專利名稱：通過切割和質(zhì)譜確定多肽特征的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用質(zhì)譜鑒定多肽的末端片段，從而確定多肽特征的方法。該方法涉及切割多肽，并分離群體中來自各蛋白質(zhì)的單個末端肽。本發(fā)明還涉及在測定組織、細(xì)胞類型或亞細(xì)胞區(qū)室中蛋白質(zhì)表達(dá)或分析大蛋白質(zhì)復(fù)合物的方法中使用上述方法。
描述蛋白質(zhì)全貌的技術(shù)，即對組織中蛋白質(zhì)的身份和數(shù)量按目錄分類的技術(shù)，在自動化或高產(chǎn)率方面還發(fā)展的不完善。描述一蛋白質(zhì)群體全貌的經(jīng)典方法是采用雙向電泳法(R.A.Wan Bogelen.，E.R.Olson，“雙向蛋白質(zhì)凝膠在生物技術(shù)中的應(yīng)用”，生物技術(shù)年度綜述，169-103，1995)。在該方法中，將生物樣品中抽提出的蛋白質(zhì)樣品在窄凝膠條上分離。這種第一次分離常利用蛋白質(zhì)的等電點來分離蛋白質(zhì)。然后將整個凝膠條靠在矩形凝膠的一條邊上。將條中已分開的蛋白質(zhì)根據(jù)其大小電泳分離到第二條凝膠中。該技術(shù)緩慢，而且難于自動化。在其最簡單的具體實踐中，它還是相對不夠靈敏的。
已做了許多改進(jìn)，來提高2-D凝膠電泳的蛋白質(zhì)分辨率，并改進(jìn)該系統(tǒng)的靈敏度。一種改進(jìn)2-D凝膠電泳靈敏度及其分辨率的方法是用質(zhì)譜分析凝膠上特定斑點中的蛋白質(zhì)(Jungblut P，Thiede B.“用MALDI質(zhì)譜從2-DE凝膠鑒定蛋白質(zhì)”，Mass Spectrom.Rev.16145-162，1997)。該方法之一是在膠內(nèi)用胰蛋白酶消化，然后用質(zhì)譜分析胰蛋白酶消化片段，來產(chǎn)生肽質(zhì)譜指紋。如果需要序列信息，可進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析。
最近還嘗試了用質(zhì)譜來分析已經(jīng)過液相層析或毛細(xì)管電泳組分的全體蛋白質(zhì)(Dolnik V.“蛋白質(zhì)的毛細(xì)管區(qū)帶電泳”，電泳18，pp2353-2361，1997)。已測試了使用毛細(xì)管電泳質(zhì)譜的聯(lián)機(jī)系統(tǒng)。然而，用質(zhì)譜分析全體蛋白質(zhì)遇到了許多困難。第一個是對各蛋白質(zhì)可達(dá)到的多種電離狀態(tài)所產(chǎn)生的復(fù)雜質(zhì)譜的分析有困難。第二個主要缺點是質(zhì)譜儀目前對于高分子量物質(zhì)，即對質(zhì)譜中大于4千道爾頓的離子的質(zhì)譜分辨率太低。因此，在質(zhì)譜中分辨質(zhì)量接近的蛋白質(zhì)有困難。第三個缺點是用串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)一步分析全體蛋白質(zhì)很困難，因為全體蛋白質(zhì)的分級圖式極端復(fù)雜并難于解釋。
WO 98/32876公開了描述蛋白質(zhì)群體全貌的方法，該方法通過從該群體中各蛋白質(zhì)分離一條肽來描述。該申請中公開的方法包括以下步驟1.通過群體中各蛋白質(zhì)的一個末端將該群體蛋白質(zhì)捕獲在一固相載體上。
2.用序列特異性切割劑切割捕獲的蛋白質(zhì)。
3.洗去切割劑產(chǎn)生的不保留在固相載體上的肽。
4.釋放保留在固相載體上的末端肽。
5.分析釋放的末端肽，優(yōu)選鑒定并定量測定混合物中的每種肽。分析優(yōu)選用質(zhì)譜進(jìn)行。
在該申請中，指出C-末端是更優(yōu)選的用來捕獲蛋白質(zhì)群體的末端，因為N-末端常常是封閉的。為了用C-末端捕獲蛋白質(zhì)群體，必須將C-末端羧基與蛋白質(zhì)上的其它反應(yīng)基團(tuán)區(qū)分開來，而且C-末端羧基必須與導(dǎo)致固定化的試劑特異性反應(yīng)。在許多C-末端測序化學(xué)反應(yīng)中，需活化C-末端羧基，以促進(jìn)在C-末端形成噁唑酮基。在C-末端羧基的活化過程中，側(cè)鏈羧基也被活化，但它們不能形成噁唑酮基。已報道C-末端噁唑酮基在堿性條件下比活化的側(cè)鏈羧基對親核試劑的反應(yīng)性較差，從而提出了選擇性封閉側(cè)鏈羧基的方法(V.L.Boyd等，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析方法109-118，Plenum Press，M.Z.Atassi和E.Appella編，1995)。其它更具反應(yīng)性的側(cè)鏈可在活化羧基前使用各種常規(guī)試劑封閉。用該方法可封閉所有的反應(yīng)性側(cè)鏈，并可專一性標(biāo)記C-末端。
EP-A-0 594 164描述了從蛋白質(zhì)中分離C-末端肽的方法，采用N-末端測序試劑對C-末端肽進(jìn)行測序。在該方法中，采用能切割賴氨酸殘基C-末端的內(nèi)切蛋白酶消化感興趣的蛋白質(zhì)。使得到的肽和能與所有游離氨基反應(yīng)的DITC聚苯乙烯反應(yīng)?？捎萌宜?TFA)切下已和DITC聚苯乙烯反應(yīng)的N-末端氨基，從而釋放出所有肽的N-末端。然而賴氨酸的ε氨基不能被切下，因此所有非末端肽保留在載體上，僅釋放C-末端肽。根據(jù)該專利，回收C-末端肽用于微測序。
然而，上述方法都不能輕易鑒定群體中存在的所有蛋白質(zhì)，而且事實上這些方法中許多完全不能唯一的鑒定所有存在的蛋白質(zhì)。
