專利名稱：：一種用于鑒定分支桿菌種類的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于鑒定造成人或動物分支桿菌感染的分支桿菌種類的方法，以及用于上述方法的診斷試劑盒。分支桿菌屬(Mycobacterium)含有50個種。它是許多種統(tǒng)稱為分支桿菌病的疾病的起因。這些疾病中最有名的、傳播最為廣泛的是由麻風分支桿菌引起的麻風病，以及由結(jié)核分支桿菌引起的肺結(jié)核。這兩種疾病感染了全世界一千萬以上的人。大多數(shù)其它的分支桿菌正常僅以環(huán)境腐生物的形式存在。然而，它們也可能會引起機會性疾病，這些疾病經(jīng)常(但不單獨)發(fā)生于免疫系統(tǒng)有問題的生物體中，如愛滋病患者或免疫抑制患者。機會性類型包括生長緩慢的種類鳥型結(jié)核分支桿菌(M.Avium)，以及緊密相關(guān)的胞內(nèi)分支桿菌(M.Intracellulare)和瘰癘分支桿菌(M.Scrofulaceum)(經(jīng)常被一起稱為MAIS復(fù)合物)、堪薩斯分支桿菌(M.Kansai)、海魚分支桿茵(M.Marinum)以及潰瘍分支桿菌(M.Ulcerans)、以及生長快速的種類龜分支桿菌(M.Chelonae)和偶發(fā)分支桿菌(M.Fortuitum)。雖然機會性分支桿菌疾病和肺結(jié)核這幾十年來在西方世界中相當罕見，但是它們隨著愛滋病的發(fā)生正在顯著增加。另外，已有報道指出分支桿菌或分支桿菌的抗原在許多其它疾病，如肉狀瘤病及節(jié)段性腸炎，以及其它的自身免疫性疾病，如自身免疫皮炎、風濕性關(guān)節(jié)炎以及糖尿病，的病理學(xué)中發(fā)揮著作用。有建議認為這種作用可被歸于分支桿菌和宿主生物體之間抗原決定簇結(jié)構(gòu)上的模仿。分支桿菌的細胞壁非常復(fù)雜，含有許多不同的脂質(zhì)，這些脂質(zhì)中有一些的結(jié)構(gòu)是這個種屬所特有的。這些結(jié)構(gòu)含有分支桿菌核透明質(zhì)酸(mycolinicacid)和酯類，肽糖酯、阿拉伯半乳聚糖以及阿拉伯甘露聚糖。分支桿菌細胞富含脂質(zhì)的細胞壁使分支桿菌具有顯著的著色特性，它們還使分支桿菌能夠抵抗宿主生物體免疫系統(tǒng)的攻擊。有一些種類在被巨噬細胞吞噬以后把自已包裹上一層厚厚的分泌的脂質(zhì)。許多不同的分支桿菌的成分與宿主生物體的免疫系統(tǒng)發(fā)生相互作用。這些組分包括蛋白和碳氫化合物抗原，它們可以由分支桿菌積極地分泌，或者也可以成為細胞壁或細胞膜的一部分。另外，它們也可以存在于細胞質(zhì)，如細胞質(zhì)基質(zhì)、核糖體和酶中。分支桿菌進而含有免疫調(diào)控成分，如免疫抑制化合物及佐劑。重要的是，一種單一的分支桿菌可以誘導(dǎo)許多不同的免疫反應(yīng)，這些反應(yīng)形式不同，有不同的特性。這使得很難獲得適合用于檢測種屬特異性體液反應(yīng)的蛋白抗原，這種檢測是對上述疾病，特別是肺結(jié)核，進行高度敏感和特異的診斷試驗的基礎(chǔ)。因為分支桿菌頻繁出現(xiàn)，所以人和動物體液幾乎任何時候都含有抗分支桿菌抗體。在過去，研究者已經(jīng)嘗試發(fā)展一種足夠敏感的分支桿菌病診斷試驗。這些嘗試的焦點主要都集中在發(fā)現(xiàn)用于檢測特異性體液免疫反應(yīng)的種屬特異性的糖脂抗體，因為蛋白抗原的特異性存在問題。在國際專利申請94/14069中，公開了利用一種生物體對占免疫優(yōu)勢的分支桿菌交聯(lián)反應(yīng)抗原成分(進而被稱為IMCRAC)的抗體反應(yīng)來發(fā)展一種分支桿菌感染的診斷試驗。IMCRAC被認為可以提供關(guān)于對具體的分支桿菌病原體的免疫識別及免疫反應(yīng)的本性的間接信息。在WO-A-94/14069中所提議的方法是基于這樣一個發(fā)現(xiàn)，即分支桿菌的臨床表現(xiàn)是與宿主個體對不同的分支桿菌的具免疫交聯(lián)反應(yīng)活性的抗原成分(ImCRAC)產(chǎn)生體液反應(yīng)的不同能力相聯(lián)系的。每一種分支桿菌感染產(chǎn)生它自己對許多種指定的抗原的特異性抗體反應(yīng)。