圓形的。
10．權(quán)利要求8的細(xì)胞電位測(cè)量電極組件，其中所述壁是橢圓形的。
11．一種細(xì)胞電位測(cè)量電極，其包括設(shè)置在絕緣基底上的多個(gè)微電極、用于所述微電極布線的導(dǎo)電圖形、連接到所述導(dǎo)電圖形的端部的電觸點(diǎn)、覆蓋所述導(dǎo)電圖形表面的絕緣膜、和包圍包含所述絕緣膜上的微電極的區(qū)域的壁，該細(xì)胞電位測(cè)量電極在由所述壁包圍的區(qū)域內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞組織時(shí)用于測(cè)量電生理學(xué)活性，其中阻抗比所述微電極小的參考電極被分別布置在由所述壁包圍的區(qū)域中的多個(gè)位置上，并與所述微電板的分布區(qū)域存在一定的距離，電觸點(diǎn)還被連接在用于每個(gè)參考電極布線的導(dǎo)電圖形和所述導(dǎo)電圖形的端部之間，并且用于所述參考電極布線的導(dǎo)電圖形表面用所述絕緣膜覆蓋。
12．權(quán)利要求11的細(xì)胞電位測(cè)量電極，其中所述多個(gè)參考電極以離所述多個(gè)微電極分布區(qū)域近似相等的距離并以近似相等的角度被布置。
13．權(quán)利要求12的細(xì)胞電位測(cè)量電極，其中所述多個(gè)微電極被布置在矩形區(qū)域中的矩陣中，所述參考電極的四個(gè)被布置在所述矩形區(qū)域的對(duì)角延伸線上。
14．權(quán)利要求13的細(xì)胞電位測(cè)量電極，其中所述微電極位于一個(gè)側(cè)邊為0.8至3.3mm的矩形的矩陣陣列中，所述4個(gè)參考電極位于一側(cè)為5至15mm的矩形的四個(gè)角上。
15．權(quán)利要求14的細(xì)胞電位測(cè)量電極，其中64個(gè)微電極以100至450微米的中心間距被布置為8排8列。
16．權(quán)利要求11的細(xì)胞電位測(cè)量電極，其中所述參考電極的面積是所述微電極面積的4至25倍。
17．權(quán)利要求16的細(xì)胞電位測(cè)量電極，其中所述參考電極的面積是所述微電極面積的16倍。
18．權(quán)利要求11的細(xì)胞電位測(cè)量電極，其中所述微電極的面積是4×102至4×104平方微米，所述參考電極的面積的64×102至64×104平方微米。
19．權(quán)利要求11的細(xì)胞電位測(cè)量電極，其中所述微電極和所述參考電極由相同的材料形成。
20．權(quán)利要求19的細(xì)胞電位測(cè)量電極，其中所述微電極和所述參考電極是在銦-錫氧化膜上設(shè)置鎳鍍層、金鍍層、和鉑黑形成。
21．權(quán)利要求11的細(xì)胞電位測(cè)量電極，其中所述絕緣基底近似為正方形，連接到所述導(dǎo)電圖形的端部的多個(gè)電觸點(diǎn)被分配并設(shè)置在所述絕緣基底的四個(gè)側(cè)邊上。
22．權(quán)利要求11的細(xì)胞電位測(cè)量電極，其中當(dāng)被放大時(shí)用于肉眼識(shí)別方向的索引微標(biāo)記被設(shè)在所述微電極布置的區(qū)域附近。
23．一種細(xì)胞電位測(cè)量設(shè)備，其包括細(xì)胞放置裝置，其具有權(quán)利要求11至12中的任意一個(gè)中的細(xì)胞電位測(cè)量電極，和用于與其電觸點(diǎn)接觸的觸點(diǎn)金屬，以及包括用于通過(guò)從上面和下面夾持來(lái)固定所述絕緣基底的電極夾持器，信號(hào)處理器，其被電連接到所述細(xì)胞放置裝置上以通過(guò)在由壁包圍的一個(gè)區(qū)域中培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞組織的活動(dòng)來(lái)處理在所述細(xì)胞電位測(cè)量電極的每個(gè)微電極和參考電極之間產(chǎn)生的電壓信號(hào)，以及光學(xué)裝置，其用于光學(xué)地放大和觀察在由壁包圍的一個(gè)區(qū)域中培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞組織。
24．權(quán)利要求23的細(xì)胞電位測(cè)量設(shè)備，還包括一個(gè)用于存儲(chǔ)由所述光學(xué)裝置獲得的放大圖象的圖象存儲(chǔ)裝置。
全文摘要
本發(fā)明涉及低阻抗細(xì)胞電位測(cè)量電極組件,其通常在絕緣基底上具有多個(gè)微電極以及具有包圍包括微電極區(qū)域的一個(gè)壁。該裝置適于使用微電極測(cè)量被監(jiān)測(cè)樣本的電生理學(xué)活性,同時(shí)在微電極區(qū)域內(nèi)培養(yǎng)那些細(xì)胞或細(xì)胞組織。本發(fā)明利用獨(dú)立參考電極來(lái)降低整個(gè)系統(tǒng)的阻抗并從而降低測(cè)量數(shù)據(jù)中通常固有的噪聲。最好通過(guò)用于控制被監(jiān)測(cè)樣本周?chē)h(huán)境的物理的壁來(lái)包圍微電極。
文檔編號(hào)G01N27/30GK1284166SQ98813315
公開(kāi)日2001年2月14日 申請(qǐng)日期1998年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月25日
發(fā)明者杉原宏和, 岡弘章, 下野健, 小川竜太, 竹谷誠(chéng) 申請(qǐng)人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社