因此，本發(fā)明的一個目的是克服現(xiàn)有技術(shù)有關(guān)的問題，并提供一種用于確定多肽特征的方法，該方法能唯一的鑒定樣品中存在的，比用現(xiàn)有技術(shù)方法可能鑒定出更大比例的蛋白質(zhì)。因此本發(fā)明的一個目的是提供從混合物、復(fù)合物或群體(用任意的形式制備的)分離單個末端肽的改進(jìn)方法。本發(fā)明的另一個目的是提供適合自動化的方法。本發(fā)明的還有一個目的是提供改進(jìn)質(zhì)譜分析本發(fā)明方法產(chǎn)生的末端肽的靈敏度的方法。
因此，本發(fā)明提供了一種確定一種多肽或一群多肽的特征的方法，該方法包括(a)使含有一種或多種多肽的樣品和第一切割劑接觸，產(chǎn)生多肽片段；(b)分離一種或多種多肽片段，各片段含有片段化產(chǎn)生它的多肽的N-末端或C-末端；(c)用質(zhì)譜鑒定分離的片段；(d)用切割位點和第一種切割劑不同的第二種切割劑對樣品重復(fù)步驟(a)-(c)；和(e)確定步驟(c)和(d)鑒定的片段樣品中一種或多種多肽的特征。
在本

發(fā)明內(nèi)容
中，多肽包括任何含有兩個或多個氨基酸的肽，并包括任何蛋白質(zhì)。在本文中，在重復(fù)步驟(d)中使用的樣品與步驟(a)中使用的相同。“相同樣品”可指(例如)從一種起源樣品分離出的多個部分之一，這一部分用于步驟(a)-(c)的每一次重復(fù)。
可重復(fù)步驟(a)-(c)任意次數(shù)，例如一次、兩次或更多次。每次重復(fù)使用的切割劑切割位點與前一次使用的切割劑不同。因此每次重復(fù)都產(chǎn)生了一組不同的末端片段，即使處理的是相同樣品。如果通過在某特定位點切割產(chǎn)生的末端片段不能區(qū)分兩種或多種蛋白質(zhì)(例如，如果兩種或多種蛋白質(zhì)產(chǎn)生的末端片段具有相同的或不可區(qū)別的質(zhì)量)，那么可在不同位點切斷而產(chǎn)生不同質(zhì)量的末端片段。因此，用多種不同切割劑重復(fù)進(jìn)行可提高該方法的分辨率。
本發(fā)明中使用的切割劑無特別限定。優(yōu)選的切割劑包括內(nèi)切肽酶或化學(xué)切割劑。更優(yōu)選的，使用的切割劑含有Lys-C內(nèi)切肽酶，一種硫氰酸酯化合物、溴化氰、BNPS-糞臭素、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和/或凝血酶。
本發(fā)明還提供了確定一種多肽或一群多肽的特征的方法，該方法包括(f)使含有一種或多種多肽的樣品與第一封閉劑在第一封閉步驟中接觸，以在該多肽的一條或多條反應(yīng)性側(cè)鏈上引入封閉基團(tuán)；(g)使該樣品和切割劑接觸，產(chǎn)生多肽片段；
(h)分離一種或多種多肽片段，每條片段含有片段化產(chǎn)生它的多肽的N-末端或C-末端；(j)用質(zhì)譜鑒定分離的片段；(k)在樣品上用第二封閉劑重復(fù)步驟(f)-(j)，該封閉劑在第一封閉步驟的同一側(cè)鏈上引入封閉基團(tuán)，但所用的基團(tuán)和第一封閉步驟使用的基團(tuán)質(zhì)量不同；和(l)確定步驟(j)和(k)鑒定的片段樣品中一種或多種多肽的特征。
每次重復(fù)該方法可使用相同的切割劑或不同切割劑，只要每次重復(fù)使用的封閉基團(tuán)具有不同質(zhì)量?？芍貜?fù)步驟(f)-(j)任意次數(shù)，如一次、兩次或多次。每次重復(fù)使用的封閉基團(tuán)和前一次使用的相應(yīng)封閉基團(tuán)具有不同的質(zhì)量。因此每次重復(fù)都產(chǎn)生了一群不同的末端片段，即使用相同的切割劑處理相同的樣品。如果兩種或多種蛋白質(zhì)不能根據(jù)它們被特定封閉基團(tuán)封閉的末端片段區(qū)分開來(即如果兩種或多種蛋白質(zhì)的末端片段具有相同或不可區(qū)別的質(zhì)量)，那么使用一種或多種與前一次封閉步驟中(對于同樣的兩種或多種蛋白質(zhì))使用的相應(yīng)基團(tuán)質(zhì)量不同的封閉基團(tuán)，可產(chǎn)生不同質(zhì)量的末端片段。因此通過使用多種封閉基團(tuán)(每種具有不同質(zhì)量)重復(fù)進(jìn)行，可提高該方法的分辨率。
在上述方法中，當(dāng)群體中蛋白質(zhì)的側(cè)鏈要封閉時，待封閉的側(cè)鏈可含有下列一個或多個精氨酸的NH2側(cè)鏈；天冬酰胺的NH2側(cè)鏈；谷氨酰胺的NH2側(cè)鏈；賴氨酸的NH2側(cè)鏈；天冬氨酸的COOH側(cè)鏈；谷氨酸的COOH側(cè)鏈；絲氨酸的OH側(cè)鏈；蘇氨酸的OH側(cè)鏈；甲狀腺氨酸的OH側(cè)鏈；酪氨酸的OH側(cè)鏈；和半胱氨酸的SH側(cè)鏈。
本發(fā)明所用的封閉劑無特別限制。優(yōu)選封閉劑包括碘乙酸酯化合物，異氰酸酯化合物(如異氰酸苯酯)，甲硅烷基化合物(如三甲基氯甲硅烷)，酸酐化合物(如乙酸酐和甲基乙烯砜)和乙烯基吡啶衍生物(如4-乙烯基吡啶)?？赏ㄟ^取代改變封閉基團(tuán)的質(zhì)量。這些取代無特別限制，只要封閉反應(yīng)仍能進(jìn)行。用氚或碘等鹵素取代是優(yōu)選的。
因此在一個優(yōu)選方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生蛋白質(zhì)表達(dá)全貌的方法，該方法通過將同一蛋白質(zhì)混合物產(chǎn)生的，但經(jīng)過兩種或多種序列特異性不同的切割劑處理的兩種或多種蛋白質(zhì)表達(dá)全貌組合起來，從而提高了分辨率。在產(chǎn)生每種蛋白質(zhì)表達(dá)全貌中使用了不同的序列特異性切割劑。在該內(nèi)容中，分辨率指一蛋白質(zhì)群體中根據(jù)末端肽的質(zhì)量可從一數(shù)據(jù)庫唯一的鑒定出來的蛋白質(zhì)比率。
在另一個優(yōu)選方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生蛋白質(zhì)表達(dá)全貌的方法，該方法通過將從同一蛋白質(zhì)混合物產(chǎn)生，并用序列特異性相同的切割，但其特異性側(cè)鏈(如氨基酸側(cè)鏈)已用質(zhì)量不同的兩種或多種封閉試劑封閉的兩種或多種蛋白質(zhì)表達(dá)全貌組合起來，從而提高了分辨率。在產(chǎn)生每種蛋白質(zhì)表達(dá)全貌中，使用了不同組的封閉劑。