對抗體反應(yīng)進行分析，如通過免疫印跡法，表明具免疫優(yōu)勢的IM-CRAC因分支桿菌疾病的免疫病理表現(xiàn)而異。上述的分析在感染了不同種類分支桿菌的不同個體中獲得不同的、有區(qū)別的分支桿菌抗原的條帶樣式。在免疫印跡后所獲得的這些條帶樣式可以被稱為抗原條形碼。在條形碼中所顯示的抗原抗體反應(yīng)，當被一起考慮時，是一種特定的分支桿菌所特有的。本發(fā)明的目標是提供一種在診斷試驗中用于鑒定分支桿菌種類的改進的方法。雖然在WO-A-94/14069中所描述的方法在大多數(shù)方面是令人滿意的，但是一種比其更敏感的診斷試驗仍然是合乎需求的。另外，需要一種能夠用于對早先的疫苗接種進行確定，以及對感染了分支桿菌種類的生物體的治療進行監(jiān)控的診斷試驗。在治療中，有時候會出現(xiàn)低水平的特定的抗體，它們可能會擾亂利用抗體抗原交聯(lián)反應(yīng)的試驗的準確度和/或敏感度，如上面所略述的?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過讓一種體液樣品同時與抗原和抗體接觸可以進行高敏感度的診斷試驗。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，除了抗體之外，在動物和人的體液中還存在著幾種分支桿菌成分，這些成分的存在可以通過使用交聯(lián)反應(yīng)，用選定的一套抗體可靠地進行確定。本發(fā)明因此提供了一種用于鑒定分支桿菌種類的方法，包括以下步驟a).讓至少一種分支桿菌種類的具免疫交聯(lián)反應(yīng)活性的抗原成分與一種人或動物個體的體液樣品接觸；b).讓至少一種能夠與分支桿菌抗原反應(yīng)的抗體與上述體液樣品接觸；c).檢測抗原抗體復(fù)合物的存在，鑒定分支桿菌種類在上述體液樣品中的存在。令人吃驚的是，基于上述的概念已經(jīng)發(fā)展了一種高度可靠的試驗。通過使用本發(fā)明的方法可以監(jiān)控分支桿菌疾病治療的不同階段。同時，也可以確定一個個體是否已經(jīng)接種了某種分支桿菌疾病的疫苗，也可以確定是針對哪一種分支桿菌疾病。由于并不是每個感染了分支桿菌種類的生物體都對上述感染顯示同樣的反應(yīng)，所以提供了一種可靠的試驗方法，可以對可能存在的范圍廣泛的抗原抗體進行試驗。本發(fā)明的方法可以被用于人或動物個體的任何體液樣品。當然，存在有最經(jīng)常遇到的分支桿菌種類的體液樣品所得的結(jié)果是最可靠的。合適的體液樣品的例子有血清、血液和排泄液，如痰、唾液、腦脊液、或淚液?？梢园堰@些體液直接用于本發(fā)明的方法，或者對它們進行一些形式的預(yù)處理。通常體液可以在診斷試驗之前用緩沖液進行稀釋。在一個優(yōu)選實施例中，對唾液或其溶液或制劑進行診斷試驗以鑒定分支桿菌種類。如果需要，可以用例如木甲氨喹唑(xylomethasolin)或任何其它的已知的方法處理以除去唾液中膠樣的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明還包括一種用于鑒定分支桿菌種類的診斷試驗方法，其中讓一種唾沫樣品與至少一種分支桿菌種類的具免疫交聯(lián)反應(yīng)活性的抗原成分，以及/或者至少一種能夠與分支桿菌種類反應(yīng)的抗體，進行接觸，以檢測抗原抗體復(fù)合物的存在，以及鑒定存在于唾液樣品中的分支桿菌種類。令人吃驚的是，各種不同的酶在唾液中的高含量并不擾亂診斷試驗任何范圍的可信度。在替代方法中，酶對試驗結(jié)果的影響可以被適當?shù)叵麥p。對唾液進行的一次試驗令人吃驚地證明是非常成功和可靠的。顯然，分支桿菌在唾液中有顯著的感染。與更傳統(tǒng)的體液(如血清或血液)相比較，唾液的收集和使用具有許多優(yōu)點。它收集起來相對比較容易，甚至在困難的場地條件下，這在肺結(jié)核和麻風病發(fā)病率都很高的第三世界國家中經(jīng)常遇到。另外，唾液是非侵入性的，這使得待試驗的個體可以順從試驗，它的收集需要最小限度的培訓(xùn)，并且在收集、運輸和試驗時，其生物危害的風險減少了，特別是在愛滋病感染的發(fā)病率高的地區(qū)。