現(xiàn)在將詳細(xì)討論本發(fā)明的更優(yōu)選方面。在第一個優(yōu)選方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生一群末端肽的方法，包括步驟如下1.將一群蛋白質(zhì)固定在固相載體上。
2.使該固定的蛋白質(zhì)群體和與蛋白質(zhì)N-末端α-氨基和賴氨酸ε氨基反應(yīng)的反應(yīng)劑接觸。該試劑還可任選的和絲氨酸和蘇氨酸側(cè)鏈反應(yīng)，以將其封閉。關(guān)于這點，封閉指，使側(cè)鏈與一試劑反應(yīng)，該試劑使該側(cè)鏈不與該方法后隨步驟中使用的任何試劑反應(yīng)。如果該試劑不封閉氨基以外的側(cè)鏈，可應(yīng)用其它封閉劑，來封閉其它反應(yīng)性側(cè)鏈，從而可依次封閉所有的反應(yīng)性側(cè)鏈。
3.使該蛋白質(zhì)群體和一試劑接觸，該試劑將會活化蛋白質(zhì)的游離羧基。該活化劑優(yōu)選促進(jìn)在該群體蛋白質(zhì)的C-末端活化的羧基處形成噁唑酮基團(tuán)。
4.使產(chǎn)生的衍生蛋白質(zhì)和親核試劑在堿性條件下接觸，來封閉側(cè)鏈羧基活化的衍生物。C-末端噁唑酮比活化的側(cè)鏈羧基對親核試劑的反應(yīng)性弱。用這種方法可封閉所有反應(yīng)性側(cè)鏈官能基團(tuán)。加入的親核試劑優(yōu)選硫氰酸鹽。
5.使反應(yīng)混合物和合適的酸，優(yōu)選TFA接觸，其促進(jìn)C-末端噁唑酮基團(tuán)和硫氰酸反應(yīng)，產(chǎn)生C-末端乙內(nèi)酰硫脲衍生物。
6.使這些蛋白質(zhì)和一切割劑接觸，從衍生的蛋白質(zhì)上切下C-末端乙內(nèi)酰硫脲，從而暴露每個蛋白質(zhì)中次末端氨基酸的羧基。
7.使暴露的次末端羧基和合適試劑接觸，通過C-末端固相捕獲蛋白質(zhì)。
8.使C-末端修飾的蛋白質(zhì)和序列特異性切割劑接觸。
9.在固相載體上捕獲C-末端肽，并洗去非末端肽。
10.任選使捕獲的肽的末端氨基和質(zhì)譜敏化試劑反應(yīng)。
11.從固相載體上釋放捕獲的C-末端肽。
12.回收釋放的肽。
13.用質(zhì)譜分析C-末端肽。
可如上述在本發(fā)明的一般方法中使用上述優(yōu)選步驟的任一步驟、或上述優(yōu)選步驟的組合。
在第二個優(yōu)選方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生一群末端肽的方法，包括步驟如下1.將一群蛋白質(zhì)固定在固相載體上。
2.使該固定的蛋白質(zhì)群和能與蛋白質(zhì)N-末端的α-氨基和賴氨酸ε-氨基反應(yīng)的試劑接觸，該試劑還可任選的和絲氨酸和蘇氨酸側(cè)鏈反應(yīng)，以將其封閉。關(guān)于這點，封閉指，使側(cè)鏈與一試劑反應(yīng)，該試劑使該側(cè)鏈不和該方法后隨步驟中使用的任何試劑反應(yīng)。如果該試劑不封閉氨基以外的側(cè)鏈，可應(yīng)用其它封閉劑，來封閉其它反應(yīng)性側(cè)鏈，從而可依次封閉所有的反應(yīng)性側(cè)鏈。
3.使該蛋白質(zhì)群體和試劑接觸，該試劑將會活化蛋白質(zhì)的游離羧基。該活化劑應(yīng)優(yōu)先促進(jìn)在該群體蛋白質(zhì)的C-末端活化的羧基處形成噁唑酮基團(tuán)。
4.使產(chǎn)生的衍生蛋白質(zhì)和親核試劑在堿性條件下接觸，來封閉側(cè)鏈羧基衍生物。C-末端噁唑酮比活化的側(cè)鏈羧基對親核試劑的反應(yīng)性弱。用這種方法可封閉所有反應(yīng)性側(cè)鏈官能基團(tuán)。加入的親核試劑優(yōu)選帶有惰性陰離子的鹽。
5.水解C-末端噁唑酮，產(chǎn)生C-末端羧基。
6.使這些蛋白質(zhì)和一活化劑接觸，活化C-末端羧基。
7.使活化的末端羧基和一合適的試劑接觸，通過C-末端固相捕獲蛋白質(zhì)。
8.使C-末端修飾的蛋白質(zhì)和序列特異性切割劑接觸。
9.在固相載體上捕獲C-末端肽，并洗去非末端肽。
10.任選使捕獲的肽的末端氨基與質(zhì)譜敏化試劑反應(yīng)。
11.從固相載體上釋放捕獲的C-末端肽。
12.回收釋放的肽。
13.用質(zhì)譜分析C-末端肽。
可如上述在本發(fā)明的一般方法中使用上述優(yōu)選步驟的任一步驟、或上述優(yōu)選步驟的組合。
在第三個優(yōu)選方面，本發(fā)明提供了一種從一蛋白質(zhì)群體產(chǎn)生一群末端肽的方法，包括步驟如下1.用Lys-C特異性切割酶，即切斷一殘基C-末端緊靠賴氨酸側(cè)的肽鍵的試劑，完全消化一蛋白質(zhì)群體。
2.使產(chǎn)生的肽與能和游離氨基反應(yīng)的活化固相載體接觸。
3.使載體上捕獲的肽與能在每條肽的α-氨基處切斷的試劑接觸。所有不是C-末端的肽將具有一個將它們與固相載體共價連接的賴氨酸殘基。從而可選擇性的釋放游離的C-末端肽。
4.回收釋放的肽。
5.任選使釋放的肽和試劑接觸，來封閉反應(yīng)性側(cè)鏈。
6.任選使捕獲的肽的末端氨基和質(zhì)譜敏化試劑反應(yīng)。
7.用質(zhì)譜分析這些肽。
可如上述在本發(fā)明的一般方法中使用上述優(yōu)選步驟的任一步驟、或上述優(yōu)選步驟的組合。
為了僅使含有賴氨酸殘基的片段通過兩個氨基保持與固相載體結(jié)合，(從而除了含有賴氨酸基團(tuán)以外所有片段都在釋放步驟中從固相載體上釋放)，優(yōu)選在賴氨酸的側(cè)鏈NH2不質(zhì)子化的pH下使這些片段和固相載體結(jié)合。因此，該步驟優(yōu)選在pH11-11.5下進(jìn)行。