如上所述，根據(jù)本發(fā)明，讓一種體液樣品與抗原(或抗原制劑)以及抗體(或抗體制劑)接觸。在一個試驗中，讓一種體液樣品與僅僅一種能夠與分支桿菌抗原反應(yīng)的抗體(或其制劑)接觸，同樣也獲得了非常好的結(jié)果。本發(fā)明因此也包括一種用于鑒定分支桿菌種類的方法，包括以下步驟與至少一種可以與分支桿菌抗原反應(yīng)的抗體接觸；檢測抗原抗體復(fù)合物的存在，這是由上述抗體與分支桿菌的一種或多種抗原成分形成的；以及鑒定于上述體液樣品中的分支桿菌種類。根據(jù)本發(fā)明，可以讓體液樣品先與抗原接觸，然后再與抗體接觸，或者反之。然而，優(yōu)選的是讓體液樣品與抗原和抗體同時接觸。這可以通過，例如，讓體液樣品通過兩個表面，抗原或其制劑結(jié)合于其中的一個表面上，而抗體或其制劑結(jié)合于另外一個表面上。根據(jù)這一原則，熟練人士可以發(fā)展各種不同的診斷試驗方法。顯然，當在所選定的方法中抗原(或其制劑)是要與抗體(或其制劑)相互接觸時，所選擇的抗原和抗體必須是不能相互反應(yīng)的。所述的至少一種具免疫交聯(lián)反應(yīng)活性的抗原成分可以含有分支桿菌的全部成分或其中的一部分，或者分支桿菌的培養(yǎng)基的全部或其中一部分。大體而言，可以使用分支桿菌或其培養(yǎng)基的任何部分。這種部分可以用常規(guī)的方法獲得并有利地在施用本發(fā)明方法之前，根據(jù)WO-A-94/14069中所述的方法用電泳進行分離，以便在試驗之后提供一個條帶樣式。然而，通常蛋白也存在。根據(jù)本發(fā)明，可以分別或結(jié)合使用具有抗原作用的脂多糖或蛋白。優(yōu)選的抗原成分是選自以下非窮盡的群體KATG，MPT63(=18kD)，MPT64(=24kD)，MPT51，MTC28，Ag85a(=30-31kD)，Ag85b(=Ag6)，Ag85c，Ag5(=CIEAg78and=38kD)，DES，MPB70，80(=22/23kD)，脂低聚糖(LOS)，脂阿拉伯低聚糖(LAM)，PMB67(67kD)，異檸檬酸化氫化酶，蘋果酸脂脫氫酶，2，3二?；Ｔ逄?DAT)，石炭酸糖脂(PGL)，ESAT6(=6kD)，hsp70=DnaK=Ag63(=71kD)，CIEAg82=GroEL以及同源體(=65kD)，GroES以及同源體BCGa(=10kD)，抗原60，以及那些分子量為以下數(shù)值的抗原6kD，10/12kD，16kD，(通常稱為14kD)，18kD，19kD，21kD，22kD，23kD，24kD，28kD，29kD，30kD，30kD，區(qū)域32kD，33kD，34kD，36kD，38kD，42kD，50-55kD，60kD，65kD，67kD，71kD，88kD，以及95kD。優(yōu)選的，至少一種具免疫交聯(lián)反應(yīng)活性的抗原成分包括KP90、KS90、抗原6、KP100、或SP100部分、或分支桿菌種類制劑的培養(yǎng)基的一部分。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些抗原制劑提供了非?？煽康脑囼灲Y(jié)果。而且，它們在延長的時間內(nèi)可以足夠穩(wěn)定地被保存而不影響診斷試驗的可靠性。根據(jù)本發(fā)明與體液樣品接觸的分支桿菌種類的至少一種的抗體可以是可以與分支桿菌抗原反應(yīng)的任何抗體。這種抗原或其制劑可以用熟練人士所公知的方法獲得。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的是使用單克隆抗體，雖然使用多克隆抗體也被證明是合適的。優(yōu)選的，用IgG、IgA、IgM或它們的組合作為抗體。這些抗體已經(jīng)被證明在診斷試驗中處理非常方便導(dǎo)致令人非常滿意的結(jié)果。在一個優(yōu)選實施例中，把至少一種具免疫交聯(lián)反應(yīng)活性的抗原成分或至少一種針對分支桿菌種類的抗體固定在一個支持物上。非固體或固體支持物都可以使用。優(yōu)選的是使用固體支持物。特別優(yōu)選的是把抗原和抗體都固定于支持物上的實施例。