一群C-末端肽的產(chǎn)生C-末端測序試劑的應(yīng)用下文討論了本發(fā)明上述方面的不同優(yōu)選例。
在本發(fā)明第一和第二優(yōu)選方面的第一步中，將一群蛋白質(zhì)優(yōu)選非共價固定在固相載體上?？捎肸itex(多孔Teflon，獲自Norton Performance Plastics，Wayne，NJ)膜實施蛋白質(zhì)在固相載體上的非共價固定(Bailey等，“用二苯基磷酸異硫氰酸酯對肽和蛋白質(zhì)進(jìn)行自動化羧基-末端序列分析”，蛋白質(zhì)科學(xué)11622-1633，1992；Bailey等，生物化學(xué)年鑒，212366-374，1933)。還可用聚二氟乙烯膜(Millipore)固定蛋白質(zhì)。
本發(fā)明第一和第二個優(yōu)選方面的步驟2涉及封閉一群蛋白質(zhì)的反應(yīng)性側(cè)鏈。本領(lǐng)域熟知可選擇性封閉反應(yīng)性側(cè)鏈官能基團(tuán)。反應(yīng)性側(cè)鏈包括賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和半胱氨酸。半胱氨酸常常自身交聯(lián)，形成二硫鍵。為了本發(fā)明的目的，優(yōu)選打斷這些鍵。這可用巰基乙醇將二硫鍵還原成一對巰基來實現(xiàn)。可用碘乙酸(Aldrich)在弱堿條件下選擇性封閉巰基，促使形成氫硫酸根離子(分子微生物學(xué)52293，1991)。合適的弱堿可能是碳酸鹽。在其它實施例中，可用異硫氰酸化合物處理蛋白質(zhì)群體。異硫氰酸幾乎只與蛋白質(zhì)N-末端的α-氨基反應(yīng)，并和賴氨酸的ε-氨基反應(yīng)，即在溫和條件下，即室溫和中性溶劑中與伯胺反應(yīng)，產(chǎn)生脲衍生物。還可制備能與帶羥基的側(cè)鏈，如絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸側(cè)鏈，在合適的催化劑如吡啶或錫化合物，如月桂酸二丁基甲錫烷酯存在下起反應(yīng)的試劑，以產(chǎn)生氨基甲酸乙酯。在另一個實施例中，可用甲硅烷化合物如三甲基氯硅烷(Sigma)處理蛋白質(zhì)群體。這些化合物易于與大部分反應(yīng)官能基團(tuán)反應(yīng)。胺衍生物在水溶液條件下不穩(wěn)定，因此如果需要可水解回復(fù)成游離胺。上述例子是為了說明封閉反應(yīng)性側(cè)鏈官能團(tuán)的方法，而不是為了要限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域已知各式各樣的保護(hù)基團(tuán)，而且設(shè)想這些基團(tuán)的大部分都能用于完成本發(fā)明的步驟。
在本發(fā)明第一和第二個優(yōu)選方面的步驟3中，接著是活化羧基側(cè)鏈。為了該目的，廣泛使用了乙酸酐，它在羧基處產(chǎn)生混合酸酐。在一些實施例中，本發(fā)明第一和第二優(yōu)選方面的步驟2可與步驟3聯(lián)合。用酸酐化合物活化側(cè)鏈羧基還導(dǎo)致封閉反應(yīng)性側(cè)鏈，如賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸。在聯(lián)合步驟2和3的實施例中，所選活化劑作為反應(yīng)性側(cè)鏈的封閉劑優(yōu)選是穩(wěn)定的，因為某些酸酐衍生物在堿性或酸性條件下不穩(wěn)定。例如三甲基乙酸酐在這些條件下，由于立體效應(yīng)更為穩(wěn)定。另選的一種更優(yōu)選的活化劑是Woodwards ReagentK(N-乙基-5-苯基異噁唑-3-磺酸酯，購自Sigma)。在本發(fā)明該方面的另一個優(yōu)選例中，通過用焦磷酸四苯酯(Aldrich)或氯化磷酸二苯酯等反應(yīng)性磷酸酯處理，實現(xiàn)活化。根據(jù)美國專利號5,665,603，在肽測序方法中在肽或多肽C-末端產(chǎn)生羧基衍生物(它能反應(yīng)形成乙內(nèi)酰硫脲)所需的活化步驟，可在較溫和條件下用?；姿狨セ衔?，如氯化磷酸二苯酯或焦磷酸四苯酯(Aldrich)更有效的進(jìn)行。C-末端羧基在堿存在下和反應(yīng)性磷酸反應(yīng)，使羧基去質(zhì)子化。優(yōu)選的堿是三乙胺，二異丙基乙胺或吡啶，即不和產(chǎn)生的?；姿狨シ磻?yīng)的堿?；罨疌-末端羧基的磷酸化反應(yīng)優(yōu)選使用等摩爾量的反應(yīng)性磷酸和堿。大量過量的將這兩種試劑加到以無質(zhì)子極性溶劑(如乙腈(ACN)，二甲基甲酰胺或乙醚，優(yōu)選ACN)配制的多肽中去。反應(yīng)通常在室溫下5-10分鐘內(nèi)，一般短于30分鐘內(nèi)完成。溫度可變反應(yīng)可在55℃在自動測序儀(串聯(lián)其它發(fā)生的反應(yīng))中進(jìn)行。C-末端羧基的活化衍生物可自發(fā)性環(huán)化，形成噁唑酮中間物，同時側(cè)鏈羧基仍被活化。
側(cè)鏈羧基活化的衍生物和親核試劑在堿性條件下反應(yīng)，而C-末端噁唑酮基和親核試劑的反應(yīng)性弱得多(V.L.Boyd等，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的方法109-118，Plenum Press，M.Z.Atassi和E.Appella編，1995)。因此，在本發(fā)明第一和第二優(yōu)選方面的步驟4中使蛋白質(zhì)群體在堿性條件下和親核試劑接觸。優(yōu)選親核試劑是伯胺化合物。如果使用胺親核試劑，可氨基化側(cè)鏈。優(yōu)選的胺親核試劑是哌啶、甲胺、乙胺或其它胺，加上合適的堿。為了進(jìn)行氨基化反應(yīng)，在無質(zhì)子極性溶劑，優(yōu)選乙腈中加入等摩爾量的堿和親核試劑，這些試劑的量比大大超過蛋白質(zhì)混合物。氨使活化的天冬氨酸殘基產(chǎn)生天冬酰胺，使谷氨酸殘基產(chǎn)生谷氨酰胺。這可減少肽質(zhì)量的信息，因此氨可能不是優(yōu)選的親核試劑。在另一個實施例中，可用醇在酸性條件下酯化活化的側(cè)鏈羧基衍生物?？稍诤线m的無水酸性溶劑，如TFA中加入合適的醇，如甲醇。