當同時進行步驟a)和步驟b)時，已經(jīng)證明一種特別有用的試驗是以本發(fā)明的一個實施方案為基礎(chǔ)的，在這個實施例中，抗原成分和抗體被固定于同一支持物上。如上所述，在這種情形中抗體必須不與至少一種的具免疫交聯(lián)反應(yīng)活性的抗原成分發(fā)生反應(yīng)。有利的是在一層至少由一種抗體組成的層上提供一層至少由一種具免疫交聯(lián)反應(yīng)活性的抗原成分組成的層，或反之。優(yōu)選地，先把一層由至少一種具免疫交聯(lián)反應(yīng)活性地抗原成分施用于固體支持物，然后把一層由至少一種抗體組成的層使用于其上。至少一種具免疫交聯(lián)反應(yīng)活性的抗原成分通常的使用濃度為0．1至20μg/ml，優(yōu)選的是1至10μg/ml。當抗原成分被施用于支持物上時，上述成分的數(shù)量將取決于試驗和所選擇的支持物。至少一種的抗體通常的使用濃度是0.1至20μg/ml，優(yōu)選的是1至10μg/m1。當抗體成分被施用于支持物上時，上述成分的數(shù)量將取決于試驗和所選擇的支持物。所使用的至少一種具免疫交聯(lián)反應(yīng)活性的抗原成分與至少一種的抗體的比率通常是1∶10至10∶1。優(yōu)選的是1∶2至2∶1。優(yōu)選的固體支持物選自包括以下的非窮盡的一組膜，如硝酸纖維膜、浸條(dip-stick)、濾膜、球、顆粒、以及微滴定平板?？梢砸员绢I(lǐng)域公知的方法把抗原成分以及/或者抗體固定在支持物上。在體液樣品已經(jīng)與至少一種具免疫交聯(lián)反應(yīng)活性的抗原成分和至少一種的抗體接觸之后，可能形成或沒有形成抗原抗體復(fù)合物。這些復(fù)合物可以有兩種類型；這些復(fù)合物中的抗體或抗原成分可以來自體液?？梢源嬖谶@兩種復(fù)合物或者其中之一。這兩種復(fù)合物的檢測可以分別或一起進行，優(yōu)選的是同時進行。合適的檢測方法是免疫印跡，如在WO-A-94/14069所公布的，以及本領(lǐng)域已知的任何一種通常的直接或間接的標記方法。合適的標記物可以選自非窮盡的一組生物素、生物胞素、免疫生物素、異羥基洋地黃毒甙元、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白鏈菌素、膠質(zhì)染料物質(zhì)、熒光色素(如若丹明)、還原性物質(zhì)(如曙紅或視紫紅質(zhì))、(染色的)乳液溶膠、碳溶膠、金屬、金屬溶膠或其它的微粒子溶膠、丹酰細胞溶解酶、InfraRedDyes、香豆素、酶、以及碘標記物。特別優(yōu)選的是使用金標記物、膠體標記物、乳液標記物、以及酶。這些標記物使本發(fā)明的方法在所謂的快速試驗中得以被使用。在分析之后，分支桿菌種類可以被合適地鑒定。雖然可以使用任何常規(guī)的鑒定過程，但是分支桿菌種類優(yōu)選的是在一種或多種參考模式的基礎(chǔ)上被鑒定的。當然，本發(fā)明還包括一種用于上述方法的診斷試劑盒。該試劑盒包括一個支持物，在其上結(jié)合有至少一種分支桿菌的具免疫交聯(lián)反應(yīng)活性的抗原成分以及至少一種抗體，這種抗體可以與分支桿菌抗原反應(yīng)，但是不與上述的至少一種具免疫交聯(lián)反應(yīng)活性的抗原成分反應(yīng)；以及用于檢測抗原抗體存在的方法。支持物優(yōu)選的是選自以下一組膜、浸條、濾膜、球、顆粒以及微滴定平板。用于檢測的方法可以包括用如上所述的方法進行檢測的方法?，F(xiàn)在通過以下非限制性的實施例對本發(fā)明進行說明。實施例KP90/KS90的制備KP90是用來源于粗的分支桿菌質(zhì)的起始材料制備的，如WO-A-94/14069中所述(該發(fā)明的內(nèi)容作為參照引入此文中)。用1克凍干細菌制備的起始材料在90，000×g、4℃離心2小時。沉淀用PBS洗滌兩次。在洗滌步驟之間把樣品在冰上超聲處理6×30秒，每次中斷10秒，然后在90，000×g、4℃離心2小時。收集沉淀并把其重懸在10ml0.05MTris緩沖液(TBS)pH7.4中。被指定為KS90的上清可以被用作抗原。在冰上把沉淀超聲處理6×15秒，每次中斷10秒。把這一制劑指定為術(shù)語KP90。在確定了蛋白的濃度以后，把1．