在本發(fā)明的第一個優(yōu)選方面中，可加入作為硫氰酸鹽的親核試劑。噁唑酮在酸性條件下和異硫氰酸鹽反應(yīng)，從而在堿性條件的起始階段后，促進(jìn)氨基化，反應(yīng)物被三氟乙酸酸化，促進(jìn)C-末端乙內(nèi)酰硫脲的形成。
在本發(fā)明的第二個優(yōu)選方面，可加入作為具有惰性基團(tuán)的鹽的胺親核試劑，如羧酸鹽。優(yōu)選使用揮發(fā)性鹽，以利于除去未用的試劑。用該方法可防止發(fā)生噁唑酮水解，在C-末端產(chǎn)生游離羧基。在另一個實施例中，可加入作為鹽的胺親核試劑和具有合適官能基團(tuán)的生物素化試劑，來和噁唑酮反應(yīng)。
在本發(fā)明的第一個方面加入了硫氰酸鹽親核試劑，接著用合適的酸，優(yōu)選TFA酸化反應(yīng)混合物，酸化促進(jìn)C-末端噁唑酮基和硫氰酸鹽反應(yīng)，產(chǎn)生C-末端乙內(nèi)酰硫脲衍生物。然后從衍生蛋白質(zhì)上切下C-末端乙內(nèi)酰硫脲，暴露出每個蛋白質(zhì)中次末端氨基酸的羧基。可用各種方法，包括用酸或堿水解，從C-末端切下乙內(nèi)酰硫脲。通過三甲基硅烷鈉的醇溶液等試劑實現(xiàn)更優(yōu)選的切割(J.M.Bailey等，蛋白質(zhì)科學(xué)168-80，1992)在本發(fā)明的第一和第二優(yōu)選方面的步驟7中，然后使暴露的末端羧基和合適試劑反應(yīng)，通過C-末端固相捕獲蛋白質(zhì)。生物素氨基己酰肼等試劑能和游離羧酸反應(yīng)。5-(生物素氨基)戊胺等試劑可用來實現(xiàn)親和素的捕獲。在和該生物素化試劑反應(yīng)前，必須活化游離羧酸末端?？捎酶鞣N活化劑，但應(yīng)優(yōu)選不促進(jìn)形成噁唑酮的。立體上形成位阻的酸酐化合物可能是合適的。在另一個實施例中，活化的末端羧基可與具有能與活化羧基反應(yīng)的合適基團(tuán)的官能化固相載體反應(yīng)。游離氨基可能是合適的。為了選擇性釋放羧基，反應(yīng)官能團(tuán)應(yīng)通過可切割接頭和載體連接。本領(lǐng)域已知各種可切割的接頭。光可切割的接頭是本領(lǐng)域熟知的(Lloyd-Williams等，四面體4911065-11133，1993)。還有許多化學(xué)可切割的接頭，如硫酯可被羥胺切割。
在本發(fā)明第一和第二優(yōu)選方面的步驟8中，然后用序列特異性切割劑處理C-末端修飾的蛋白質(zhì)。優(yōu)選切割劑是揮發(fā)性的化學(xué)試劑，使得易于除去未反應(yīng)的試劑。合適的化學(xué)切割劑包括能切割甲硫氨酸殘基的溴化氰和切割色氨酸殘基的BNPS-糞臭素(D.L.Crimmins等，生物化學(xué)年鑒18727-38，1990)。在其它實施例中，可使用序列特異性內(nèi)切蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶。凝血酶或其它酶。
在本發(fā)明第一和第二優(yōu)選方面的步驟9中，將末端修飾的肽捕獲在固相載體上。在末端羧基被生物素化的實施例中，接下來C-末端肽可被捕獲在用鏈霉親和素衍生的固相載體上。然后可洗去非末端肽。
在本發(fā)明的第一和第二優(yōu)選方面的步驟10中，可任選的使捕獲的C-末端肽和質(zhì)譜敏化劑反應(yīng)。質(zhì)譜儀的離子探頭極端靈敏，可檢測到一個離子的到達(dá)。因此檢測離子不是確定質(zhì)譜儀靈敏度的限制因素。一般最大的限制因素是分析物的離子化。在一典型電子噴射源或FAB源中，一千個分析物分子中只有一個將確實離子化并被檢測。為了改進(jìn)該過程，需要在肽中引入能使肽預(yù)先離子化的敏化化合物以利于檢測。優(yōu)選的化合物包括季銨鹽離子或金屬離子鰲合劑。示范性化合物可能是4-(3-吡啶基甲基氨基羧丙基)苯基異硫氰酸酯(E.J.Bures等，“用于分步降解多肽的一群新試劑的合成和評估”，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析方法，Plenum Press，New York，1995公開了用該化合物的異硫氰酸形式作為質(zhì)譜敏化劑)。引入敏化基團(tuán)不僅改進(jìn)了靈敏度，而且減少了分析物分子競爭離子化的危險。這表示所有肽可更平均的存在在質(zhì)譜中。
在本發(fā)明的第一和第二優(yōu)選方面的步驟11中，接下來從固相載體上釋放捕獲的C-末端肽。在末端羧基生物素化的實施例中，可用酸處理，釋放親和素捕獲的肽。優(yōu)選采用TFA來促進(jìn)回收釋放的肽，因為它是揮發(fā)性的，易于蒸發(fā)而回收肽。
在本發(fā)明的第一和第二優(yōu)選方面的步驟12中，回收釋放的肽。在本發(fā)明第三和第四方面的步驟13中，用質(zhì)譜分析肽。在一個實施例中，將肽包埋在合適載體上的MALDI基質(zhì)中，如肉桂酸(cinammic acid)中，用MALDI質(zhì)譜儀分析，來確定C-末端肽群體的肽質(zhì)譜指紋。MALDI是優(yōu)選分析技術(shù)，因為該離子化技術(shù)有利于形成[M+H]+離子。因此對于每條肽，在質(zhì)譜中只有一個主峰。
在另一個實施例中，可將回收的肽溶于合適的溶劑中，并可用噴射輸入系統(tǒng)，如電子噴射離子化質(zhì)譜儀分析?？刹捎妙愃频腇ast Atom Bombardment(FAB)和相關(guān)的界面。這可能包括在質(zhì)譜分析前用相聯(lián)的液相層析分離肽?？捎妹?xì)管電泳或HPLC或毛細(xì)管等電聚焦。動態(tài)FAB是特別優(yōu)選的方法，因為該離子化方法促進(jìn)離子產(chǎn)生的形式是它們存在于用來將它們引入質(zhì)譜儀的基質(zhì)中的形式。如果使用液體基質(zhì)，這意味著存在于質(zhì)譜中的離子必定和它們在溶液中的相同。由于在本發(fā)明中可封閉反應(yīng)性側(cè)鏈，而且可將質(zhì)譜敏化劑引入要分析的肽中，因此確保所有肽在溶液中僅帶一個電荷，在肽群體最終的質(zhì)譜中由一個質(zhì)量峰代表是可能的?？蓪⒋?lián)質(zhì)譜和噴射界面或FAB界面相連接。串聯(lián)質(zhì)譜可確定一條肽的序列信息，并鑒定該蛋白質(zhì)的共價修飾。
DITC玻璃的使用本節(jié)討論了本發(fā)明第三個優(yōu)選方面的各種實施例。
在本發(fā)明的第三個優(yōu)選方面的步驟1中，用Lys-C特異性切割酶，如內(nèi)切蛋白酶Lys-C(來自溶菌性酶基因，Boehringer Mannheim)完全消化一個蛋白質(zhì)群體。
在本發(fā)明的第三個優(yōu)選方面的步驟2中，使產(chǎn)生的肽和能與胺反應(yīng)的固相載體接觸。在一實施例中，肽群體和異硫氰酸玻璃(DITC玻璃，Sigma)在堿存在下反應(yīng)。這通過游離氨基將所有肽捕獲到固相載體上。
在本發(fā)明的第三個優(yōu)選方面的步驟3中，使捕獲的肽和一種試劑接觸，該試劑在載體上每條肽的α-氨基處切割。在使用DITC玻璃的實施例中，用合適的揮發(fā)性酸(TFA)處理肽，該酸從載體上的每條肽切下N-末端氨基酸。所有不是C-末端的肽將具有將它們和固相載體共價連接的賴氨酸殘基。這些游離C-末端肽被選擇性釋放。
在本發(fā)明的第三個優(yōu)選方面的步驟4中，通過蒸發(fā)用來從載體上切下肽的TFA溶劑，可從TFA中回收釋放的肽。
在本發(fā)明的第三個優(yōu)選方面的步驟5中，可使釋放的肽和試劑接觸，來封閉反應(yīng)性側(cè)鏈。合適的試劑包括上述的那些。
在本發(fā)明的第三個優(yōu)選方面的步驟6中，可任選的使肽和質(zhì)譜敏化劑反應(yīng)。見上述關(guān)于在本發(fā)明的第一和第二個優(yōu)選方面的步驟10的討論。
在本發(fā)明的第三個優(yōu)選方面的步驟7中，用質(zhì)譜分析肽。在一個實施例中，將肽包埋在固相載體上的MALDI基質(zhì)，如肉桂酸(cinammic acid)中，用MALDI質(zhì)譜儀分析，來確定C-末端肽群體的肽質(zhì)譜指紋。
在本發(fā)明的其它優(yōu)選方面中，可使用用質(zhì)譜分析肽的其它方法。因此在其它實施例中，可將回收的肽溶于合適的溶劑中，并用噴射輸入系統(tǒng)，如電子噴射離子化質(zhì)譜儀來分析?？刹捎妙愃频腇ast Atom Bombardment和相關(guān)的界面。這可能包括在質(zhì)譜分析前用相聯(lián)的液相層析分離。可將串聯(lián)質(zhì)譜和噴射界面或FAB界面相連接。串聯(lián)質(zhì)譜可確定一條肽的序列信息，并鑒定該蛋白質(zhì)的共價修飾。
實施例使用了一系列短計算機(jī)程序(用PERL寫)來分析蛋白質(zhì)序列的SWISSPROT公布的功能域數(shù)據(jù)庫，來確定一給定生物僅根據(jù)其末端肽質(zhì)量可能唯一地鑒定出哪部分蛋白質(zhì)。從SWISSPROT數(shù)據(jù)庫35版中抽出蛋白質(zhì)。對流感嗜血菌(H.influenzae)基因群的數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。該生物的基因群已被完全測序，并幾乎鑒定到了所有預(yù)計的開放閱讀框。在該數(shù)據(jù)庫版本中存在1882個流感嗜血菌蛋白質(zhì)。測試了用溴化氰切割甲硫氨酸和切割色氨酸的全貌。假設(shè)末端氨基酸不被分析蛋白全貌的化學(xué)試劑切下。
在全部實施例中，已假定質(zhì)譜儀具有5000的質(zhì)量分辨率。這意味著該儀器可分辨5000分之一的質(zhì)量差異，或換言之可分辨質(zhì)量為5000道爾頓的分子和質(zhì)量為4999道爾頓的分子。還假設(shè)各肽僅產(chǎn)生一個單分子峰。
實施例1-用Lys-C和SCN切割在本實施例中用內(nèi)切蛋白酶Lys-C(在賴氨酸殘基C-末端側(cè)切割蛋白質(zhì))切割1882流感嗜血菌蛋白質(zhì)。然后使肽和用苯基異硫氰酸酯基團(tuán)衍生的固相載體反應(yīng)，該基團(tuán)易于和上述切割位點處產(chǎn)生的以及存在于賴氨酸側(cè)鏈的伯胺反應(yīng)。所有肽至少有1個賴氨酸殘基，除了C-末端肽沒有。所有肽通過它們的N-末端伯胺被捕獲到固相載體上。也可通過賴氨酸側(cè)鏈捕獲所有非C-末端肽?？烧T導(dǎo)苯基異硫氰酸酯切割所有肽的N-末端殘基。攜帶賴氨酸殘基的所有肽將仍結(jié)合在載體上，因為這些異硫氰酸衍生物不被切割。因此從固相載體上釋放出C-末端肽。然后可分離C-末端肽。如需要，由于上述原因可進(jìn)一步修飾它們。分離了C-末端肽和其它側(cè)鏈修飾后，可用質(zhì)譜分析這些肽。
假定其它側(cè)鏈未被封閉，并直接分析未修飾的肽。
結(jié)果分析1882個蛋白質(zhì)的記錄7個蛋白質(zhì)不具所用試劑的切割位點。
1個蛋白質(zhì)具有870種肽質(zhì)量(870種質(zhì)量的末端肽)。
2個蛋白質(zhì)具有155種肽質(zhì)量。
3個蛋白質(zhì)具有43種肽質(zhì)量。
4個蛋白質(zhì)具有19種肽質(zhì)量。
5個蛋白質(zhì)具有6種肽質(zhì)量。
6個蛋白質(zhì)具有9種肽質(zhì)量。
7個蛋白質(zhì)具有2種肽質(zhì)量。
8個蛋白質(zhì)具有3種肽質(zhì)量。
9個蛋白質(zhì)具有1種肽質(zhì)量。
10個蛋白質(zhì)具有1種肽質(zhì)量。
11個蛋白質(zhì)具有2種肽質(zhì)量。
12個蛋白質(zhì)具有2種肽質(zhì)量。
13個蛋白質(zhì)具有1種肽質(zhì)量。