7ml的數(shù)量以1mg/ml的濃度(溶于25mMTBS/50％甘油)凍干并保存在-20℃。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)以下成分存在于KP90中LAM(++)，10kD(+)，16kD(+)，21kD(+)，24kD()，30kD(+/-)，31kD(-)，34kD(+/-)，38kD(-)，65kD(++)，and95kD(+)。培養(yǎng)液體部分的制備在培養(yǎng)結(jié)核分支桿菌3周之后，通過離心和過濾把細菌除去。通過0-45％的硫酸銨沉淀把來自于培養(yǎng)液體的成分沉淀下來。離心之后，把沉淀物透析并用離子交換層析進一步純化。把這一組分稱為抗原6。可以用疏水相互作用層析進一步進行純化。單克隆抗體(MoAb)的制備IgG單克隆抗體是根據(jù)文獻(監(jiān)床實驗免疫學(xué)(1984)58∶511-521)進行制備的。唾液的制備唾液是用Omni-Saltm唾液收集裝置(唾液診斷系統(tǒng))收集的，保存在-20℃。試管中含有1ml的防腐劑溶液。襯墊被設(shè)計成在飽和時可以容納1ml的溶液，從而獲得1∶2的唾液稀釋液。在使用前，用蛋白酶抑制劑、tritonX和nonidetP40(0.01％)對唾液樣品進行預(yù)處理。血清的制備血液是通過靜脈穿刺獲得的，并用標準的方法加工成血清。EIA包被在包被之前，在冰面上對KP90進行超聲處理5×10秒，每次中斷10秒。在37℃用KP90的好幾種稀釋液(溶于PBS中，pH8.0)包被微滴定平板22小時，或用一種或多種對抗結(jié)核分支桿菌成分的單克隆抗體(IgG或IgM)(溶于PBS中，pH8.0的不同稀釋液)在4℃包被過夜。所試驗的單克隆抗體有一種對抗結(jié)核分支桿菌38kD蛋白的單克隆抗體，以及一種對抗LAM的單克隆抗體。通過先包被KP90再包被一種或多種單克隆抗體，或者是在微滴定平板以一定角度放置時在其一半先包被KP90，然后在平板翻轉(zhuǎn)180°之后再包被一種或多種單克隆抗體，可以結(jié)合包被單克隆抗體和KP90。包被之后，平板用3％的BSA在室溫下封閉1小時，在37℃干燥，儲存于4℃。試驗血清稀釋1∶200及1∶400進行試驗。唾液樣品稀釋為在1∶1至1∶100范圍內(nèi)的不同的稀釋液進行試驗。把100μl用移液管移到經(jīng)過包被過的微滴定平板的孔中，在37℃溫育1小時。用PBS把沒有結(jié)合的血清成分清洗掉。然后與偶聯(lián)物(抗人IgA或抗人IgM，用過氧化物酶標記)或者另外一種對抗同種結(jié)核分支桿菌成分的單克隆抗體(用過氧化物酶監(jiān)控標記)，或者兩者相結(jié)合，在37℃溫育1小時。隨后把過量的偶聯(lián)物洗掉。在孔中加入TMB(四甲基對二氨基聯(lián)苯)即可顯示人抗體亞型IgA或IgM(它們特異性地與KP90相結(jié)合)、以及/或者結(jié)核分支桿菌成分的存在。結(jié)合的酶產(chǎn)生一種藍色，在加入停止著色的溶液后這種顏色變?yōu)辄S色。該黃色在450nm處有最大的吸收。試驗結(jié)果的解釋是以所謂的截斷(cut-off)樣品為基礎(chǔ)的。當在試驗中所發(fā)現(xiàn)的結(jié)果的得分比截斷樣品的高時，可以認為試驗樣品是陽性的。截斷樣品是以大量的陽性和陰性主體的結(jié)果為基礎(chǔ)的。結(jié)果在完成了在上面的“試驗”及“包被”中所述的步驟以后，獲得如表1中所示的結(jié)果，這些結(jié)果是關(guān)于抗體在唾液中的存在的。在確定抗-KP90-IgA時，發(fā)現(xiàn)1∶100的唾液稀釋液是合適的。在確定抗-KP90-IgG時發(fā)現(xiàn)1∶20的唾液稀釋液是合適的。在表1中，樣品38、39、40、44、4、18、25、31、以及33是TB陽性的，其它的樣品是TB陰性的。結(jié)合檢測在唾液中存在的抗分支桿菌IgA以及IgG(其中使用了不同的截斷值)在診斷中具有附加的價值。同時也發(fā)現(xiàn)結(jié)合試驗唾液和血清在分支桿菌的診斷中具有附加的價值。