17個蛋白質(zhì)具有1種肽質(zhì)量。
19個蛋白質(zhì)具有1種肽質(zhì)量。
23個蛋白質(zhì)具有1種肽質(zhì)量。
33個蛋白質(zhì)具有1種肽質(zhì)量。
205個蛋白質(zhì)具有1種肽質(zhì)量。
該肽質(zhì)量指紋唯一的僅根據(jù)末端肽的質(zhì)量，鑒定了46.2％的蛋白質(zhì)。
實施例2-封閉羥基側(cè)鏈在該實施例中，用甲硅烷保護(hù)基團(tuán)封閉絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的攜帶反應(yīng)性羥基的側(cè)鏈，在這些側(cè)鏈上產(chǎn)生三甲基甲硅烷衍生物。用合適的試劑，如四苯基焦磷酸酯活化側(cè)鏈羧基，然后如上所述在堿存在的條件下與哌啶反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化成哌啶胺。
結(jié)果分析1882個蛋白質(zhì)的記錄7個蛋白質(zhì)不具所用試劑的切割位點。
1個蛋白質(zhì)具有937種肽質(zhì)量。
2個蛋白質(zhì)具有149種肽質(zhì)量。
3個蛋白質(zhì)具有34種肽質(zhì)量。
4個蛋白質(zhì)具有17種肽質(zhì)量。
5個蛋白質(zhì)具有6種肽質(zhì)量。
6個蛋白質(zhì)具有8種肽質(zhì)量。
7個蛋白質(zhì)具有2種肽質(zhì)量。
8個蛋白質(zhì)具有4種肽質(zhì)量。
10個蛋白質(zhì)具有2種肽質(zhì)量。
11個蛋白質(zhì)具有1種肽質(zhì)量。
12個蛋白質(zhì)具有1種肽質(zhì)量。
13個蛋白質(zhì)具有1種肽質(zhì)量。
17個蛋白質(zhì)具有1種肽質(zhì)量。
19個蛋白質(zhì)具有1種肽質(zhì)量。
23個蛋白質(zhì)具有1種肽質(zhì)量。
33個蛋白質(zhì)具有1種肽質(zhì)量。
205個蛋白質(zhì)具有1種肽質(zhì)量。
該肽質(zhì)量指紋唯一的僅根據(jù)末端肽的質(zhì)量鑒定了49.8％蛋白質(zhì)。
實施例3-C-末端捕獲和溴化氰切割。
在該實施例中，將1882個流感嗜血菌蛋白質(zhì)非共價固定在固相載體上。用三氟乙酸酐處理蛋白質(zhì)。該試劑將封閉賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的反應(yīng)性側(cè)鏈，產(chǎn)生三氟乙酸衍生物。該試劑還將活化側(cè)鏈和末端羧基。活化的C-末端羧基自發(fā)形成噁唑酮。洗去未反應(yīng)的三氟乙酸酐。然后在非水溶液堿的存在下使活化的側(cè)鏈和哌啶反應(yīng)，在活化的側(cè)鏈羧基處產(chǎn)生哌啶酰胺。接著水解C-末端噁唑酮，回復(fù)到原先的游離羧基，然后修飾該羧基，通過生物素化將其捕獲到固相載體上。接著用在甲硫氨酸殘基處切割的溴化氰切割該修飾的蛋白質(zhì)。將產(chǎn)生的肽洗入惰性溶劑中，進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)從固相載體上釋放。選擇性生物素化C-末端肽，使它們被親和素化的載體捕獲。這使非末端肽被洗去。接著從固相載體上釋放C-末端肽，并用質(zhì)譜分析。
結(jié)果分析1882個蛋白質(zhì)的記錄。
18個蛋白質(zhì)不具有所用試劑的切割位點。
1個蛋白質(zhì)具有1461種肽質(zhì)量。
2個蛋白質(zhì)具有157種肽質(zhì)量。
3個蛋白質(zhì)具有21種肽質(zhì)量。
4個蛋白質(zhì)具有4種肽質(zhì)量。
5個蛋白質(zhì)具有2種肽質(zhì)量。
6個蛋白質(zhì)具有3種肽質(zhì)量。
該肽質(zhì)量指紋唯一的菌根據(jù)末端肽的質(zhì)量鑒定了77.6％蛋白質(zhì)。
實施例4-C-末端捕獲和用BNPS-糞臭素切割在該實施例中，如實施例3那樣處理了1882個流感嗜血菌蛋白質(zhì)(除了修飾C-末端羧基后使其被固相載體捕獲)，用BNPS-糞臭素(3-溴-3-甲基-2-(o-硝基苯基磺酰基)假吲哚)而不是溴化氰在色氨酸殘基處化學(xué)切割蛋白質(zhì)。接著從固相載體上釋放出產(chǎn)生的肽，并和親和素化的載體一起培育。這可洗去非末端肽。然后從固相載體上釋放C-末端肽，并用質(zhì)譜分析。因此在這個實施例中，賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸的反應(yīng)性側(cè)鏈又是三氟乙酸衍生物，而側(cè)鏈羧基是哌啶酰胺衍生物。
結(jié)果分析1882個蛋白質(zhì)的記錄361個蛋白質(zhì)不具有所用試劑的切割位點。
1個蛋白質(zhì)具有1484種肽質(zhì)量。
2個蛋白質(zhì)具有163種肽質(zhì)量。
3個蛋白質(zhì)具有15種肽質(zhì)量。
7個蛋白質(zhì)具有1種肽質(zhì)量。
該肽質(zhì)量指紋唯一的僅基于末端肽的質(zhì)量鑒定了78.9％蛋白質(zhì)。
實施例5-組合兩種蛋白質(zhì)全貌組合了用溴化氰切割的實施例3和用BNPS-糞臭素切割的實施例4產(chǎn)生的獨特蛋白質(zhì)列表，唯一的僅根據(jù)兩種蛋白質(zhì)分布全貌的質(zhì)量，確定所鑒定的蛋白質(zhì)之和。
在兩種蛋白質(zhì)全貌間唯一的分辨了1774個蛋白質(zhì)。這個數(shù)量相當(dāng)于唯一的僅根據(jù)末端肽的質(zhì)量，分辨了SWISSPROT數(shù)據(jù)庫中94.3％的流感嗜血菌蛋白質(zhì)。這比較好的單一蛋白質(zhì)全貌分辨率，提高了19.5％。
權(quán)利要求
1.一種確定一種多肽或一群多肽的特征的方法，其特征在于，該方法包括(a)使含有一種或多種多肽的樣品和第一切割劑接觸，產(chǎn)生多肽片段；(b)分離一種或多種多肽片段，各片段含有片段化產(chǎn)生它的多肽的N-末端或C-末端；(c)用質(zhì)譜鑒定分離的片段；(d)用切割位點和第一種切割劑不同的第二種切割劑對樣品重復(fù)步驟(a)-(c)；和(e)確定步驟(c)和(d)鑒定的片段樣品中一種或多種多肽的特征。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(d)包括重復(fù)(a)-(c)兩次或多次，每次使用和前一種切割劑在不同位點切割的另一種切割劑。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步驟(a)前包括一封閉步驟，該封閉步驟包括使樣品中的多肽和一種或多種封閉劑反應(yīng)，在多肽的一個或多個反應(yīng)性側(cè)鏈上引入封閉基團(tuán)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，重復(fù)封閉步驟和步驟(a)-(c)一次、兩次或多次，每次在前一次封閉步驟相同的側(cè)鏈引入封閉基團(tuán)，但使用和前一次封閉步驟使用的對應(yīng)封閉基團(tuán)質(zhì)量不同的封閉基團(tuán)。
5.一種確定一種多肽或一群多肽的特征的方法，其特征在于，該方法包括(f)使含有一種或多種多肽的樣品與第一封閉劑在第一封閉步驟中接觸，以在該多肽的一條或多條反應(yīng)性側(cè)鏈上引入封閉基團(tuán)；(g)使樣品和切割劑接觸，產(chǎn)生多肽片段；(h)分離一種或多種多肽片段，每條片段含有片段化產(chǎn)生它的多肽的N-末端或C-末端；(j)用質(zhì)譜鑒定分離的片段；(k)在樣品上用第二封閉劑重復(fù)步驟(f)-(j)，該封閉劑在第一封閉步驟的同一側(cè)鏈上引入封閉基團(tuán)，但使用和第一封閉步驟使用的封閉基團(tuán)質(zhì)量不同的封閉基團(tuán)；和(l)確定步驟(j)和(k)鑒定的片段樣品中一種或多種多肽的特征。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，重復(fù)步驟(f)-(j)兩次或多次，每次在前一次封閉步驟的同一側(cè)鏈處引入封閉基團(tuán)，但使用和前一次封閉步驟使用的封閉基團(tuán)質(zhì)量不同的封閉基團(tuán)。
7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，步驟(k)包括重復(fù)步驟(f)-(j)一次、兩次或多次，每次使用和前一次切割劑在不同位點切割的另一種切割劑。
8.如權(quán)利要求3-7所述的方法，其特征在于，待封閉的側(cè)鏈包括下列一個或多個精氨酸的NH2側(cè)鏈；天冬酰胺的NH2側(cè)鏈；谷氨酰胺的NH2側(cè)鏈；賴氨酸的NH2側(cè)鏈；天冬氨酸的COOH側(cè)鏈；谷氨酸的COOH側(cè)鏈；絲氨酸的OH側(cè)鏈；蘇氨酸的OH側(cè)鏈；甲狀腺氨酸的OH側(cè)鏈；酪氨酸的OH側(cè)鏈；和半胱氨酸的SH側(cè)鏈。
9.如前述任何一項權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，通過將片段捕獲到固相載體，如DITC玻璃或聚苯乙烯異硫氰酸酯上來分離片段。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述捕獲涉及使片段和固相載體共價結(jié)合。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述片段通過其N-末端結(jié)合到固相上。
12.如前述任何一項權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，每條分離的片段含有該多肽片段化產(chǎn)生的C-末端。
13.如前述任何一項權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所用的切割劑包含內(nèi)切肽酶或化學(xué)切割劑。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所用的切割劑包括Lys-C內(nèi)肽酶，異硫氰酸化合物、溴化氰、BNPS-糞臭素、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和/或凝血酶。
15.如權(quán)利要求3-14任一項所述的方法，其特征在于，封閉劑含有一種或多種碘化乙酸化合物、異氰酸酯化合物、甲硅烷化合物、酸酐、乙烯基磺酸化合物和乙烯基吡啶衍生物。
16.一種確定組織中的一種或多種蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，其特征在于，該方法包括按照上述權(quán)利要求任一項所述的方法確定一群多肽的特征。
17.一種測試樣品中一種或多種特異性多肽的方法，其特征在于，該方法包括按照權(quán)利要求1-15任一項所述的方法確定一群多肽的特征，并從一種或多種對應(yīng)所述多肽的特異性片段的存在與否確定一種或多種特異性多肽的存在與否。
全文摘要
提供了一種確定一種多肽或一群多肽的特征的方法，該方法包括(a)使含有一種或多種多肽的樣品和第一切割劑接觸，產(chǎn)生多肽片段；(b)分離一種或多種多肽片段，各片段含有片段化產(chǎn)生它的多肽的N－末端或C－末端；(c)用質(zhì)譜鑒定分離的片段；(d)用切割位點和第一種切割劑不同的第二種切割劑對樣品重復(fù)步驟(a)－(c)；和(e)從步驟(c)和(d)鑒定的片段，確定樣品中一種或多種多肽的特征。
文檔編號G01N33/68GK1411555SQ9981250
公開日2003年4月16日 申請日期1999年10月1日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月1日
發(fā)明者G·施密特, A·H·湯普森 申請人:布拉克斯集團(tuán)有限公司