表1檢測在唾液樣品中存在的抗分支桿菌IgA和IgG<tablesid="table1"num="001"><table>唾液IgA(唾液1∶100)OD450+/-bijODCO=0，7IgG(唾液1∶20)OD450+/-bijODCO=0，221235679101215162223283234350.6890.3450.3020.3210.4620.1410.5090.6090.4460.1730.3350.5610.3890.1770.3050.6830.55-----------------0.0740.0640.0500.0650.0630.0710.0750.0660.1620.0540.1080.1000.0960.0640.1780.1730.213-----------------</table></tables>為了確定LAM在唾液中的存在，首先如上所述制備唾液。另外，把1毫升的樣品透析以除去triton和鹽，然后把其凍干，再溶解于200μl的PBS中。在由此獲得的樣品中，用移液管把100μl轉(zhuǎn)移到一個微滴定平板的每一孔中(孔都如上所述經(jīng)過包被)。如上所述用兔子的抗分支桿菌抗體進行檢測，而兔子抗分支桿菌抗體是用抗-兔子-IgG-過氧化物酶偶聯(lián)物進行檢測的。結(jié)果如表2中所示。表2唾液中LAM的檢測唾液OD1OD2平均值1TB-陽性0.924U.970.9472TB-陽性0.7370.790.7643TB-陽性0.4720.4530.4634TB-陽性0.7220.7340.7285TB-陽性0.4390.4310.4356TB-陽性0.5990.6030.6017TB-陽性0.720.6930.7078TB-陽性0.690.5656.6289TB-陽性0.6430.6690.656平均值0.65910TB-陰性0.2890.2850.28711TB-陰性0.3530.3380.34612TB-陰性0.2940.2930.29413TB-陰性0.2960.2940.29514TB-陰性0.2980.2970.29815TB-陰性0.3150.3090.31216TB-陰性0.350.340.34517TB-陰性0.3530.3440.34915TB-陰性0.2530.2610.257平均值0.309進而，用類似于上述用于唾液的方法檢測痰樣品中的IgG、IgA、以及LAM。用KP90來確定痰中的抗結(jié)核分支桿菌抗體。為了檢測抗體在痰中的存在，把痰樣品1∶20或1∶25(用于IgG和IgA)或1∶100(用于IgA)稀釋于來源于KREATECHIgA試劑盒的血清稀釋緩沖液中。把樣品激烈振蕩至少1小時。然后如上所述通過ELISA試驗抗肺結(jié)核抗體的存在。把KP90包被在微滴定平板上。IgG和IgM的截斷率為0.8，IgA的截斷率為0.6，以血清8-59為參照來計算比率。結(jié)果如表3中所示。表3痰中抗體的檢測<tablesid="table3"num="003"><table>痰IgGIgAIgM1TB-陰性2TB-陰性3TB-陰性4TE-陰性5TB-陰性6TB-陰性7TB-陰性8TB-陰性9TB-陽性10TB-陽性11TB-陽性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陽性陽性陽性陽性陽性陰性陰性陽性陰性陰性陰性陽性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陽性陽性陰性</table></tables>12TB-陽性陰性陽性陽性Western印跡如WO-A-94/14069中第13頁第二點中所述的方法，進行凝膠電泳以及用于化驗的膜的準備。把條帶溫育于1∶100或1∶200稀釋的人血清或者用Omni-Sal收集的稀釋范圍為1∶1至1∶100的唾液中。使用WO-A-94/14069中所述的方法，進行免疫檢測以檢測血清和唾液中抗體的存在。點印跡化驗把1-10μg／ml的抗原(KP90)和0.5-5μg/ml的單克隆抗體分別點在硝酸纖維膜上。把膜(經(jīng)過或沒有經(jīng)過BSA封閉)與制備于PBS/tween/BSA中的血清樣品(1∶200稀釋液)或唾液稀釋液(1∶1至1∶100稀釋液)在室溫下溫育1小時。在用PBS/tween清洗膜之后，把膜與以下偶聯(lián)物一起溫育1.間接標記結(jié)合用過氧化物酶標記物的抗人-IgA或抗人-IgG和抗同種結(jié)核分支桿菌的單克隆抗體(IgG或IgA)，后者是用過氧化物酶監(jiān)控標記的。用1∶10稀釋于AEC緩沖液中的AEC(50mM乙酸鹽緩沖液，pH5.0，0.1％ureumperoxide)的AEC底物(0.8％3-氨基-9-乙基咔唑，用二甲基甲酰胺配制)、DAB(3，3-二氨基-對二氨基聯(lián)苯四鹽酸)，使用標準的方法，或Amersham的ECL檢測系統(tǒng)來進行檢測。2.直接標記結(jié)合用金標記物的抗人IgA或抗人IgG和抗同種結(jié)核分支桿菌的單克隆抗體(IgG或IgM)，后者是用金監(jiān)控標記的。IgA金偶聯(lián)物是購買的，或者是用如例如WO-A-96/35696中所述的方法制備的。單克隆抗體金偶聯(lián)物是如下進行制備的金顆粒是購買的。偶聯(lián)物是根據(jù)標準的步驟制備的，或者是，在基于鉑的連接物的情形中，根據(jù)如WO-A-96/35696中所述的方法進行制備。快速條帶試驗把1-10μg/ml的抗原(KP90)以及一種或多種0．5-5μg/ml的單克隆抗體(IgG)固定在硝酸纖維素膜的不同泳道上。在其它泳道之上同時也施用一個對照泳道(抗IgA或抗IgG/蛋白A，根據(jù)所要檢測的抗體類型而定)。使用經(jīng)過或未經(jīng)過0.1％BSA封閉的硝酸纖維素膜。在一個附加的吸收襯墊上把抗IgA金偶聯(lián)物以及單克隆抗體金偶聯(lián)物(對抗與經(jīng)過固定的單克隆抗體相同的抗原的單克隆抗體，但是識別另外一種抗原決定簇)干燥。IgA金偶聯(lián)物是購買的或者是根據(jù)WO-A-96/35696中所述的方法制備的。單克隆抗體金偶聯(lián)物如上所述進行制備。在一支玻璃管中把樣品(血清或唾液)稀釋在1mlPBS(pH7.4)中。然后把試驗條帶放入管中，使吸收襯墊朝下。在15分鐘至2小時以后，當條帶被著色時，結(jié)果即得以確定。第二步把1-10μ/ml的抗原(KP90)以及一種或多種0.5-5μg/ml的單克隆抗體(IgG)固定在硝酸纖維素膜的不同泳道上(見圖1)。在其它泳道之上同時也施用一個對照泳道(抗IgA或抗IgG/蛋白A，根據(jù)所要檢測的抗體類型而定)。附加一個吸收襯墊。通過一個基于鉑的連接物(見WO-A-96/35696)用金偶聯(lián)物把整個樣品進行標記。然后把條帶放入樣品中，使吸收襯墊朝下。在15分鐘至2小時以后，當條帶被著色時，結(jié)果即得以確定。凝集試驗包被通過過濾或離子交換樹脂(根據(jù)所需質(zhì)量而定)用硼酸鹽(pH8.5)或PBS把乳液顆粒清洗幾次。通過溫育1ml制備于硼酸鹽(pH8.5)中的適當顆粒的1％懸浮液或PBS(含有0.01％tween-20，最終蛋白濃度5mg／ml)把抗原(KP90或抗原6)或抗體包被上乳液顆粒，時間為37℃、20℃、40℃下1-16小時。然后把乳液離心，除去含有任何沒有被吸收的配體的上清。在幾次清洗(見上面)之后把經(jīng)過包被的乳液重懸于含有0.1％的BSA的MES緩沖液中，可以把這些乳液用于乳液凝集試驗或儲存于4℃。凝集反應(yīng)經(jīng)過包被的乳液顆粒以幾種的稀釋液與載玻片上的血清或唾液樣品液滴相混合。在室溫下1小時至+4℃16小時之后進行凝集化驗。凝集的情況可以通過目測(絮狀物的外觀)或者在把混合物過濾后進行評分。在后種情形中，選擇膜的孔徑以使未凝集的乳液顆粒通過并保留凝集的顆粒。通過使用著色顆粒，在陽性反應(yīng)中膜被著色。通過使用用于抗原(KKP90或抗原6)和抗體的不同的著色乳液顆粒，可以對這兩種反應(yīng)分別進行監(jiān)控。結(jié)果根據(jù)上述的步驟使用KP90和聚苯乙烯顆粒對血清進行試驗。試驗的溫育時間是在室溫下5分鐘以上。結(jié)果示于圖1中。圖1A顯示的是一個陽性反應(yīng)，而圖1B顯示的則是一個陰性反應(yīng)。權(quán)利要求1．一種用于鑒定分支桿菌種類的方法，包括以下步驟a)讓分支桿菌種類的至少一種具免疫交聯(lián)反應(yīng)活性的抗原成分與人或動物個體的體液樣品接觸；b)讓上述體液樣品與至少一種能夠與分支桿菌抗原反應(yīng)的抗體接觸；c)監(jiān)測抗原抗體復(fù)合物的存在，鑒定存在于體液樣品中的分支桿菌種類。2．一種如權(quán)利要求1中所述的方法，其中體液樣品是選自含有以下的一組血清、血液以及排泄液，如痰、唾液、腦脊液、或淚液、以及它們的溶液或制備物。3．一種如上述權(quán)利要求中任一所述的方法，其中至少一種的具免疫交聯(lián)反應(yīng)活性的抗原成分是結(jié)合于支持物上的。4．一種如上述權(quán)利要求中任一所述的方法，其中至少一種針對分支桿菌種類的抗體是結(jié)合于支持物上的。5．一種如上述權(quán)利要求中任一所述的方法，其中步驟a)和步驟b)同時進行。6．一種如權(quán)利要求5中所述的方法，其中至少一種的具免疫交聯(lián)反應(yīng)活性的抗原成分以及至少一種的針對分支桿菌種類的抗體是結(jié)合于同一固體支持物上的，而且其中上述抗體不與至少一種的具免疫交聯(lián)反應(yīng)活性的抗原成分發(fā)生反應(yīng)。7．一種如權(quán)利要求6中所述的方法，其中支持物是選自含有以下一組膜、浸條、濾膜、球、顆粒以及微滴定平板。8．一種如上述權(quán)利要求中任一所述的方法，其中至少一種的針對分支桿菌種類的抗體是單克隆抗體。9．一種如上述權(quán)利要求中任一所述的方法，其中對抗原抗體復(fù)合物存在的檢測是通過直接或間接的標記方法進行的。10．一種如權(quán)利要求9中所述的方法，其中檢測是通過使用選自以下組的標記物生物素、生物胞素、免疫生物素、異羥基洋地黃毒甙元、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白鏈菌素、膠質(zhì)染料物質(zhì)、熒光色素(如若丹明)、還原性物質(zhì)(如曙紅或視紫紅質(zhì))、(染色的)乳液溶膠、碳溶膠、金屬、金屬溶膠或其它的微粒子溶膠、丹酰細胞溶解酶、InfraRedDyes、香豆素、酶、以及碘標記物。11．一種如上述權(quán)利要求中任一所述的方法，其中分支桿菌種類是在一種或多種參照模式的基礎(chǔ)上進行鑒定的。12．一種如上述權(quán)利要求中任一所述的方法，其中至少一種的具免疫交聯(lián)反應(yīng)活性的抗原成分包括分支桿菌種類制劑的全部，或者上述種類培養(yǎng)基的全部。13．一種如上述權(quán)利要求1-11中所述的方法，其中至少一種的具免疫交聯(lián)反應(yīng)活性的抗原成分包括分支桿菌種類的全部制劑的KP90、KS90、抗原6、KP100或SP100部分，或者是上述種類的培養(yǎng)基的一個合適的部分。14．一種如上述權(quán)利要求中任一所述的方法，其中至少一種的針對分支桿菌種類的抗體包括IgG、IgA、IgM或者是它們的任意組合。15．一種診斷試劑盒，包括一個支持物，在該支持物上結(jié)合有至少一種的分支桿菌種類的具免疫交聯(lián)反應(yīng)活性的抗原成分以及至少一種的抗體，該抗體能夠與分支桿菌抗原反應(yīng)，而且不與上述的至少一種的具免疫交聯(lián)反應(yīng)活性的抗原成分發(fā)生反應(yīng)，以及用于檢測抗原抗體復(fù)合物存在的方法。16．一種如權(quán)利要求15中的檢測試劑盒，其中支持物是選自含有以下的組膜、浸條、濾膜、球、顆粒以及微滴定平板。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于鑒定分支桿菌種類的方法,包括以下步驟:a).讓至少一種分支桿菌種類的具免疫交聯(lián)反應(yīng)活性的抗原成分與一種人或動物個體的體液樣品接觸;b).讓至少一種能夠與分支桿菌抗原反應(yīng)的抗體與上述體液樣品接觸;c).檢測抗原抗體復(fù)合物的存在,鑒定分支桿菌種類在上述體液樣品中的存在。文檔編號G01N33/569GK1284169SQ98813534公開日2001年2月14日申請日期1998年12月8日優(yōu)先權(quán)日1997年12月8日發(fā)明者H·－J·豪圖夫,S·克龍斯沃特,R·范德爾默倫,S·格達雅爾,A·科爾克,L·佩雷拉阿里亞斯布達,S·克伊珀申請人:克雷特克生物技術(shù)有限公司